專利名稱：一種合成利那洛肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥合成領(lǐng)域，具體涉及一種合成利那洛肽的方法。
背景技術(shù)：
利那洛肽(Linaclotide)是一種新型GC-C (腸上皮細(xì)胞尿苷酸環(huán)化酶C)受體激動(dòng)劑，該化合物為14個(gè)氨基酸組成的多肽，通過固相合成技術(shù)得到。利那洛肽可激活腸上皮細(xì)胞頂端表面的GC-C受體，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外環(huán)鳥苷酸增多。其凈效應(yīng)是氯和碳酸氫鹽分泌進(jìn)入腸腔增加，進(jìn)而導(dǎo)致液體分泌增多以及大便通過加速，用于治療成人慢傳輸型便秘和便秘型腸易激綜合征(IBS-C)患者，結(jié)構(gòu)序列為NH2-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-COOH (3 對(duì) 二硫鍵為 1-6、2-10、5-13)。關(guān)于利那洛肽的制備方法，國(guó)內(nèi)外均沒有專利報(bào)道，僅有Miriam等人發(fā)表一篇文獻(xiàn)嘗試了利那洛妝的合成(Optimized Fmoc Solid-Phase Synthesis of theCysteine-Rich Pertide Linaclotide, Published online 4 August 2010 in WileyOnline Library)。文獻(xiàn)中分別采用了三種方法進(jìn)行合成(I)采用Trt為Cys保護(hù)基固相合成線性粗肽，然后在液相中室溫一步氧化得到利那洛肽；(2)分別采用Trt，Acm為Cys保護(hù)基固相合成線性粗肽，然后采用半選擇性策略完成二硫鍵的合成；(3)分別采用Mmt，Acm, Trt或Acm, Trt, pMeOBzlm為Cys保護(hù)基固相合成線性粗肽,然后采用完全選擇性策略完成二硫鍵的合成。但是，方法2、3使用了多種側(cè)鏈脫除和氧化試劑，每一個(gè)步驟必然帶來(lái)雜質(zhì)的增多，因此不利于得到高純度，高收率的產(chǎn)物，也不利于工藝的放大。方法I雖然過程步驟簡(jiǎn)單，只使用了一種保護(hù)基保護(hù)半胱氨酸側(cè)鏈巰基，但是半胱氨酸側(cè)鏈保護(hù)基的選擇是影響利那洛肽合成的關(guān)鍵因素之一，方法I選用的Trt保護(hù)基不利于利那洛肽線性粗肽純度的提高，造成線性粗肽純度較低，往往需要純化才能進(jìn)行利那洛肽3對(duì)二硫鍵的環(huán)化，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。此外，方法I在最后一步的氧化形成利那洛肽粗品過程中，采用GSH (還原性谷胱甘肽)氧化體系進(jìn)行3對(duì)二硫鍵的環(huán)化，但是該氧化體系不能準(zhǔn)確定位3對(duì)二硫鍵的位置，極易造成大量雜質(zhì)的產(chǎn)生，造成利那洛肽粗品純度較低，不利于后續(xù)的純化和總收率。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種合成利那洛肽的方法，使得本發(fā)明所述方法能夠提高利那洛肽線性粗肽純度以及利那洛肽粗品純度和總收率。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案一種合成利那洛肽的方法，包括以下步驟步驟I、固相合成在SEQ ID NO: I所示氨基酸序列N端、Thr側(cè)鏈上、Cys側(cè)鏈上、Asn側(cè)鏈上、Tyr側(cè)鏈上、Glu側(cè)鏈上偶聯(lián)有保護(hù)基以及在C端偶聯(lián)有樹脂固相載體的利那洛肽樹脂，所述Cys側(cè)鏈上偶聯(lián)的保護(hù)基為Mmt保護(hù)基；
步驟2、利那洛肽樹脂裂解脫除所有保護(hù)基和樹脂固相載體得到利那洛肽線性粗肽，然后采用GSH/GSSH氧化體系對(duì)利那洛肽線性粗肽進(jìn)行氧化反應(yīng)，按照其N端到C端的氨基酸順序，形成第I位Cys和第6位Cys的二硫鍵、第2位Cys和第10位Cys的二硫鍵以及第5位Cys和第13位Cys的二硫鍵得到利那洛肽粗品，純化后即得利那洛肽。其中，所述樹脂固相載體優(yōu)選為王樹脂，更優(yōu)選為替代度為I. Ommol/g的王樹脂。GSH/GSSH氧化體系所指為還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化性谷胱甘肽(GSSH)聯(lián)合使用的氧化體系。