大腸桿菌錳氧化工程菌及在環(huán)境激素降解中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及應(yīng)用微生物技術(shù)領(lǐng)域及環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域，具體涉及一種大腸桿菌錳氧化 工程菌，還涉及該基因工程菌在環(huán)境激素降解中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 許多種微生物都能快速氧化Μη(II)成錳氧化物，生物錳氧化物較化學(xué)合成氧化 錳礦物結(jié)晶弱，粒徑小，價(jià)態(tài)高，結(jié)構(gòu)中八面體空穴多，比表面積大，具有比化學(xué)合成錳氧化 物更強(qiáng)的吸附氧化和光還原溶解特性，生物錳氧化物能吸附多種重金屬，氧化低價(jià)態(tài)重金 屬離子，并降解乙炔基雌二醇等有機(jī)污染物，是具有廣泛應(yīng)用前景的環(huán)境材料。
[0003]CotA蛋白廣泛存在在多種芽胞桿菌中，其與多銅氧化酶具有許多相似之處，多銅 氧化酶家族包含抗壞血酸氧化酶、血漿銅藍(lán)蛋白、漆酶、錳氧化酶和其他酶類。漆酶是能夠 氧化多種酚類、二胺類的多酚氧化酶類，不同的漆酶底物專一性不同，細(xì)菌漆酶具有耐熱性 的特點(diǎn)，并且在中性和堿性條件下都具有活性。而真菌漆酶通常在酸性條件下具有活性。
[0004] 內(nèi)分泌干擾物（endocrinedisruptingchemicals,EDCs)是指能夠干擾生物或 人體內(nèi)天然激素的合成分泌運(yùn)輸結(jié)合反應(yīng)和代謝等，從而影響生物或人的生殖神經(jīng)免疫 等功能的外源性化學(xué)物質(zhì)，rocs毒理學(xué)關(guān)注閾值低，健康危害大，在污水廠進(jìn)出水、地表 水甚至飲用水中均有報(bào)道檢出，近年來(lái)引起廣泛關(guān)注。雙酚A(bisphen〇l，BPA)，炔雌醇 (17a-Ethinylestradiol，EE2)和壬基酌 (4-n-nonylphenol，NP)被認(rèn)為是中國(guó)污水處 理廠二級(jí)出水中生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)高應(yīng)優(yōu)先控制的m)cs。
[0005] 壬基酚分子式為C9H19C6H40H，相對(duì)分子量為220。NP是憎水性物質(zhì)，在水中溶解度 為5. 43mg/L，環(huán)境中的壬基酚是壬基酚聚氧乙烯醚（NPnEO)分解或降解產(chǎn)生的，NPnEO進(jìn)入 環(huán)境后在生物作用下，逐步降解形成短鏈產(chǎn)物NP2E0、NP1E0和最穩(wěn)定的產(chǎn)物NP。
[0006] NP具有親油性，這造成了它比較容易吸附于水體底部的淤泥上并被浮游生物攝 取，在生物體內(nèi)積累，并通過食物鏈的循環(huán)進(jìn)入人體。其在人體內(nèi)具有雌激素效應(yīng)和其他 的生物毒性，對(duì)生物體產(chǎn)生的不良作用包括影響內(nèi)分泌、影響生殖和發(fā)育、影響免疫及促癌 作用等。
[0007] 在NP的生物降解性方面，Staples等對(duì)NP的降解進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的研究結(jié)果證 明，即使是在有氧情況下NP也比NPnEO難于降解，NP結(jié)構(gòu)上的苯環(huán)和它的長(zhǎng)鏈烷基造成了 NP的難降解性，但NP苯環(huán)上的烷基和羥基，是活化苯環(huán)的給電子基團(tuán)，微生物降解NP的可 能途徑是苯酚途徑的苯環(huán)開環(huán)和烷基苯途徑的壬烷基斷鏈，但關(guān)于NP的降解途徑與機(jī)制 目前沒有定論。
[0008] 雙酚A是合成聚碳酸酯、環(huán)氧樹脂及聚砜等的重要原料，分子式為C15H1602，分子量 為228,不溶于水，主要用于有機(jī)合成生產(chǎn)各種高分子材料，是一種人工合成的化學(xué)物質(zhì)，在 自然界中原本不存在，由于現(xiàn)代社會(huì)化工產(chǎn)品的廣泛應(yīng)用，各種家居用品及醫(yī)藥用品中均 能發(fā)現(xiàn)BPA的存在。
[0009]BPA具有雌激素活性，能干擾人體內(nèi)正常激素的分泌，從而影響生殖功能，同時(shí)對(duì) 脊椎動(dòng)物及哺乳類動(dòng)物均有較嚴(yán)重的負(fù)面效應(yīng)。目前降解BPA的方法包括吸附法，生物 法，電化學(xué)法和光催化氧化法，其中生物法應(yīng)用最廣泛，產(chǎn)生的副作用最小。Spivak、Lobus 等用純的BPA降解菌進(jìn)行試驗(yàn)，揭示了BPA可能的降解途徑，85 %的BPA經(jīng)由2, 2-二 (4-羥苯基）-2-丙醇，轉(zhuǎn)化為4, 4-二羥基-A-甲基苯乙烯，再轉(zhuǎn)化為4-羥基苯甲酸 +0)2+〇611+6仰11也，15%的8?厶經(jīng)由2,2-二（4-羥苯基）-1，2-丙二醇，轉(zhuǎn)化為4,4-二羥 基-A-甲基苯乙烯，再轉(zhuǎn)化為4-羥基苯甲酸和2-對(duì)羥苯基-2-酮基-1-乙醇。
