專利名稱：微生物發(fā)酵法生產(chǎn)香料苯乙醇的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程與技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種以煙草為原料通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)香料的工藝。
背景技術(shù)：
苯乙醇化學(xué)名稱為2-苯基乙醇或β-苯基乙醇，為無色粘稠液體，微溶于水，能與乙醇和油混溶。苯乙醇是香料用芳香化合物中最重要和使用最為廣泛的一種，因其具有柔和、愉快而持久的玫瑰香氣，因而在橙花、風(fēng)信子和丁香等多種花香型香精中大量使用。也可用于調(diào)配多種食用香精和煙用香精。苯乙醇存在于許多天然的精油中，目前主要是通過有機(jī)合成或從天然物中萃取獲得產(chǎn)品。
美國專利5919991(1999年)公開了一種發(fā)酵法生產(chǎn)苯乙醇的方法，由于該法中的苯乙醇是以苯丙氨酸為原料通過發(fā)酵來制取的，因而成本比較高，但仍不失為一種生產(chǎn)苯乙醇的方法。為此產(chǎn)業(yè)部門希望科技人員開發(fā)一種以廉價(jià)的天然原料為起點(diǎn)，通過微生物發(fā)酵直接生產(chǎn)苯乙醇的方法，可大大降低成本，以滿足香料工業(yè)的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以天然原料，如農(nóng)副產(chǎn)品煙草作為生物轉(zhuǎn)化的前體物，通過發(fā)酵來生產(chǎn)香料苯乙醇的工藝，不僅為農(nóng)副產(chǎn)品煙草的深加工開辟了一條工業(yè)途徑，而且為香料工業(yè)找到一種可靠的資源。
本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的發(fā)明人根據(jù)自己的實(shí)踐和工作經(jīng)驗(yàn)，以農(nóng)副產(chǎn)品煙草為原料經(jīng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)香料，為煙草找到一條綠色的發(fā)展途徑。目前煙草主要用于生產(chǎn)香煙，而吸煙有害健康，但長期以來人們所形成的嗜好一時(shí)尚不能擺脫，需要一個(gè)較長的過渡時(shí)期，特別是在煙草尚未找到新的應(yīng)用途徑之前，將直接影響煙農(nóng)的經(jīng)濟(jì)利益。在過渡時(shí)期，煙草工業(yè)有相當(dāng)多的殘次料—煙梗、煙末，亦可以作為原料，通過微生物發(fā)酵來生產(chǎn)香料?？傊景l(fā)明擬通過優(yōu)選發(fā)酵菌種和發(fā)酵工藝條件以農(nóng)副產(chǎn)品煙草為原料來制取苯乙醇，然后經(jīng)萃取或離子交換樹脂吸附來提取和濃縮生產(chǎn)香料苯乙醇，從而為煙草工業(yè)的發(fā)展找到了一條綠色的途徑。
本發(fā)明亦是這樣實(shí)現(xiàn)的發(fā)明人通過大量的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)如下微生物對煙草具有良好的發(fā)酵效果，可以將煙草中的木質(zhì)素、果膠和多酚類化合物降解、并轉(zhuǎn)化成苯乙醇等香料，所說的微生物可以是產(chǎn)朊假絲酵母(Candida units Lodder et Kueger)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、中國克魯維酵母(Kluyveromyce sinensis)中的一種，但以釀酒酵母為佳。
具體菌種來源如下產(chǎn)朊假絲酵母(Candida units Lodder et Kueger)1.東北科學(xué)研究所大連分所發(fā)現(xiàn)，中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏，保藏號(hào)為CGMCC，No2.120；2.中科院微生物所發(fā)現(xiàn)，中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏，保藏號(hào)為CGMCC，No2.1180；3.日本京都大學(xué)發(fā)現(xiàn)，中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏，保藏號(hào)為CGMCC，No2.1495。
