一種脂肪酶催化在線合成5’-o-棕櫚酰尿苷的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脂肪酶催化在線合成5'?O?棕櫚酰尿苷的方法。所述方法包括：以體積比為1:8～16的二甲亞砜和叔戊醇為反應(yīng)溶劑，以摩爾比為1:5～13的尿苷與棕櫚酸乙烯酯為原料，以0.5～1.0g脂肪酶Lipozyme TLIM為催化劑，將原料和反應(yīng)溶劑置于注射器中，將脂肪酶Lipozyme TLIM均勻填充在微流控通道反應(yīng)器的反應(yīng)通道中，在注射泵的推動下使原料和反應(yīng)溶劑連續(xù)通入反應(yīng)通道器中進行?；磻?yīng)，所述微流控通道反應(yīng)器的反應(yīng)通道內(nèi)徑為0.8～2.4mm，反應(yīng)通道長為0.5～1.0m；控制?；磻?yīng)溫度為15～50℃，反應(yīng)體系中尿苷的濃度為0.03～0.07mmol/mL,?；磻?yīng)時間為20～35min，通過產(chǎn)物收集器在線收集反應(yīng)液，反應(yīng)液經(jīng)常規(guī)后處理得到5'?O?棕櫚酰尿苷。本發(fā)明具有反應(yīng)時間短、選擇性高及產(chǎn)率高的優(yōu)點。
【專利說明】
一種脂肪酶催化在線合成5棕櫚酰尿苷的方法 (一)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種脂肪酶催化在線可控選擇性合成5'-0-棕櫚酰尿苷的方法 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 核苷類藥物在病毒性疾病的治療中占有重要的地位。目前臨床上使用的抗病毒藥 物中，核苷類藥物所占比重達60%以上。大多數(shù)核苷類化合物為多羥基化合物，存在極性較 高、腸道通透性較低，脂溶性差、毒副作用大以及口服生物利用度較低等缺陷。核苷類化合 物通過酯化修飾后，可增強其脂溶性，提高藥理活性，提高其口服生物利用度。在通常的化 學(xué)法酯化過程中，多個羥基都有可能參與酯化，產(chǎn)物為單酯及多酯的混合物，因而需經(jīng)"基 團保護---酯化---脫保護基團"三步才能獲得單一位置酯化的產(chǎn)物。而酶對底物有 良好的專一性和選擇性，可以選擇性對核苷的某個羥基進行酯化，反應(yīng)選擇性較高，減少了 產(chǎn)物后續(xù)分離的困難，因此生物催化技術(shù)在核苷類化合物的酯化中扮演著越來越重要的角 色。
[0003] 微流控學(xué)(Microfluidics)是在微米級結(jié)構(gòu)中操控納升至皮升體積流體的技術(shù)與 科學(xué)，是近十年來迅速崛起的新交叉學(xué)科。當前，微流控學(xué)的發(fā)展已大大超越了原來的主要 為分析化學(xué)服務(wù)的目的，而正在成為整個化學(xué)學(xué)科、生命科學(xué)、儀器科學(xué)乃至信息科學(xué)新一 輪創(chuàng)新研究的重要技術(shù)平臺。
[0004] 自1997年Harrison課題組發(fā)表了首篇在微流控芯片微反應(yīng)器中合成化合物的文 獻后，微流控芯片反應(yīng)器已成功地用于多種有機合成反應(yīng)，并展示了廣泛的應(yīng)用前景。隨著 微流控芯片中微混合、微反應(yīng)技術(shù)的發(fā)展，在芯片中進行合成反應(yīng)已經(jīng)成為微流控芯片領(lǐng) 域的研究熱點之一。
[0005] 同常規(guī)化學(xué)反應(yīng)器相比，微通道反應(yīng)器不僅具有使反應(yīng)物間的擴散距離大大縮 短，而且傳質(zhì)速度快;反應(yīng)物配比、溫度、反應(yīng)時間和流速等反應(yīng)條件容易控制，副反應(yīng)較 少;需要反應(yīng)物用量甚微，不但能減少昂貴、有毒、有害反應(yīng)物的用量，反應(yīng)過程中產(chǎn)生的環(huán) 境污染物也極少，是一種環(huán)境友好、合成研究新物質(zhì)的技術(shù)。