[0010]EE2是一種人工合成的雌激素，是避孕藥的主要成分，分子式為C2(]H2402,分子量為 296,不溶于水，溶于乙醇，乙醚等。
[0011] EE2具有極強(qiáng)的雌激素活性，劉寶敏等研究證明，EE2可導(dǎo)致美國(guó)紅魚幼魚個(gè)體異 常，甚至死亡，同時(shí)對(duì)美國(guó)紅魚的肥滿度！腎臟指數(shù)和肝胰臟指數(shù)均有影響。Purdom等人發(fā) 現(xiàn)了魚類的雌雄同體現(xiàn)象，其中EE2是出現(xiàn)該現(xiàn)象的主要原因。對(duì)于EE2的治理，目前使用 的方法有活性炭吸附，光降解，臭氧氧化，二氧化錳氧化，生物降解等。其中生物降解中，通 過活性污泥的作用，EE2濃度下降并產(chǎn)生親水性物質(zhì)。
[0012] 環(huán)境激素的降解途徑可能受到污染物結(jié)構(gòu)、微生物特性及環(huán)境條件等多方面因素 的影響。比較重要的幾個(gè)因素是氧氣，溫度與pH。Hesselsoe等實(shí)驗(yàn)證明，NP在好氧條件下 才能降解。而Tanghe等的實(shí)驗(yàn)指出在20°C以上NP的降解才能達(dá)到一個(gè)較快的速率。Ying 等研究表明BPA厭氧條件下幾乎不降解。
[0013] 這幾種典型酚類環(huán)境激素污染物具有疏水性、脂溶性及可降解性差等特點(diǎn)，痕量 濃度的污染物可通過食物鏈經(jīng)生物富集達(dá)到較高的濃度水平，從而給人體健康帶來(lái)一定的 影響。同時(shí)環(huán)境激素是激素類物質(zhì)，它可以通過與人體內(nèi)激素的競(jìng)爭(zhēng)，與激素受體結(jié)合，從 而影響其表達(dá)，擾亂人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)，改變體內(nèi)激素水平，人如果長(zhǎng)期處于內(nèi)分泌紊亂的 狀態(tài)，將會(huì)導(dǎo)致失眠頭痛，月經(jīng)不調(diào)，皮膚衰老等癥狀。
[0014]目前對(duì)環(huán)境激素的生物降解研究主要集中于某些菌體產(chǎn)生的特殊酶類對(duì)該類物 質(zhì)的作用，但有關(guān)氧化物與漆酶共同作用降解的研究較少，且已有的技術(shù)僅能使環(huán)境激素 轉(zhuǎn)化為較低毒性的物質(zhì)，不能夠完全脫毒，仍存在一定的安全問題。處理過程中，隨著酶的 活性降低，降解效果也會(huì)產(chǎn)生影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明的目的在于提供了一種大腸桿菌錳氧化工程菌，通過構(gòu)建了大腸桿菌 ToplO表面展示芽孢衣蛋白CotA的基因工程菌株，使大腸桿菌工程菌獲得了錳氧化活性。
[0016] 本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供了 一種大腸桿菌錳氧化工程菌在環(huán)境激素降解中的 應(yīng)用。利用細(xì)菌表面展示的CotA蛋白漆酶活性及培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的錳氧化物降解環(huán)境激 素，將環(huán)境激素?zé)o毒化，可解決處理環(huán)境激素過程中的毒性殘留及降解效果的持效性的問 題，從而達(dá)到修復(fù)環(huán)境的作用。
[0017] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：
[0018] -種大腸桿菌錳氧化工程菌，通過以下步驟構(gòu)建得到：
[0019] (1)人工合成cotA基因，具體如下：
[0020] >cotA
[0021] ATGAACCTAGAAAAATTTGTTGACGAGCTGCCAATTCCAGAAGTCGCAGAGCCCGTC
[0022] AAAAAAAACCCAAGACAAACGTATTATGAAATCGCTATGGAGGAGGTGTTCCTCAAA
[0023]GTTCATAGAGATCTGCCCCCAACCAAGCTATGGACCTATAATGGCAGTTTGCCGGGTC
[0024]CAACCATTAAAGCGAATCGAAATGAAAAGGTCAAAGTGAAATGGATGAACAAATTG
[0025] CCGCTGAAACACTTCCTGCCTGTCGATCATACCATTCACGCTGGACACCATGATGAAC
[0026]CCGAAGTCAAAACAGTCGTTCACCTGCATGGGGGCGTGACACCTGCAAGCAGCGATG
[0027]GTTATCCAGAGGCTTGGTTTTCGCGAGACTTTGAAGCGACCGGCCCCTTCTTTGAACG
[0028]AGAGGTTTACGAATACCCTAATCATCAGCAAGCATGCACATTGTGGTATCACGATCAT
[0029]GCCATGGCATTGACACGATTAAATGTATACGCCGGATTAGCTGGCTTTTATTTGATCT
[0030]CAGATGCGTTTGAAAAATCACTCGAATTACCGAAAGATGAATATGATATCCCTTTAAT
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