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)1.中科院上海植生所發(fā)現(xiàn)，中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏，保藏號(hào)為CGMCC，No2.502；2.中科院微生物所發(fā)現(xiàn)，中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏，保藏號(hào)為CGMCC，No2.742；3.中科院微生物所發(fā)現(xiàn)，中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏，保藏號(hào)為CGMCC，No2.1419。
中國克魯維酵母(Kluyveromyce sinensis)1.中科院微生物所發(fā)現(xiàn)，中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏，保藏號(hào)為CGMCC，No2.1535。
具體的發(fā)酵工藝和產(chǎn)品的提取方法描述如下1、發(fā)酵工藝種子培養(yǎng)利用上述菌種中的任一種，采用常規(guī)的酵母液體好氧發(fā)酵法培養(yǎng)，即以糖類物資為碳源(所說的糖類物質(zhì)可以是葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉中的一種或一種以上)，以蛋白胨、酪蛋白或酵母膏為氮源，并加入適量的無機(jī)鹽和微量元素，用去離子水調(diào)配成溶液作為種子培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)得到液體酵母菌種，待用。由于酵母菌種的培養(yǎng)過程系常規(guī)的方法，故敘述從簡。
煙草的發(fā)酵培養(yǎng)工藝發(fā)酵培養(yǎng)基的組成以粉碎的煙草為原料(包含目前煙草工業(yè)留下的殘次料煙梗和煙末)，由于煙草本身是一個(gè)良好的氮源，同時(shí)還含有5～20％的淀粉和還原糖，所以煙草亦是一個(gè)良好的碳源，再添加適量的糖類物質(zhì)以及適量的無機(jī)鹽與微量元素和去離子水，置于發(fā)酵罐中，組成一個(gè)培養(yǎng)基漿液，先用草酸或草酸鹽調(diào)節(jié)漿液的PH＝7.0，然后將漿液在15psig、116～121℃下，滅菌15～20分鐘，冷卻至≤30℃后再將上述的液體酵母菌種接入到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5％～10％(V/V)，在30℃有氧條件下攪拌發(fā)酵24～72小時(shí)，其中無菌空氣的通入量為每升培養(yǎng)基漿液1.0～1.5L/min，發(fā)酵結(jié)束后或發(fā)酵過程中取樣，用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀(簡稱GC-MS儀)檢測發(fā)酵液中苯乙醇的含量，來評定發(fā)酵過程的技術(shù)效果。
其中所說的粉碎的煙草是將煙草粉碎至20～40篩孔，加入量50～60g/L；所說的適量的糖類物質(zhì)是葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉中的一種或一種以上，加入量為20～30g/L；所說的無機(jī)鹽包括FeSO4、MgSO4、KCl、CaCl2、KH2PO4諸種化合物，加入量分別為0.1～0.5g/L；其余為去離子水；所說微量元素則隨無機(jī)鹽和煙草的加入而帶入，不必另外補(bǔ)加。
發(fā)酵培養(yǎng)基中加入糖類碳源的目的是為了促進(jìn)酵母菌在接種后迅速擴(kuò)增，用稀釋平板法測定每毫升培養(yǎng)基漿液中酵母菌至少達(dá)2.0×108個(gè)，之后酵母菌就利用煙草中的碳源和氮源進(jìn)行生長，即通過酵母菌的發(fā)酵培養(yǎng)，降解了煙草中的木質(zhì)素、果膠和多酚類化合物，并轉(zhuǎn)化成苯乙醇等物質(zhì)，從而獲得富含有苯乙醇的發(fā)酵液。