[0006] 目前，有較多的國內(nèi)外學(xué)者對有機介質(zhì)中核苷?；磻?yīng)的酶催化合成進行了研 究，但是該方法多選用?；高M行催化，往往需要較長的反應(yīng)時間（12_24h)，且反應(yīng)的轉(zhuǎn)化 率與選擇性不高，因此我們研究了微通道反應(yīng)器中脂肪酶催化在線合成5'-0_棕櫚酰尿苷 的方法，旨在尋找一種高效環(huán)保的5'-0_棕櫚酰尿苷的在線可控選擇性合成方法。 (三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種微流控通道反應(yīng)器中脂肪酶催化在線合成 5 ' -0-棕櫚酰尿苷的新工藝，具有反應(yīng)時間短、產(chǎn)率高、選擇性好的優(yōu)點。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0009] -種脂肪酶催化在線合成5'-0_棕櫚酰尿苷的方法，所述方法采用微流控通道反 應(yīng)器，所述的微流控通道反應(yīng)器包括注射栗、注射器、反應(yīng)通道和產(chǎn)物收集器，所述注射器 安裝于注射栗中，通過一個接口與反應(yīng)通道入口連接，所述產(chǎn)物收集器通過一個接口與反 應(yīng)通道出口連接，所述反應(yīng)通道內(nèi)徑為0.8~2.4mm，反應(yīng)通道長為0.5~1. Om;所述方法包 括：以體積比為1:8~16的二甲亞砜(DMS0)和叔戊醇為反應(yīng)溶劑，以摩爾比為1:5~13的尿 苷與棕櫚酸乙烯酯為原料，以0.5~l.Og脂肪酶Lipozyme TUM為催化劑，將原料和反應(yīng)溶 劑置于注射器中，將脂肪酶Lipozyme TUM均勻填充在反應(yīng)通道中，在注射栗的推動下使原 料和反應(yīng)溶劑連續(xù)通入反應(yīng)通道器中進行?；磻?yīng)，使反應(yīng)體系（由原料和反應(yīng)溶劑組成） 中尿苷的濃度為0.03~0.07mmol/mL，控制?；磻?yīng)溫度為15~50°C，?；磻?yīng)時間為20~ 35min，通過產(chǎn)物收集器在線收集反應(yīng)液，反應(yīng)液經(jīng)常規(guī)后處理得到5 ' -0-棕櫚酰尿苷。
[0010] 本發(fā)明采用的微流控通道反應(yīng)器中，所述注射器數(shù)目可以是一個或多個，視具體 反應(yīng)需求而定。比如，當使用兩個注射器時，可采用T型或Y型接口使不同的反應(yīng)物從兩個入 口引入，匯流進入公共的反應(yīng)通道，通過微通道的中反應(yīng)物分子接觸與碰撞幾率增大，使兩 股反應(yīng)液流在公共的反應(yīng)通道中混合并進行反應(yīng)。
[0011] 所述的微流控通道反應(yīng)器還包括恒溫箱，所述的反應(yīng)通道置于恒溫箱中，以此可 以有效控制反應(yīng)溫度。所述的恒溫箱可以根據(jù)反應(yīng)溫度要求自行選擇，比如水浴恒溫箱等。
[0012] 本發(fā)明對于反應(yīng)通道的材質(zhì)不限，推薦使用綠色、環(huán)保的材質(zhì)，例如硅膠管;對于 反應(yīng)通道的形狀最好為曲線形，可以保證反應(yīng)液勻速穩(wěn)定的通過。
[0013] 本發(fā)明在實施過程中，先用DMS0溶解尿苷，再繼續(xù)加叔戊醇至一定體積，裝于注射 器中備用;然后用叔戊醇溶解棕櫚酸乙烯酯至一定體積，裝于另一注射器中備用;最后在注 射栗(例如ro 1200注射栗)推動下使原料和反應(yīng)溶劑通入反應(yīng)通道中進行反應(yīng)。
[0014] 本發(fā)明中，所述的脂肪酶Lipozyme TLIM使用諾維信(Novozymes)公司生產(chǎn)的商 品，其是一種由微生物制備的、1，3位置專用、食品級脂肪酶(EC3.1.1.3)在顆粒硅膠上的制 劑。它是從Thermomyceslanuginosus得到的、用一種基因改性米曲霉(Aspergi 1 lusoryzae) 微生物經(jīng)過深層發(fā)酵生產(chǎn)的。
