一種孔洞梯度改變的生物材料的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種孔洞梯度改變的生物材料的制備方法，其特征在于所述生物材料具有梯度改變的孔洞，可誘導(dǎo)細胞由無序到有序的排列。該生物材料的制備方法如下：在無機膠體晶體的模板上涂覆聚合物溶液，固定后去除模板，按順序?qū)酆衔锊灸さ牟煌恢眠M行同一方向上不同程度的拉伸，得到孔洞梯度改變的生物材料。本發(fā)明的方法操作簡便，制備出的孔洞梯度改變的生物材料可誘導(dǎo)細胞由無序到有序漸變的排列，模擬肌腱?骨組織連接，對于組織再生尤其是肌腱?骨組織連接的再生與修復(fù)具有潛在的應(yīng)用前景和現(xiàn)實意義。
【專利說明】
一種孔洞梯度改變的生物材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物材料及組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種孔洞梯度改變的生物材料的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肌腱是連接肌肉與骨組織的過渡組織，在關(guān)節(jié)活動中擔任重要的力量傳遞作用。肌腱關(guān)節(jié)的損傷尤其是肩關(guān)節(jié)及腳踝關(guān)節(jié)的損傷是機體組織損傷中最易發(fā)生的損傷。由于肌肉-骨組織的過渡部分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此該部分的再生修復(fù)是組織工程中的難題。
[0003]目前已經(jīng)制備出包含各種細胞外基質(zhì)的生物材料，同時也制備出了許多用來誘導(dǎo)細胞定向排列和分化的生物材料，如PLGA的納米纖維等。然而，幾乎沒有一種基底材料可以同時實現(xiàn)細胞從無序到有序的漸變排列，因此無法滿足組織工程尤其是骨連接組織工程等領(lǐng)域的需要。
[0004]為了模擬肌腱-骨組織連接的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，需要一種能夠?qū)崿F(xiàn)細胞在同一基底上從無序到有序漸變排列的方法。本發(fā)明因此而來，在無機膠體晶體的模板上涂覆聚合物溶液，固定后去除模板，按順序?qū)酆衔锊灸さ牟煌恢眠M行同一方向上不同程度的拉伸，得到孔洞梯度改變的生物材料。本發(fā)明的方法操作簡便，制備出的孔洞梯度改變的生物材料可誘導(dǎo)細胞由無序到有序漸變的排列，模擬肌腱-骨組織連接。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明公開了一種孔洞梯度改變的生物材料的制備方法，制備出的生物材料具有良好的生物相容性，同時可以誘導(dǎo)細胞從無序到有序的漸變排列，對于組織再生尤其是肌腱-骨組織連接的再生與修復(fù)具有潛在的應(yīng)用前景和現(xiàn)實意義。
[0006]為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下:
在無機膠體晶體的模板上涂覆聚合物溶液，固定后去除模板，按順序?qū)酆衔锊灸さ牟煌恢眠M行同一方向上不同程度的拉伸，得到孔洞梯度改變的生物材料。
[0007]本發(fā)明提供的一種孔洞梯度改變的生物材料的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟:
首先，無機膠體晶體薄膜的制備:將清洗后的載玻片垂直放入盛有無機膠體晶體納米粒子單分散溶液的容器中，恒溫恒濕(溫度為25°C和濕度為40%)環(huán)境下靜置數(shù)天，得到表面具有無機膠體晶體微球陣列的模板。
[0008]其次，反結(jié)構(gòu)生物材料的制備:將獲得的模板水平放置，在表面涂覆聚合物溶液，使其充分滲透膠體晶體微球陣列間隙，待溶液揮發(fā)干燥后，去除模板，得到具有納米孔洞的聚合物薄膜。
[0009]再次，反結(jié)構(gòu)生物材料的漸變拉伸:將獲得的聚合物薄膜兩端用夾具固定，一半垂直放入熱水中，另一半保留在水外。對水浴環(huán)境中的聚合物薄膜進行勻速數(shù)倍拉伸后，取出冷卻固定。對獲得的薄膜重復(fù)此步驟數(shù)次后，得到孔洞拉伸梯度改變薄膜。