煙草的發(fā)酵工藝是發(fā)酵法生產(chǎn)苯乙醇的核心，經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)后，本發(fā)明優(yōu)先推薦如下發(fā)酵工藝培養(yǎng)基組成粉碎煙草50g/L；葡萄糖20g/L；無機(jī)鹽FeSO40.5g/L，MgSO40.5g/L，KCl 0.1g/L，CaCl20.1g/L，KH2PO40.125g/L；其余為去離子水，置于發(fā)酵罐中，在攪拌下構(gòu)成均一的培養(yǎng)基漿液。用草酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基漿液PH＝7.0，然后在15psig、121℃下滅菌15分鐘得到無菌培養(yǎng)基漿液待用。
將上述滅菌后的培養(yǎng)基漿液冷卻至≤30℃后，接入液體酵母菌種，接種量為10％(V/V)，在30℃有氧條件下發(fā)酵48小時(shí)，其中無菌空氣通入量為每升培養(yǎng)基漿液1.5L/min，攪拌轉(zhuǎn)速為80～150r/min。所用的酵母菌可以是產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母、中國克魯維酵母中的任一種，但以釀酒酵母為佳。發(fā)酵結(jié)束后取樣用GC-MS儀檢測發(fā)酵液中苯乙醇的含量可達(dá)50ml/L以上。
2、發(fā)酵液的予處理將上述所得含有苯乙醇的發(fā)酵液先用草酸調(diào)節(jié)PH＝5～6.5，然后加入少量的助濾劑，攪拌混勻后放罐過濾除去固體雜質(zhì)(包括菌絲體和其它不溶物)，得到發(fā)酵上清液和濾餅。其中所說的助濾劑是粉狀的硅藻土、珠光石、碳酸鈣或紙漿中的一種，其加入量為0.5～2％(重量百分比)。用草酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的PH＝5～6.5的目的在于防止酵母菌絲體在堿性或中性條件下的自溶以及促使蛋白類物質(zhì)的沉淀，以保持發(fā)酵液的品質(zhì)。加入助濾劑的目的在于提高發(fā)酵液的過濾特性，使它可以方便地通過一般的真空過濾器進(jìn)行過濾，避免使用高速離心過濾，有利于工業(yè)化推廣應(yīng)用。
3、所得濾餅的處理由于發(fā)酵液過濾所得濾餅中往往夾帶有10％左右發(fā)酵產(chǎn)物，其處理方法有二。其一用溶劑浸取回收濾餅中夾帶的苯乙醇，所得回收液供下一步作萃取劑使用，所說的溶劑是正己烷、環(huán)己烷、氯仿、四氯化碳、苯、甲苯、二甲苯、石油醚中的一種，它們亦是從發(fā)酵上清液中萃取苯乙醇的萃取劑，其用量與發(fā)酵上清液量相當(dāng)，即溶劑/發(fā)酵上清液＝1(體積比)，由于溶劑的用量相對濾餅來說是大量的，因此濾餅中的苯乙醇的回收率可高達(dá)98％以上；其二用95％工業(yè)酒精或甲醇作洗滌劑，以洗滌回收濾餅中的苯乙醇，洗滌劑用量0.5～1.0L/kg濾餅，所得洗滌液與發(fā)酵上清液合并后供下步處理，苯乙醇洗滌回收率可達(dá)85％左右。
4、從發(fā)酵上清液中提取苯乙醇從發(fā)酵上清液中提取苯乙醇的方法有二。其一，用液—液萃取法提取苯乙醇，萃取時(shí)的工藝條件為以萃取劑為有機(jī)相(即上述濾餅浸取時(shí)所用的溶劑，其中含有回收的苯乙醇)，發(fā)酵上清液為水相，有機(jī)相/水相＝1(體積比)，萃取溫度5～40℃，水相的PH＝5～6.5，鹽析劑的濃度為0.5～2％(重量百分比)，一級(jí)萃取率達(dá)95％左右，將萃取分離所得的負(fù)載有機(jī)相(萃取液)經(jīng)減壓蒸餾，得苯乙醇產(chǎn)品。其中所說得萃取劑是正己烷，環(huán)己烷，氯仿，四氯化碳，苯，甲苯，二甲苯，石油醚中的一種，所說的鹽析劑是氯化鈉，氯化鉀，硫酸銨中的一種，但以硫酸銨為佳，因使用硫酸銨時(shí)不僅可以用量較少，而且萃余液還可以作為肥料加以利用，萃取液在減壓蒸餾獲得苯乙醇產(chǎn)品的同時(shí)，可回收溶劑，供循環(huán)使用。其二，用離子交換樹脂吸附法提取苯乙醇，其工藝條件包括，首先將發(fā)酵上清液(包括合并入的洗滌液)減壓蒸發(fā)濃縮至1/20～1/30(體積比)，得到發(fā)酵濃縮液，然后將發(fā)酵濃縮液注入經(jīng)活化處理(系常規(guī)方法處理故敘述從略)的離子交換樹脂柱中(進(jìn)行選擇性吸附分離)，先用去離子水洗脫，洗脫液連上核酸蛋白檢測儀(280nm)和分部收集器，洗脫至無峰為止，再用70％醇溶液洗脫，直至無峰為至，洗脫液的流速為5～10ml/min。