[0015] 進一步，所述反應(yīng)溶劑中二甲亞砜和叔戊醇的體積比優(yōu)選為1:12~1:16,優(yōu)選為 1:14〇
[0016] 進一步，所述尿苷與棕櫚酸乙烯酯的摩爾比優(yōu)選為1:9~11，最優(yōu)選為1:9。
[0017] 進一步，反應(yīng)體系中尿苷的濃度優(yōu)選為0.04~0.06mmol/mL，最優(yōu)選為0.05mmol/ mL〇
[0018] 進一步，所述?；磻?yīng)溫度優(yōu)選為20~40°C，最優(yōu)選為30°C。
[0019] 進一步，所述酰化反應(yīng)時間優(yōu)選為25~35min，最優(yōu)選為30min。
[0020] 本發(fā)明的反應(yīng)產(chǎn)物可以在線收集，所得反應(yīng)液可以通過常規(guī)后處理方法即可獲得 5 '-0-棕櫚酰尿苷。所述常規(guī)后處理方法可以是:所得反應(yīng)液減壓蒸餾除去溶劑，用200-300 目硅膠濕法裝柱，洗脫試劑為乙酸乙酯：甲醇= 40:1，樣品用少量洗脫試劑溶解后濕法上 柱，收集洗脫液，同時TLC跟蹤洗脫進程，將得到的含有單一產(chǎn)物的洗脫液合并蒸干，可以得 至泊色固體，即為5 ' -0-棕櫚酰尿苷。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明在微流控通道反應(yīng)器中利用脂肪 酶催化在線合成5 ' -0-棕櫚酰尿苷，該法不僅大大地縮短了反應(yīng)時間，而且具有高的轉(zhuǎn)化 率；同時首次利用經(jīng)濟的脂肪酶Lipozyme TLIM催化核苷酯化反應(yīng)，降低了反應(yīng)成本，具有 經(jīng)濟高效的優(yōu)勢。 (四）
【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明實施例采用的微流控通道反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)示意圖。 (五)
【具體實施方式】
[0023]下面以具體實施例對本發(fā)明的保護范圍作進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍不限 于此：
[0024]本發(fā)明實施例使用的微流控通道反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)參考圖1，包括一個注射栗（未顯 示）、兩個注射器1和2、反應(yīng)通道3、水浴恒溫箱(5,僅顯示其平面示意圖）和產(chǎn)物收集器4;兩 個注射器1和2安裝于注射栗中，通過一個Y型接口與反應(yīng)通道3入口連接，所述反應(yīng)通道3置 于水浴恒溫箱5中，通過水浴恒溫箱5控制反應(yīng)溫度，所述的反應(yīng)通道3的內(nèi)徑2.0mm，管長 lm，所述反應(yīng)通道3出口通過一接口與產(chǎn)物收集器4連接。
[0025] 實施例1:5棕櫚酰尿苷的合成
[0026]
[0027] 裝置參考圖1:將尿苷（1. Ommol)溶解在1.2mLDMS0和8.8mL叔戊醇的中，棕櫚酸乙 烯酯(9. Ommol，2.3mL)溶解在7.7mL叔戊醇中，然后分別裝于10mL注射器中備用。0.87g脂肪 酶Lipozyme TLIM均勻填充在反應(yīng)通道中，在PD 1200注射栗推動下，兩路反應(yīng)液分別以 10.4yL · mirT1的流速通過?'接頭進入反應(yīng)通道中進行反應(yīng)，通過水浴恒溫箱控制反應(yīng)器 溫度在30 °C，反應(yīng)液在反應(yīng)通道內(nèi)連續(xù)流動反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)果通過薄層色譜TLC跟蹤檢 測。