[0010]最后，孔洞梯度改變的生物材料的表面修飾:對獲得的孔洞梯度改變的聚合物薄膜進行表面修飾，得到良好生物相容性的孔洞梯度改變的生物材料。
[0011]優(yōu)選的，所述的一種孔洞梯度改變的生物材料的制備方法，其特征在于:所述的無機膠體晶體材料可以為二氧化硅膠體晶體，聚苯乙烯膠體晶體等。粒徑大小為500nm。
[0012]優(yōu)選的，所述的一種孔洞梯度改變的生物材料的制備方法，其特征在于:聚合物可以為 PS，PMMA，PLGA。
[0013]優(yōu)選的，所述的一種孔洞梯度改變的生物材料的制備方法，其特征在于:最終孔洞拉伸倍數(shù)可以為2倍-6倍。
[0014]優(yōu)選的，所述的一種孔洞梯度改變的生物材料的制備方法，其特征在于:步表面修飾可以為膠原蛋白修飾，殼聚糖修飾，海藻酸鈣凝膠灌注。
[0015]本發(fā)明通過以對聚合物簿膜的不同位置進行同一方向上不同程度的拉伸，得到孔洞梯度改變的生物材料。其特征在于所述材料為孔洞梯度改變的生物材料;可誘導(dǎo)細胞的無序-有序漸變排列，模擬肌腱-骨組織連接。
[0016]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明公開了一種孔洞梯度改變的生物材料的制備方法，按順序?qū)Σ灸さ牟煌恢眠M行不同程度的拉伸，得到同一塊薄膜上孔洞梯度改變的生物材料，可以誘導(dǎo)細胞從無序到有序漸變的排列，對于組織再生尤其是肌腱-骨組織連接的再生與修復(fù)具有潛在的應(yīng)用前景和現(xiàn)實意義。
【附圖說明】
[0017]圖1、為一種孔洞梯度改變的生物材料制備方法流程圖；其中I為在制備出的無機膠體晶體微陣列上灌注聚合物溶液;2為制備出的反結(jié)構(gòu)生物材料;3為生物材料的孔洞梯度拉伸；
圖2、觀察成纖維細胞在漸變拉伸納米多孔材料上的排列定向情況結(jié)果；圖中，圖a為細胞在未拉伸多孔材料表面的排列情況，圖b為細胞在2倍拉伸多孔材料表面的排列情況，圖c為細胞在6倍拉伸多孔材料表面的排列情況。
【具體實施方式】
[0018]應(yīng)理解，這些實施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。
[0019]實施例1孔洞梯度改變的生物材料的制備 I.二氧化硅膠體晶體薄膜的制備:
將清洗后的載玻片垂直放入盛有粒徑500nm的二氧化硅納米粒子單分散乙醇溶液的容器中，溫度25°C濕度40%的環(huán)境下靜置5天左右，得到表面具有二氧化硅膠體晶體微球陣列的模板。
[0020]2.反蛋白石結(jié)構(gòu)納米多孔生物材料的制備:
將步驟I獲得的模板水平放置，在表面涂覆質(zhì)量分數(shù)為30%(體積百分比)的聚苯乙烯甲苯溶液，使其充分滲透二氧化硅納米微球陣列間隙，待溶液揮發(fā)干燥后，用4%(體積百分比)氫氟酸腐蝕模板，使聚苯乙烯薄膜從載玻片上分離，得到具有納米多孔的聚苯乙烯薄膜。
[0021]3.納米多孔生物材料的部分拉伸: 將步驟2獲得的聚苯乙烯薄膜的一部分垂直放入70°C的純水中，另外一部分保留在水浴外。對水浴環(huán)境中的聚苯乙烯薄膜進行勻速2倍拉伸后，迅速放到10°C純水中固定I分鐘。
[0022]4.納米多孔生物材料的拉伸部分的再拉伸:
將步驟3獲得的聚苯乙烯薄膜的拉伸部分的一半垂直放入70°C的純水中，另外一半保留在水浴外。對水浴環(huán)境中的聚苯乙烯薄膜進行勻速3倍拉伸后，迅速放到10°C純水中固定I分鐘。
實施例2孔洞梯度改變的生物材料上的細胞培養(yǎng):
1.生物材料的I型膠原蛋白灌注:
將實例I獲得的拉伸漸變的聚苯乙烯薄膜紫外滅菌消毒后，浸泡在I型膠原蛋白中，37°C培養(yǎng)箱中放置3小時后取出，用PBS緩沖液沖洗薄膜，得到結(jié)構(gòu)為“無拉伸-2倍拉伸-6倍拉伸”的富含膠原蛋白的模擬肌腱-骨組織連接的生物材料。
[0023]2.成骨細胞的接種:
選取大鼠肌腱成纖維細胞，用培養(yǎng)基稀釋成濃度為2 X 105/ml的細胞懸液，接種到步驟I獲得的梯度孔洞薄膜上。
[0024]3.細胞排列的熒光染色觀察