收集去離子水洗脫所得的洗脫液用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀(簡稱GC-MS儀下同)檢測分析，其中不含苯乙醇，而用70％醇溶液洗脫所得的洗脫液出現(xiàn)一個(gè)唯一的分離強(qiáng)峰，經(jīng)GC-MS儀檢測其主要成分為苯乙醇?？梢娪秒x子交換樹脂吸附分離純化苯乙醇亦是一個(gè)良好可行的方法。最后將用70％醇溶液洗脫的洗脫液集中后，經(jīng)減壓蒸餾得到苯乙醇產(chǎn)品。所說的離子交換樹脂經(jīng)優(yōu)選本發(fā)明推薦以牌號(hào)JK-108為佳，所說的70％醇溶液是指70％的乙醇或70％的甲醇溶液。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容實(shí)施例1采用產(chǎn)朊假絲酵母進(jìn)行煙草的液體有氧發(fā)酵，具體發(fā)酵工藝如下種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基的組成為蛋白胨2％(重量百分比，下同)，酵母膏1％，葡萄糖2％，無機(jī)鹽FeSO4、KH2PO4、KCl、MgSO4、CaCl2均為0.1％，置于200毫升的培養(yǎng)瓶中，用蒸餾水補(bǔ)加至100毫升，用草酸或草酸鹽調(diào)節(jié)溶液的PH＝6.0，滅菌后(冷卻至室溫)加入產(chǎn)朊假絲酵母菌株，按常規(guī)方法進(jìn)行種子培養(yǎng)，獲得液體產(chǎn)朊假絲酵母菌種(簡稱液體酵母菌種)，待用。
煙草的搖瓶發(fā)酵搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)基配方如下取粉碎至20-40篩孔煙草(或者是煙梗，煙末)50g/L，葡萄糖(或者是其它糖類物質(zhì)中的任一種)20g/L，無機(jī)鹽FeSO40.5g/L、KH2PO40.125g/L、KCl 0.1g/L、MgSO40.5g/L、CaCl20.1g/L，置于2L的發(fā)酵瓶中，用去離子水補(bǔ)加至1L，用草酸或草酸鹽調(diào)PH＝7.0，構(gòu)成一培養(yǎng)基漿液，然后將此培養(yǎng)基在15psig、116～121℃下滅菌15分鐘左右，冷卻至≤30℃，接入液體酵母菌種，接種量為5～10％(V/V)，發(fā)酵溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為220r/min，發(fā)酵時(shí)間為24-72小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后，取樣用GC-MS儀測定發(fā)酵液中苯乙醇的含量，結(jié)果如表1所示。其中所說的草酸鹽是草酸鈉或草酸鉀，所說發(fā)酵溫度30℃系酵母菌最適宜的生長溫度，已為實(shí)踐所證明。
由表1可見，優(yōu)選的發(fā)酵條件為
接種量以10％(V/V)為佳，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時(shí)間以48小時(shí)為宜(增加發(fā)酵時(shí)間可以少量增加目標(biāo)產(chǎn)物的含量，但部分酵母菌絲體的自溶使發(fā)酵液品質(zhì)變差，不利于后續(xù)分離，權(quán)衡利弊得失還是以48小時(shí)為宜)，此時(shí)發(fā)酵液中苯乙醇的含量可達(dá)44ml/L。
實(shí)施例2除了采用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，為菌種外。其余工藝條件均同實(shí)施例1。發(fā)酵結(jié)束后，取樣用GC-MS儀測定發(fā)酵液中苯乙醇的含量，結(jié)果如表2所示。
由表2同樣可見優(yōu)選的發(fā)酵條件為接種量以10％(V/V)為佳，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時(shí)間以48小時(shí)為宜，此時(shí)發(fā)酵液中苯乙醇的含量可達(dá)50ml/L。