[0028]通過產(chǎn)物收集器在線收集反應(yīng)液，減壓蒸餾除去溶劑，用200-300目硅膠濕法裝 柱，洗脫試劑為乙酸乙酯：甲醇=40:1，柱高35cm，柱直徑4.5cm，樣品用少量洗脫試劑溶解 后濕法上柱，洗脫液收集流速2mL · mirT1，同時TLC跟蹤洗脫進程，將得到的含有單一產(chǎn)物的 洗脫液合并蒸干，得到白色固體，獲得5 ' -0-棕櫚酰尿苷，HPLC檢測尿苷轉(zhuǎn)化率99 %，選擇性 100%〇
[0029]核磁表征結(jié)果如下：
[0030] ^-NMRCDMSO-de^^pm) ： 11.36 (s , H3), 7.61 (d , J = 9Hz , He), 5.75 (d, 1H, J = 4.5Hz,Hi·) ,5.65(d,lH,J = 9Hz,H5),5.48(d,lH,J = 5.5Hz,3,-OH),5.29(d,lH,J = 5.5Hz, 2'-OH) ,4.23(m,2H,H2-+H3·) ,4.07(m,lH,H4·) ,3.97(m,2H,H5-),2.33(t,2H,J = 7Hz,H2O , 1.51 (m, 2H,H3"），1.23 (br, 24H,H4" +H5" +H6" +Hr +H8" +H9" +Hi〇" +H11" +Hi2" +Hi3" +Hi4" +Hi5"），0.85 (t,3H,J = 7Hz,Hi6O.
[0031] 13C NMR(DMS〇-d6，ppm) :172.77(Ci"），163.04(C4), 150.60(C2), 140.76(C6), 102.02 (C5) ,88.76(Ci·) ,81.06(C4·) ,72.75 (C3·) ,69.77(C2·) ,63.51 (C5·) ,33.37 (C2〇 ,31.28 (C14"），28 · 41 -29 · 02(C4" +C5" +C6" +Cr' +C8" +C9" +Ci〇" +C11" +C12' +C13"），24 · 41 (C3"），22 · 08(C15"）， 13.94(Ci6"）.
[0032] 實施例2-6
[0033] 保持有機溶劑總體積用量不變，改變微流控通道反應(yīng)器中有機溶劑DMSO與叔戊醇 的體積比，控制溫度為50°C，其他同實施例1，反應(yīng)結(jié)果如表1所示：
[0034]表1:有機溶劑比對反應(yīng)的影響
[0035]
[0036] 表1的結(jié)果表明，當流速為10.4yL · mirT1，反應(yīng)時間均為30min，反應(yīng)溫度均為50 °C，反應(yīng)物尿苷與棕櫚酸乙稀酯摩爾比均為1:9,尿苷濃度均為0.05mmol/mL時，轉(zhuǎn)化率隨反 應(yīng)器中有機溶劑體積比增大而增加，當DMS0與叔丁醇體積比達到1:14時達到最佳，再繼續(xù) 增大體積比將會導(dǎo)致反應(yīng)物溶解不完全而降低轉(zhuǎn)化率。所以本發(fā)明中微流控微通道反應(yīng)器 中最佳有機溶劑體積比為1:14。
[0037]實施例7-11
[0038]改變微流控微通道反應(yīng)器中尿苷與棕櫚酸乙烯酯的底物比，控制溫度50°C其他同 實施例1，結(jié)果如表2所不：
[0039]表2:尿苷與棕櫚酸乙烯酯底物比對反應(yīng)的影響 [0040]
[0041 ] 表2的結(jié)果表明，當流速為10.4yL ·
min4，反應(yīng)時間均為30min，反應(yīng)溫度均為50 。(：，反應(yīng)器中有機溶劑DMS0與叔丁醇體積比均為1:14,尿苷濃度均為0.05mmol/mL時，隨著 反應(yīng)物棕櫚酸乙烯酯的增加，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率也隨著增加，當?shù)孜锉葹?:9時，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率 最優(yōu)，所以本發(fā)明中微流控微通道反應(yīng)器中最佳底物摩爾比為1:9。
[0042]實施例12-15
[0043] 改變微流控通道反應(yīng)器的溫度，其他同實施例1，反應(yīng)結(jié)果如表3所示：