細胞培養(yǎng)24h后，用Calcein-AM熒光染料對步驟2中的細胞進行染色，觀察成纖維細胞在漸變拉伸納米多孔材料上的排列定向情況。圖2為觀察結(jié)果。圖中，圖(a)為細胞在未拉伸多孔材料表面的排列情況，圖(b)為細胞在2倍拉伸多孔材料表面的排列情況，圖(c)為細胞在6倍拉伸多孔材料表面的排列情況。可以看到，細胞在漸變拉伸納米多孔材料表面為無序-有序的漸變排列。圖中標尺為400μπι。
[0025]實施例3孔洞梯度改變的生物材料的生物相容性測試:
I.孔洞梯度改變的生物材料的細胞毒性測試:
采用MTT細胞毒性測試法，對生物材料基底上和普通培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的成纖維細胞進行細胞毒性測試來觀察生物材料的生物毒性。測試結(jié)果顯示，生長于孔洞梯度改變的生物材料基底上與普通培養(yǎng)皿上的細胞活力無統(tǒng)計性差異。
[0026]2.孔洞梯度改變的生物材料的細胞活力測試:
用Calcein-AM和碘化丙啶(PI)溶液分別對生物材料上的細胞進行熒光染色。Calcein-AM可以對活細胞染色，PI溶液可以對死細胞染色，在熒光顯微鏡下分別顯示為綠色和紅色。通過對細胞進行染色后，用熒光顯微鏡同時觀察生物材料基底上活細胞和死細胞的數(shù)目。結(jié)果顯示，生物材料基底上幾乎全為綠色熒光的活細胞，生物材料基底上的成纖維細胞活力旺盛。
以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種孔洞梯度改變的生物材料的制備方法，其特征在于所述的生物材料通過如下方法制得:在無機膠體晶體的模板上涂覆聚合物溶液，固定后去除模板，按順序?qū)酆衔锊灸さ牟煌恢眠M行同一方向上不同程度的拉伸，得到孔洞梯度改變的生物材料。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種孔洞梯度改變的生物材料的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)無機膠體晶體薄膜的制備: 將清洗后的載玻片垂直放入盛有無機膠體晶體納米粒子單分散溶液的容器中，溫度為25°C和濕度為40%的環(huán)境下靜置數(shù)天，得到表面具有無機膠體晶體微球陣列的模板； (2)反結(jié)構(gòu)生物材料的制備: 將步驟(I)獲得的模板水平放置，在表面涂覆聚合物溶液，使其充分滲透膠體晶體微球陣列間隙，待溶液揮發(fā)干燥后，去除模板，得到具有納米孔洞的聚合物薄膜； (3)反結(jié)構(gòu)生物材料的漸變拉伸: 將步驟(2)獲得的聚合物薄膜兩端用夾具固定，一半垂直放入熱水中，另一半保留在水外， 對水浴環(huán)境中的聚合物薄膜進行勻速數(shù)倍拉伸后，取出冷卻固定， 對獲得的薄膜重復(fù)此步驟數(shù)次后，得到孔洞拉伸梯度改變薄膜； (4)孔洞梯度改變的生物材料的表面修飾 對步驟(3)中獲得的孔洞梯度改變的聚合物薄進行表面修飾，得到生物相容性良好的孔洞梯度改變的生物材料。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種孔洞梯度改變的生物材料的制備方法，其特征在于:步驟(1)中，無機膠體晶體材料為二氧化硅膠體晶體，聚苯乙烯膠體晶體;所述的粒徑大小為500nmo4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種孔洞梯度改變的生物材料的制備方法，其特征在于:步驟(2)中，聚合物為PS、PMMA或PLGA。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種孔洞梯度改變的生物材料的制備方法，其特征在于:步驟(3)中，孔洞拉伸最終倍數(shù)為2倍-6倍。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種孔洞梯度改變的生物材料的制備方法，其特征在于:步驟(4)中，表面修飾為膠原蛋白修飾、殼聚糖修飾或海藻酸鈣凝膠灌注。
【文檔編號】A61L27/24GK105906835SQ201610527983
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年7月6日
【發(fā)明人】趙遠錦, 陸潔, 趙澤, 王潔, 顧忠澤
【申請人】東南大學(xué)