實(shí)施例3除了采用中國克魯維酵母作菌種外，其余工藝條件均同實(shí)施例1。
發(fā)酵結(jié)束后，取樣用GC-MS儀測定發(fā)酵液中苯乙醇的含量，結(jié)果如表3所示。
由表3可見，適宜的發(fā)酵條件為接種量的10％(V/V)為佳，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時(shí)間以48小時(shí)為宜，此時(shí)發(fā)酵液中苯乙醇的含量可達(dá)46ml/L。
由實(shí)施例1～3可見在同樣的條件下，采用釀酒酵母作菌種時(shí)，可獲得更好的技術(shù)效果。為此下面就以釀酒酵母為菌種進(jìn)行放大試驗(yàn)以進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容。
實(shí)施例4放大試驗(yàn)在一5L的發(fā)酵罐中，以釀酒酵母為菌種，其種子的培養(yǎng)方法，發(fā)酵培養(yǎng)的配比，以及發(fā)酵培養(yǎng)基漿液的滅菌條件等均同實(shí)施例1，放罐體積為3L，發(fā)酵條件為接種是10％(V/V)，發(fā)酵溫度30℃，無菌空氣的流量為3～4.5L/min，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min，發(fā)酵時(shí)間為48小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后，取樣用GC-MS儀檢測發(fā)酵液中苯乙醇的含量為50ml/L，用草酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的PH＝5～6.5，同時(shí)加入助濾劑0.5～2.0％(重量百分比)，即15～60g，所說的助濾劑是粉狀的硅藻土、珠光石、碳酸鈣或紙漿中的一種，攪拌混勻后，放罐過濾，可得發(fā)酵上清液和濾餅兩部分，其中發(fā)酵上清液為3L，苯乙醇的單位含量為45ml/L，總量為135ml。濾餅中夾帶苯乙醇的含量為15ml。當(dāng)用萃取法提取苯乙醇時(shí)，濾餅用3L有機(jī)溶劑浸取，回收其中所夾帶的苯乙醇，回收率為98％以上，經(jīng)再次過濾后得到3L浸出液a(含苯乙醇的有機(jī)溶劑)，待用。所說有機(jī)溶劑是正己烷或環(huán)己烷。
發(fā)酵上清液用萃取法提取苯乙醇，其萃取工藝條件為萃取劑(即上面所述的有機(jī)溶劑浸出液a)簡稱有機(jī)相O，發(fā)酵上清液簡稱水相A，(下同)。有機(jī)相O/水相A＝1(體積比)，萃取溫度25～30℃，水相中的PH＝6.5，鹽析劑的濃度為2％(重量百分比)，所說鹽析劑為氯化鈉或氯化鉀，一級(jí)萃取率為95％，萃取相(即負(fù)載的有機(jī)相)中苯乙醇的單位含量為47.7ml/L，總量為143.1ml，通過減壓分餾后，可得苯乙醇產(chǎn)品135ml，總回收率可達(dá)90％(以發(fā)酵液中苯乙醇總含量為基準(zhǔn)時(shí))。有機(jī)相經(jīng)回收后循環(huán)使用。
實(shí)施例5按照實(shí)施4相同的條件進(jìn)行，獲得發(fā)酵上清液和濾餅。其中發(fā)酵清液中苯乙醇的含量同樣為45ml/L，總量為135ml；濾餅中苯乙醇夾帶量為16ml。濾餅用3L四氯化碳(或氯仿)浸取回收苯乙醇，回收率為95％，經(jīng)過濾得到3L浸出液b，其中苯乙醇總含量為15.2ml，所得浸出液b供下面作萃取劑使用。
用萃取法從發(fā)酵上清液提純苯乙醇，其萃取時(shí)的工藝條件為萃取劑(有機(jī)相)為上面所述的浸出液b，有機(jī)相/水相＝1(體積比)，萃取溫度40℃，水相中的PH＝5.0，鹽析劑硫酸銨的濃度為0.5％(重量百分比)，經(jīng)一級(jí)萃取，萃取率為94％，有機(jī)相中苯乙醇的單位含量為47.3ml/L，總量為142ml，經(jīng)減壓分餾后可得苯乙醇132ml，總回收率可達(dá)88％(以發(fā)酵液中苯乙醇總含量為基準(zhǔn))，回收后的有機(jī)相供循環(huán)使用。
實(shí)施例6按實(shí)施例4相同的條件進(jìn)行，獲得發(fā)酵上清液和濾餅。其中發(fā)酵上清液體積為3L，苯乙醇的單位含量為45.2ml/L，總量為135.6ml，濾餅中苯乙醇的含量為13.4ml，濾餅用3L二甲苯(或苯，甲苯)浸取回收苯乙醇，回收率可達(dá)96％，經(jīng)過濾得3L浸出液c，其中苯乙醇的總含量為12.9ml，所得浸出液c供下面作萃取劑使用。