[0044] 表3:溫度對反應(yīng)的影響
[0045]
[0046] 表3的結(jié)果表明，當流速為10.4yL · mirT1，反應(yīng)時間均為30min，反應(yīng)器中有機溶劑 DMS0與叔丁醇體積比均為1:14,反應(yīng)物尿苷與棕櫚酸乙稀酯摩爾比均為1:9,尿苷濃度均為 0.05mmol/mL時，當反應(yīng)溫度處于30°C時，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率最佳，溫度或太高或太低都將影響 酶的活性。所以本發(fā)明中微流控微通道反應(yīng)器中最佳溫度為30°C。
[0047] 實施例16-18
[0048] 改變微流控通道反應(yīng)器的反應(yīng)時間，其他同實施例1，反應(yīng)結(jié)果如表4所示：
[0049] 表4:反應(yīng)時間對反應(yīng)的影響
[0050]
[0051 ] 表4的結(jié)果表明，當反應(yīng)器中有機溶劑DMS0與叔丁醇體積比均為1:14,反應(yīng)物尿苷 與棕櫚酸乙稀酯摩爾比均為1:9,反應(yīng)溫度均為30°C，尿苷濃度均為0.05mmol/mL時，當反應(yīng) 時間為30min的時候，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高達99 %，幾乎完全轉(zhuǎn)化。所以本發(fā)明中微流控微通道反 應(yīng)器中最佳反應(yīng)時間為30min。
[0052] 實施例19-22
[0053] 改變微流控通道反應(yīng)物的濃度，其他同實施例1，反應(yīng)結(jié)果如表5所示：
[0054]表5:反應(yīng)物濃度對反應(yīng)的影響
[0055]
[0056] 表5的結(jié)果表明，當反應(yīng)器中有機溶劑DMS0與叔丁醇體積比均為1:14,反應(yīng)物尿苷 與棕櫚酸乙稀酯摩爾比均為1: 9,反應(yīng)溫度均為30°C，反應(yīng)時間均為30min，尿苷濃度為 0.05mmol/mL的時候，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高達99%，所以本發(fā)明中微流控微通道反應(yīng)器中最佳反應(yīng) 物濃度為〇. lmmol/mL。
[0057] 對比例1-3
[0058] 改變微流控微通道反應(yīng)器中的催化劑，分別改為脂肪酶Lipozyme RM頂(對比例 1)、脂肪酶Novozym 435(對比例2)、枯草桿菌堿性蛋白酶(對比例3)，其他同實施例1，結(jié)果 如表6所示。
[0059]表6:不同酶對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率及選擇性的影響 [0060]
[0061] 表6的結(jié)果表明，對于微流控通道反應(yīng)器中酶促尿苷的區(qū)域選擇性酯化反應(yīng)而言， 不同的酶對反應(yīng)有著十分明顯的影響。利用脂肪酶Lipozyme RM頂催化反應(yīng)，5'-0-棕櫚酰 尿苷的轉(zhuǎn)化率為55 %。而利用枯草桿菌堿性蛋白酶催化該反應(yīng)，5 '-0-棕櫚酰尿苷的轉(zhuǎn)化率 僅為16%。從表6的結(jié)果看，對于微流控通道反應(yīng)器中酶促尿苷的區(qū)域選擇性酯化反應(yīng)而 言，最有效的催化劑為脂肪酶Lipozyme TUM，尿苷的轉(zhuǎn)化率為99%，選擇性為100%。
[0062] 對比例4-5
[0063] 改變微流控微通道反應(yīng)器中不同種類的尿苷化合物，將實施例1的尿苷lmmol分別 改為鳥苷ImmoK對比例4)、3'_脫氧尿苷ImmoK對比例5)、其他同實施例1，結(jié)果如表7所示。
[0064] 表7:不同核苷類化合物對反應(yīng)的影響
[0065]