本發(fā)明采用一步氧化方法制備利那洛肽，避免了不同氧化方法帶來(lái)的雜質(zhì)。同時(shí)，本發(fā)明采用Mmt作為Cys的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)能夠極大的提高線性粗肽的純度，使線性粗肽不經(jīng)過純化直接應(yīng)用于下一步的氧化過程中。而且，采用GSH/GSSH體系能夠極大的降低線性粗肽中的雜質(zhì)，有利于下一步純化過程。在本發(fā)明所述方法中，以利那洛肽線性主鏈N端到C端的氨基酸順序編號(hào)，如下式 NH2-Cysl-Cys2-Glu3-Tyr4-Cys5-Cys6-Asn7-Pro8-Ala9-Cysi0-Thrll-Gly12-Cys13-Tyr14-C00HSEQ ID NO: I所示氨基酸序列即為上式中多肽序列，本發(fā)明在步驟I中固相合成的利那洛肽樹脂是在SEQ ID NO: I所示氨基酸序列基礎(chǔ)上，在其N端、、Thr側(cè)鏈上、Cys側(cè)鏈上、Asn側(cè)鏈上、Tyr側(cè)鏈上、Glu側(cè)鏈上偶聯(lián)有保護(hù)基以及在C端偶聯(lián)有樹脂固相載體。本發(fā)明所述保護(hù)基是在氨基酸合成領(lǐng)域常用的保護(hù)氨基酸主鏈以及側(cè)鏈上氨基、羧基、巰基等干擾合成的基團(tuán)的保護(hù)基團(tuán)，防止氨基、羧基、巰基等在制備目標(biāo)產(chǎn)物過程中發(fā)生反應(yīng)，生成雜質(zhì)。對(duì)于利那洛肽的合成，其Cys側(cè)鏈保護(hù)基的選擇關(guān)系著利那洛肽線性粗肽的純度，保護(hù)基隨意的選擇有可能造成利那洛肽線性粗肽的純度較低，如文獻(xiàn)“Optimized Fmoc Solid-Phase Synthesis of the Cysteine-Rich Pertide Linaclotide,Published online 4 August 2010 in Wiley Online Library” 中公開的第一種方法，按照其記載的方法，所得到的利那洛肽線性粗肽的純度僅為40%左右，可見要提高利那洛肽線性粗肽純度，需要在深入研究利那洛肽合成的基礎(chǔ)上，付出創(chuàng)造性勞動(dòng)，方可找到合適的Cys側(cè)鏈保護(hù)基。而對(duì)于其余需要保護(hù)側(cè)鏈的氨基酸，本發(fā)明優(yōu)選通過Trt保護(hù)基保護(hù)Asn的側(cè)鏈；通過OtBu保護(hù)基保護(hù)Glu的側(cè)鏈；通過tBu保護(hù)基保護(hù)Tyr、Thr的側(cè)鏈。作為優(yōu)選方案，步驟I具體為在活化體系存在下，將N端偶聯(lián)有Fmoc保護(hù)基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有tBu保護(hù)基的Tyr (Fmoc-Tyr (tBu)-0H)與樹脂固相載體偶聯(lián)后脫Fmoc保護(hù)基得到H-Tyr (tBu)-樹脂固相載體，然后按照SEQ ID NO: I所示氨基酸序列C端到N端的順序，依次逐個(gè)將N端偶聯(lián)有Fmoc保護(hù)基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有Mmt保護(hù)基的Cys (Fmoc-Cys (Mmt) -0H)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護(hù)基的Gly (Fmoc-Gly-OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護(hù)基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有tBu保護(hù)基的Thr (Fmoc-Thr (tBu)-0H)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護(hù)基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有Mmt保護(hù)基的 Cys (Fmoc-Cys (Mmt) -OH)> N 端偶聯(lián)有 Fmoc 保護(hù)基的 Ala (Fmoc-Ala-OH)、N 端偶聯(lián)有Fmoc保護(hù)基的Pro (Fmoc-Pro-OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護(hù)基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有Trt保護(hù)基的Asn (Fmoc-Asn (Trt)-0H)、兩個(gè)N端偶聯(lián)有Fmoc保護(hù)基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有Mmt保護(hù)基的Cys (Fmoc-Cys (Mmt) -0H)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護(hù)基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有tBu保護(hù)基的Tyr (Fmoc-Tyr (tBu) -OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護(hù)基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有OtBu保護(hù)基的Glu(Fmoc-Glu (OtBu) -0H)、兩個(gè)N端偶聯(lián)有Fmoc保護(hù)基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有Mmt保護(hù)基的Cys(Fmoc-Cys (Mmt)_0H)進(jìn)行延伸偶聯(lián)，偶聯(lián)完后脫除Fmoc保護(hù)基，得到利那洛肽樹脂(H-Cys(Mmt)-Cys (Mmt)-Glu (OtBu)-Tyr (tBu)-Cys (Mmt)-Cys (Mmt)-Asn (Trt)-Pro-Ala-Cys(Mmt) -Thr (tBu) -Gly-Cys (Mmt) -Tyr (tBu)-樹脂固相載體)。在上述固相合成利那洛肽樹脂的優(yōu)選方案中，所述延伸偶聯(lián)是指在第一個(gè)氨基酸與固相載體偶聯(lián)后，剩余氨基酸按照各自序列的順序逐個(gè)和前一個(gè)偶聯(lián)的氨基酸發(fā)生縮合反應(yīng)(主鏈氨基和羧基的縮合反應(yīng))進(jìn)行偶聯(lián)。在延伸偶聯(lián)中，由于每個(gè)氨基酸N端都有保護(hù)基，因此需要先脫除N端保護(hù)基再偶聯(lián)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知常識(shí)，本發(fā)明優(yōu)選用DBLK脫除N端保護(hù)基。在上述固相合成利那洛肽樹脂的優(yōu)選方案中，進(jìn)一步優(yōu)選，所述H-Tyr (tBu)-樹脂固相載體替代度為O. 4-0. 62mmol/g,最優(yōu)選為O. 5mmol/g。 在上述固相合成利那洛肽樹脂的優(yōu)選方案中，進(jìn)一步優(yōu)選，所述活化體系為HOBt/DMAP/DIP⑶I三體系活化體系或HOBt/DIP⑶I雙體系活化體系。對(duì)于這些多體系的活化體系，其各組分的配比在本領(lǐng)域中是一定的且是公知的，如HOBt/DMAP/DIPCDI三體系活化體系，HOBt:DMAP:DIPCDI 的摩爾比為 12:1:12 ;H0Bt/DIPCDI 雙體系活化體系，HOBt:DIPCDI 的摩爾比為1:1。在上述固相合成利那洛肽樹脂的優(yōu)選方案中，進(jìn)一步優(yōu)選，所述活化體系采用DMF、DCM、NMP和DMSO中任意一種或兩種溶解，更優(yōu)選為，采用體積比DMF = DCM為I: I的混合溶劑溶解。在上述固相合成利那洛肽樹脂的優(yōu)選方案中，進(jìn)一步優(yōu)選，所述樹脂固相載體為王樹脂，更優(yōu)選為替代度為I. Ommol/g的王樹脂。作為優(yōu)選，步驟2所述GSH/GSSH氧化體系中GSH和GSSH的摩爾比為5:1-15:1，更優(yōu)選為10:1，步驟2所述氧化反應(yīng)的pH值為7. 8-8. O,更優(yōu)選為7. 9，步驟2所述氧化反應(yīng)的溫度為0-30°C，更優(yōu)選為5°C。作為優(yōu)選，步驟2所述裂解采用由體積百分比為90-95%的TFA、2_4%的TIS和余量水組成的裂解液裂解，更優(yōu)選為采用由體積百分比為94%的TFA、3%的TIS和3%的水組成的裂解液裂解。作為優(yōu)選，所述裂解液和利那洛肽樹脂的體積質(zhì)量比為IOml :lg。本發(fā)明所述純化可以采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)純化方法，如HPLC純化方法。