萃取法從發(fā)酵上清液中提純苯乙醇，其萃取時(shí)的工藝條件為萃取劑(有機(jī)相)為上面所述的浸出液c，相比有機(jī)相/水相＝1(體積比)，萃取溫度15℃，水相中的PH＝6.0，鹽析劑硫酸銨的濃度為1％(重量百分比)，經(jīng)一級(jí)萃取，萃取率為96％，有機(jī)相中苯乙醇的單位含量為47.7ml/L，總含量為143ml。經(jīng)減壓分餾后，可得苯乙醇134ml，總回收率可達(dá)89.3％(以發(fā)酵液中苯乙醇總含量為基準(zhǔn))，回收的溶劑供循環(huán)使用。
實(shí)施例7按實(shí)施例4相同的工藝進(jìn)行發(fā)酵，獲得發(fā)酵上清液和濾液，其中發(fā)酵上清液體積為3L，苯乙醇的單位含量為44.8ml/L，總含量為134.4ml；濾餅中苯乙醇含量為15.6ml。
濾餅用石油醚浸取回收其中夾帶的苯乙醇，回收率為98％，經(jīng)過濾得3L浸出液d，其中苯乙醇的總含量為15.3ml，所得浸出液d供下面作萃取劑使用。
用萃取法從發(fā)酵上清液中提純苯乙醇，其萃取時(shí)的工藝條件為萃取劑(有機(jī)相)為上述所說的浸出液d，相比有機(jī)相/水相＝1(體積比)，萃取溫度5℃，水相中的PH＝5.5，鹽析劑硫酸銨的濃度為1.5％(重量百分比)，經(jīng)一級(jí)萃取，萃取率為95％，有機(jī)相中苯乙醇單位含量為47.7ml/L，總含量為143ml，經(jīng)減壓分餾后，可得苯乙醇產(chǎn)品135ml，總回收率達(dá)90％(以發(fā)酵液中苯乙醇的總含量為基準(zhǔn))?；厥盏氖兔压┭h(huán)使用。
實(shí)施例8按實(shí)施例4相同的條件進(jìn)行發(fā)酵，獲得發(fā)酵上清液和濾餅，其中發(fā)酵上清液的體積為3L，苯乙醇的總含量為135ml，濾餅中苯乙醇總含量為15ml。濾餅用95％工業(yè)酒精或甲醇0.3L洗滌回收其中夾帶的苯乙醇，回收率可達(dá)85％以上，即洗滌液中含有12.8ml以上的苯乙醇。將所得0.3L洗滌液與發(fā)酵上清液合并后減壓蒸發(fā)濃縮(見下述)。
采用離子交換樹脂吸附法處理發(fā)酵液上清液先將JK.108離子交換樹脂裝入一根Φ3cm×50cm的層析柱中，按常規(guī)的方法處理活化后待用；然后將發(fā)酵上清液(含合并入的洗滌液)減壓蒸餾濃縮至1/30，即將3.3L發(fā)酵上清液和洗滌液濃縮得到發(fā)酵濃縮液110ml，注入前述的層析柱中，實(shí)現(xiàn)吸附分離過程先用去離子水洗脫，洗脫液連上核酸蛋白檢測儀(280nm)和分部收集器，洗脫至無峰時(shí)，再用70％乙醇(或70％甲醇)溶液洗脫，洗脫至無峰為止。用去離子水洗脫所得洗脫液，用GC-MS儀檢測，其中不含有苯乙醇；用70％乙醇(或70％甲醇)洗脫所得的洗脫液有一個(gè)唯一的分離強(qiáng)峰，用GC-MS儀檢測，其成分為苯乙醇，將收集的70％乙醇(或70％甲醇)洗脫液經(jīng)減壓蒸餾后，可得苯乙醇產(chǎn)品130ml，總收率為88％(以發(fā)酵液中苯乙醇總含量為基準(zhǔn))。
總之，由實(shí)施例4～8可見不管是萃取法，還是離子交換樹脂吸附法，都是從發(fā)酵液中分離純化苯乙醇的良好方法，可滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。
表1菌種為產(chǎn)朊假絲酵母時(shí)的發(fā)酵結(jié)果

*增加發(fā)酵時(shí)間，可以提高目標(biāo)產(chǎn)物的含量，但在PH＝7的條件下長時(shí)間發(fā)酵不可避免地發(fā)生少量酵母菌絲體的自溶，影響發(fā)酵液的品質(zhì)，增強(qiáng)后續(xù)處理的困難，因此綜合評價(jià)發(fā)酵效果后，推薦發(fā)酵時(shí)間以48小時(shí)為宜。
表2菌種為釀酒酵母時(shí)的發(fā)酵結(jié)果

表3菌種為中國克魯維酵母時(shí)的發(fā)酵結(jié)果

權(quán)利要求