[0066」表7的結(jié)果表明，對于微流控通道反應(yīng)器中酶促核苷類化合物的區(qū)域選擇性酯化 反應(yīng)而言，不同的核苷類化合物都有不同的反應(yīng)結(jié)果。3'-脫氧尿苷在同樣的反應(yīng)條件下， 轉(zhuǎn)化率僅為30 %，反應(yīng)比較困難。鳥苷的反應(yīng)結(jié)果也不理想，轉(zhuǎn)化率僅為37 %。從表7的結(jié)果 看，對于微流控通道反應(yīng)器中酶促核苷類化合物的區(qū)域選擇性酯化反應(yīng)而言，尿苷可以取 得比較理想的反應(yīng)結(jié)果，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率可以達到99%，選擇性為100%。
【主權(quán)項】
1. 一種脂肪酶催化在線合成一種脂肪酶催化在線合成5'-ο-棕櫚酰尿苷的方法，其特 征在于所述方法采用微流控通道反應(yīng)器，所述的微流控通道反應(yīng)器包括注射栗、注射器、反 應(yīng)通道和產(chǎn)物收集器，所述注射器安裝于注射栗中，通過一個接口與反應(yīng)通道入口連接，所 述產(chǎn)物收集器通過一個接口與反應(yīng)通道出口連接，所述反應(yīng)通道內(nèi)徑為〇. 8~2.4mm，反應(yīng) 通道長為0.5~1. Om;所述方法包括：以體積比為1:8~16的二甲亞砜和叔戊醇為反應(yīng)溶劑， 以摩爾比為1:5~13的尿苷與棕櫚酸乙稀酯為原料，以0.5~1 .Og脂肪酶Lipozyme TLIM為 催化劑，將原料和反應(yīng)溶劑置于注射器中，將脂肪酶Lipozyme TLM均勻填充在反應(yīng)通道 中，在注射栗的推動下使原料和反應(yīng)溶劑連續(xù)通入反應(yīng)通道器中進行酰化反應(yīng)，使反應(yīng)體 系中尿苷的濃度為0.03~0.07mmol/mL，控制酰化反應(yīng)溫度為15~50°C，?；磻?yīng)時間為20 ~35min，通過產(chǎn)物收集器在線收集反應(yīng)液，反應(yīng)液經(jīng)常規(guī)后處理得5 ' -0-棕櫚酰尿苷。2. 如權(quán)利要求1所述的脂肪酶催化在線合成5 ' -0-棕櫚酰尿苷的方法，其特征在于:所 述的方法包括下列步驟:先用一定量的DMS0為溶劑溶解尿苷，再加叔戊醇至一定體積，裝于 注射器中備用；用叔戊醇溶解棕櫚酸乙烯酯至一定體積，裝于另一注射器中備用;然后在注 射栗推動下使原料和反應(yīng)溶劑通入反應(yīng)通道中進行反應(yīng)。3. 如權(quán)利要求1所述的脂肪酶催化在線合成5 ' -0-棕櫚酰尿苷的方法，其特征在于:所 述微流控通道反應(yīng)器包括恒溫箱，所述反應(yīng)通道置于恒溫箱中。4. 如權(quán)利要求2所述的脂肪酶催化在線合成5 ' -0-棕櫚酰尿苷的方法，其特征在于:所 述微流控通道反應(yīng)器包括恒溫箱，所述反應(yīng)通道置于恒溫箱中。5. 如權(quán)利要求1~4之一所述的脂肪酶催化在線合成5 '-0-棕櫚酰尿苷的方法，其特征 在于:所述反應(yīng)溶劑中二甲亞砜與叔戊醇的體積比為1:12~16,所述尿苷與棕櫚酸上乙烯 酯的摩爾比為1:9~11，反應(yīng)體系中尿苷的濃度為0.04~0.06mmol/mL，所述?；磻?yīng)溫度 為20~40°C，所述?；磻?yīng)時間為25~35min。6. 如權(quán)利要求1~4之一所述的脂肪酶催化在線合成5 '-0-棕櫚酰尿苷的方法，其特征 在于:所述反應(yīng)溶劑中二甲亞砜與叔戊醇的體積比為1:14,所述尿苷與棕櫚酸乙烯酯的摩 爾比為1:9，反應(yīng)體系中尿苷的濃度為0.05mmo 1/mL所述?；磻?yīng)溫度為30°C，所述?；?應(yīng)時間為30min。
【文檔編號】C12M1/40GK105838600SQ201610287078
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月29日
【發(fā)明人】羅錫平, 杜理華, 成柄灼
【申請人】浙江農(nóng)林大學(xué)