由本發(fā)明所述方法合成的利那洛肽線性粗肽經(jīng)HPLC檢測(cè)，純度介于75-80%，利那洛肽粗品純度為35-60%，總收率為11_27%，而在相同環(huán)境下利用文獻(xiàn)“OptimizedFmoc Solid-Phase Synthesis of the Cysteine-Rich Pertide Linaclotide, Publishedonline 4 August 2010 in Wiley Online Library”中公開的第一種方法合成，其合成的利那洛肽線性粗肽經(jīng)HPLC檢測(cè)，純度為40%左右，利那洛肽粗品純度為20%左右，總收率不到10%,明顯不如本發(fā)明所述方法。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明所述方法采用Mmt保護(hù)基保護(hù)半胱氨酸側(cè)鏈，采用逐一偶聯(lián)方式合成利那洛肽線性粗肽，最后采用GSH/GSSH氧化體系氧化得到利那洛肽。本發(fā)明所述方法與現(xiàn)有方法相比，提高了線性粗肽純度，可不經(jīng)純化即可進(jìn)行氧化，且所獲得利那洛肽粗品純度和收率也顯著提高。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種合成利那洛肽的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的的化合物和制備方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。在本發(fā)明具體實(shí)施方式
中，所有偶聯(lián)由保護(hù)基的氨基酸均可通過市售獲得，本發(fā)明中的保護(hù)氨基酸購(gòu)自于吉爾生化有限公司，所用王樹脂購(gòu)自于天津南開和成有限公司，申請(qǐng)文件中所用英文縮寫對(duì)應(yīng)的中文含義見表I。表I英文縮寫釋義
權(quán)利要求
1.一種合成利那洛肽的方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟I、固相合成在SEQ ID NO: I所示氨基酸序列N端、Thr側(cè)鏈上、Cys側(cè)鏈上、Asn側(cè)鏈上、Tyr側(cè)鏈上、Glu側(cè)鏈上偶聯(lián)有保護(hù)基以及在C端偶聯(lián)有樹脂固相載體的利那洛肽樹月旨，所述Cys側(cè)鏈上偶聯(lián)的保護(hù)基為Mmt保護(hù)基； 步驟2、利那洛肽樹脂裂解脫除所有保護(hù)基和樹脂固相載體得到利那洛肽線性粗肽，然后采用GSH/GSSH氧化體系對(duì)利那洛肽線性粗肽進(jìn)行氧化反應(yīng)，按照其N端到C端的氨基酸順序，形成第I位Cys和第6位Cys的二硫鍵、第2位Cys和第10位Cys的二硫鍵以及第5位Cys和第13位Cys的二硫鍵得到利那洛肽粗品，純化后即得利那洛肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，步驟I具體為 在活化體系存在下，將N端偶聯(lián)有Fmoc保護(hù)基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有tBu保護(hù)基的Tyr(Fmoc-Tyr (tBu) -0H)與樹脂固相載體偶聯(lián)后脫Fmoc保護(hù)基得到H-Tyr (tBu)-樹脂固相載體，然后按照SEQ ID NO: I所示氨基酸序列C端到N端的順序，依次逐個(gè)將N端偶聯(lián)有Fmoc保護(hù)基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有Mmt保護(hù)基的Cys (Fmoc-Cys (Mmt) -0H)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護(hù)基的Gly (Fmoc-Gly-OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護(hù)基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有tBu保護(hù)基的Thr (Fmoc-Thr (tBu) -0H), N端偶聯(lián)有Fmoc保護(hù)基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有Mmt保護(hù)基的 Cys (Fmoc-Cys (Mmt) -OH)> N 端偶聯(lián)有 Fmoc 保護(hù)基的 Ala (Fmoc-Ala-OH)、N 端偶聯(lián)有Fmoc保護(hù)基的Pro (Fmoc-Pro-OH)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護(hù)基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有Trt保護(hù)基的Asn (Fmoc-Asn (Trt)-0H)、兩個(gè)N端偶聯(lián)有Fmoc保護(hù)基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有Mmt保護(hù)基的Cys (Fmoc-Cys (Mmt) -0H)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護(hù)基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有tBu保護(hù)基的Tyr (Fmoc-Tyr (tBu) -0H)、N端偶聯(lián)有Fmoc保護(hù)基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有OtBu保護(hù)基的Glu(Fmoc-Glu (OtBu) -0H)、兩個(gè)N端偶聯(lián)有Fmoc保護(hù)基以及側(cè)鏈偶聯(lián)有Mmt保護(hù)基的Cys(Fmoc-Cys (Mmt)_0H)進(jìn)行延伸偶聯(lián)，偶聯(lián)完后脫除Fmoc保護(hù)基，得到利那洛肽樹脂(H-Cys(Mmt)-Cys (Mmt)-Glu (OtBu)-Tyr (tBu)-Cys (Mmt)-Cys (Mmt)-Asn (Trt)-Pro-Ala-Cys(Mmt) -Thr (tBu) -Gly-Cys (Mmt) -Tyr (tBu)-樹脂固相載體)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，所述H-Tyr(tBu)-樹脂固相載體替代度為O.4-0. 62mmol/g0
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，所述活化體系為HOBt/DMAP/DIPCDI三體系活化體系或HOBt/DIP⑶I雙體系活化體系。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，所述活化體系采用DMF、DCM、NMP和DMSO中任意一種或兩種溶解。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，所述樹脂固相載體為王樹脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，步驟2所述GSH/GSSH氧化體系中GSH和GSSH的摩爾比為5:1-15:1。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，步驟2所述氧化反應(yīng)的pH值為7.8-8. O。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，步驟2所述氧化反應(yīng)的溫度為0-30°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，步驟2所述裂解采用由體積百分比為90-95%的TFA、2-4%的TIS和余量水組成的裂解液裂解。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥合成領(lǐng)域，公開了一種合成利那洛肽的方法。本發(fā)明所述方法固相合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端、Thr側(cè)鏈上、Cys側(cè)鏈上、Asn側(cè)鏈上、Tyr側(cè)鏈上、Glu側(cè)鏈上偶聯(lián)有保護(hù)基以及在C端偶聯(lián)有樹脂固相載體的利那洛肽樹脂，裂解脫除保護(hù)基和樹脂固相載體后用GSH/GSSH氧化體系進(jìn)行氧化反應(yīng)，得到利那洛肽粗品，純化后即得利那洛肽。本發(fā)明所述方法采用Mmt保護(hù)基保護(hù)半胱氨酸側(cè)鏈，用逐一偶聯(lián)方式合成利那洛肽線性粗肽，最后采用GSH/GSSH氧化體系氧化得到利那洛肽，與現(xiàn)有方法相比，提高了線性粗肽純度，可不經(jīng)純化即可進(jìn)行下步氧化步驟，且所獲得利那洛肽粗品純度和收率也顯著提高。
文檔編號(hào)C07K1/04GK102875655SQ20121037524
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者宓鵬程, 潘俊鋒, 馬亞平, 袁建成 申請(qǐng)人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司