1.一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)香料苯乙醇的工藝，其特征在于所說的工藝主要包括如下步驟(1)以粉碎的煙草為原料，以酵母為菌種，添加適量的其它培養(yǎng)基，在30℃下進(jìn)行液體有氧發(fā)酵，使煙草中的木質(zhì)素、果膠和多酚類化合物降解，轉(zhuǎn)化成苯乙醇，獲得含苯乙醇的發(fā)酵液；(2)將上述發(fā)酵液先進(jìn)行酸化處理，用草酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的PH＝5～6.5，然后在攪拌下加入0.5～2.0％(重量百分比)的助濾劑，混勻后放罐過濾，得到發(fā)酵上清液和濾餅；(3)當(dāng)用萃取法從發(fā)酵上清液中提取苯乙醇時(shí)，上述濾餅用溶劑浸取回收濾餅中夾帶的苯乙醇，所得回收液供下一步作萃取劑使用；當(dāng)用離子交換樹脂吸附法從發(fā)酵濃縮液中分離苯乙醇時(shí)，上述濾餅用95％的工業(yè)酒精或甲醇進(jìn)行洗滌回收濾餅中夾帶的苯乙醇，所得洗滌液與發(fā)酵上清液合并進(jìn)行后續(xù)的減壓蒸發(fā)濃縮處理；(4)將上述所得發(fā)酵上清液用溶劑萃取法提取苯乙醇，得到萃取液；或者將發(fā)酵上清液(包含并入的洗滌液)先進(jìn)行減壓蒸發(fā)濃縮，得到發(fā)酵濃縮液，然后用離子交換樹脂吸附法洗脫分離苯乙醇，得到洗脫液，將所得的萃取液或洗脫液分別進(jìn)行減壓蒸發(fā)，得到苯乙醇產(chǎn)品；其中步驟(1)為發(fā)酵法生產(chǎn)苯乙醇工藝的核心，所說的粉碎的煙草(包括煙草工業(yè)的殘次料煙梗、煙末)是指將煙草粉碎粒度20～40篩孔，其加入量為50～60g/L；所說的酵母是產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母、中國克魯維酵母中的一種，其種子的培養(yǎng)過程按常規(guī)液體好氧法培養(yǎng)得到液體酵母菌種；所說適當(dāng)?shù)钠渌囵B(yǎng)基是指加入糖類物質(zhì)、無機(jī)鹽和微量元素以及去離子水，所說的糖類物質(zhì)是葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉中的一種，加入量為20～30g/L，所說的無機(jī)鹽包括FeSO4、MgSO4、KCl、CaCl2、KH2PO4諸類化合物，加入量分別為0.1～0.5g/L，其余為去離子水，置于發(fā)酵罐中，攪拌混勻成—培養(yǎng)基漿液；將培養(yǎng)基漿液先用草酸或草酸鹽調(diào)節(jié)其PH＝7.0，然后在15psig、116～121℃下滅菌15～20分鐘，冷卻至≤30℃后，接入液體酵母菌種，接種量為5％～10％(V/V)，在30℃有氧條件下攪拌發(fā)酵24～72小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后取樣用GC-MS儀檢測發(fā)酵液中苯乙醇的含量，其中所說的草酸鹽是草酸鈉或草酸鉀，所說的有氧條件是指通入無菌空氣，通入量為每升培養(yǎng)基漿液1.0～1.5L/min。
2.如權(quán)力要求書1所述的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)香料苯乙醇的工藝，其特征在于其中步驟(1)的所說的發(fā)酵工藝條件為培養(yǎng)基組成宜為含粉碎煙草50g/L、葡萄糖20g/L、無機(jī)鹽包括FeSO40.5g/L、MgSO40.5g/L、KCl 0.1g/L、CaCl20.1g/L、KH2PO40.125g/L，其余為去離子水，置于發(fā)酵罐中，在攪拌下構(gòu)成均一的培養(yǎng)基漿液，用草酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基漿液的PH＝7.0，然后在15psig、121℃下滅菌15分鐘得到無菌培養(yǎng)基漿液，冷卻至≤30℃后接入液體酵母菌種，接種量為10％(V/V)，在30℃有氧條件下發(fā)酵48小時(shí)，其中無菌空氣通入量為每升培養(yǎng)基1.5L/min，攪拌轉(zhuǎn)速為80～150r/min，所用的酵母菌是釀酒酵母，發(fā)酵結(jié)束后取樣用GC-MS儀檢測發(fā)酵液中苯乙醇的含量達(dá)50ml/L以上。
3.如權(quán)利要求1所述的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)香料苯乙醇的工藝，其特征在于其中步驟(2)所說的助濾劑是粉狀的硅藻土、珠光石、碳酸鈣或紙漿中的一種。
4.如權(quán)利要求1所述的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)香料苯乙醇的工藝，其特征在于其步驟(3)所說的浸取時(shí)的溶劑是正己烷、環(huán)己烷、氯仿、四氯化碳、苯、甲苯、二甲苯、石油醚中的一種，其用量與發(fā)酵上清液等體積；所說洗滌劑95％工業(yè)酒精或甲醇的用量為0.5～1.0L/kg濾餅。
5.如權(quán)利要求1所述的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)香料苯乙醇的工藝，其特征在于其中步驟(4)所說的溶劑萃取法從發(fā)酵上清液中提取苯乙醇的工藝條件有機(jī)相/水相＝1(體積比)，萃取溫度5～40℃，水相中的PH＝5～6.5，鹽析劑的濃度為0.5～2.0％(重量的比)，一級(jí)萃取率達(dá)95％左右，然后將萃取分離所得的萃取液經(jīng)減壓蒸溜得苯乙醇產(chǎn)品；其中所說的溶劑(萃取劑)為步驟(3)的浸取回收液，是正己烷、環(huán)己烷、氯仿、四氯化碳、苯、甲苯、二甲苯、石油醚中的一種，所說的鹽析劑是硫酸銨、硫化鈉、氯化鉀中的一種，以硫酸銨為佳。
6.如權(quán)利要求1所述的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)香料苯乙醇的工藝，其特征在于其中步驟(4)所說的離子交換樹脂吸附法洗脫分離苯乙醇的工藝包括首先將發(fā)酵上清液(含合并入的洗滌液)減壓蒸發(fā)至1/20～1/30(體積比)，得到發(fā)酵濃縮液，然后將發(fā)酵濃縮液注入經(jīng)活化處理的離子交換樹脂柱中，進(jìn)行選擇性吸附分離，之后先用去離子水洗脫，洗脫液連上核酸蛋白檢測儀(280nm)和分部收集器，洗脫至無峰為止，再用70％乙醇或70％甲醇溶液洗脫，洗脫至無峰時(shí)為至，洗脫液的流速為5～10ml/min；收集用去離子水洗脫所得洗脫液用GC-MS儀檢測分析，其中不含苯乙醇，而用70％乙醇或70％甲醇溶液洗脫所得洗脫液，出現(xiàn)一個(gè)唯一的分離強(qiáng)峰，經(jīng)GC-MS儀檢測，其成分為苯乙醇；將收集的用70％乙醇或70％甲醇洗脫的洗脫液集中后，經(jīng)減壓蒸溜得到苯乙醇產(chǎn)品；其中所說的離子交換樹脂以牌號(hào)JK-108為佳。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以煙草(含煙梗、煙末)為原料，通過微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)香料苯乙醇的工藝。該工藝包括利用農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物煙草作為生物轉(zhuǎn)化的前體物，添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基、選用合適的菌種(如產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母、中國克魯維酵母中的一種)，在一定的發(fā)酵工藝條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，降解了煙草中的木質(zhì)素、果膠和多酚類化合物，并轉(zhuǎn)化成苯乙醇，然后用萃取或離子交換樹脂吸附分離的方法予以提純。所得到的苯乙醇具有純正的天然香味，可用于食品中作為天然香料使用。整個(gè)生產(chǎn)工藝簡便，具有廣泛的工業(yè)化發(fā)展前景，為農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物煙草找到了一條綠色的應(yīng)用途徑。
文檔編號(hào)C12P7/22GK1403581SQ0213757
公開日2003年3月19日 申請日期2002年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月22日
發(fā)明者涂茂兵, 盧國藩, 張彥東, 李軍 申請人:華寶香化科技發(fā)展(上海)有限公司