菌株及其應(yīng)用，以及疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及菌株及其應(yīng)用，W及疫苗及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 毛皮動(dòng)物主要指產(chǎn)品為制裘原料的動(dòng)物。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人們生活水平的提高 和需求的不斷增長(zhǎng)，中國(guó)毛皮業(yè)呈現(xiàn)出強(qiáng)勁的發(fā)展趨勢(shì)。我國(guó)毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)主要集中在 山東、河北、迂寧和黑龍江等地，養(yǎng)殖的品種主要有水貂、駱、狐、懶兔，年產(chǎn)水貂皮600萬(wàn)張、 狐貍皮200萬(wàn)張，其中狐貍皮占世界總產(chǎn)量的35%，水貂皮占世界總產(chǎn)量的12%。經(jīng)過(guò)多年 的發(fā)展和積累，毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖已成為一項(xiàng)優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)，我國(guó)已成為世界上最大的毛皮產(chǎn)品生 產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)，它的發(fā)展不僅為國(guó)家賺取了大量外匯，還直接帶動(dòng)了農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，促進(jìn) 了農(nóng)民增收，局部地區(qū)甚至已成為區(qū)域經(jīng)濟(jì)的支柱性產(chǎn)業(yè)，對(duì)推動(dòng)農(nóng)"經(jīng)濟(jì)發(fā)展起到了 重要的作用。
[0003] 水貂出血性肺炎是由銅綠假單胞菌引起水貂的一種急性傳染病，多發(fā)生于秋季溫 暖潮濕，W咳嗽、呼吸困難、吐血、鼻出血為臨床特癥、W肺大面積出血、肺肝樣變、肺水腫為 主要病變特征，發(fā)病率為20 %-50 %，死亡率為100%。病貂發(fā)病急，死亡快，常呈地方性暴發(fā) 性流行。近年來(lái)由于水貂養(yǎng)殖規(guī)模和集約化程度明顯提高，水貂出血性肺炎的發(fā)病率顯著 上升，該病危害程度逐年加深，已成為危害我國(guó)水貂養(yǎng)殖的主要傳染病之一。
[0004] 鑒于該病的發(fā)病特點(diǎn)及該菌易產(chǎn)生耐藥性問(wèn)題，用藥物治療該病往往很困難，滅 活疫苗是預(yù)防該病的最有效方法，將水貂中流行的血清型的菌株滅活后制備成多價(jià)滅活疫 苗，可有效預(yù)防同類血清型菌株引起的該病，"水貂銅綠假單胞菌分離株的生物學(xué)特性比較 分析和血清型調(diào)查"（白雪，柴秀麗，國(guó)喜軍，高哈，張海玲，趙建軍，張蕾，邵西群，羅國(guó)良，王 長(zhǎng)鳳'水貂出血性肺炎二價(jià)滅活疫苗及其制備方法"（專利號(hào)：ZL201010203879.1，國(guó)喜 軍、白雪、柴秀麗、羅國(guó)良、趙建軍、張海玲、邵西群、張蕾、高哈，）公開了我國(guó)引起水貂出血 性肺炎的銅綠假單胞菌的主要血清型為G型和B型，并利用運(yùn)巧巾血清型菌株化15(國(guó)家菌種 保藏號(hào)CGMCC NO. 3811)和化08(國(guó)家菌種保藏號(hào)CGMCC NO. 3812)研制出了可用于預(yù)防水貂 出血性肺炎的二價(jià)滅活疫苗，2011年該產(chǎn)品獲得了農(nóng)業(yè)部的臨床試驗(yàn)批件，并同時(shí)進(jìn)行了 臨床推廣應(yīng)用。2016年獲得了國(guó)家新獸藥證書(=類）。
[0005] 水貂病毒性腸炎是水貂腸炎細(xì)小病毒(Mink enteritis parvovirus ,MEV)引起的 W劇烈腹瀉為主要臨床特癥的急性烈性、高度接觸性傳染病，其死亡率高達(dá)80% W上，該病 在世界范圍內(nèi)廣泛流行，在自然條件下，不同品種和不同年齡的貂均有感染性，但幼貂的感 染性極強(qiáng)，隨著特種養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，病毒性腸炎已經(jīng)成為危害水貂養(yǎng)殖的=大疫病之一，給 養(yǎng)貂業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，1947年由加拿大學(xué)者Schofield最早發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了 MEV引起的 疾病。1981年姜廷秀等首先報(bào)道了我國(guó)發(fā)生水貂病毒性腸炎，此后該病逐漸蔓延全國(guó)，給養(yǎng) 貂業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我單位吳威等用單克隆抗體對(duì)我國(guó)分離的水貂腸炎細(xì)小病毒進(jìn) 行系統(tǒng)分型，確定我國(guó)水貂腸炎細(xì)小病毒主要由B型細(xì)小病毒引起，在此基礎(chǔ)上選育出毒力 穩(wěn)定、免疫原性良好的病毒株MEVB株，并研制出水貂細(xì)小病毒滅活疫苗，2010年獲得了國(guó)家 新獸藥證書(=類），并迅速在市場(chǎng)上應(yīng)用。使該病得到較好的控制。
[0006] 目前國(guó)內(nèi)還未有水貂細(xì)小病毒性腸炎、水貂出血性肺炎的二聯(lián)疫苗，市場(chǎng)上也無(wú) 該種二聯(lián)苗使用。而使用單苗需要對(duì)水貂進(jìn)行多次免疫，免疫劑量大，免疫程序繁瑣，增加 了人力、物力和財(cái)力成本，同時(shí)還易引起水貂的應(yīng)激反應(yīng)。
[0007] 本項(xiàng)目在研究成功水貂細(xì)小病毒性腸炎和水貂出血性肺炎的基礎(chǔ)上開發(fā)"一針?lè)?兩病"的水貂細(xì)小病毒性腸炎和出血性肺炎二聯(lián)滅活疫苗，技術(shù)上攻克了聯(lián)苗中的兩種成 分細(xì)小病毒和銅綠假單胞菌的抗原成分互相干擾、疫苗含量配比及生產(chǎn)工藝的問(wèn)題。本研 究在水貂出血性肺炎二價(jià)滅活疫苗研制的基礎(chǔ)上，在疫苗株中新加入了近幾年出現(xiàn)的流行 株I型、C型和F型，制備為水貂出血性肺炎五價(jià)滅活疫苗(G型、B型、I型、C型和F型），能夠?qū)?水貂出血性肺炎新的血清型菌株的流行起到很好的預(yù)防作用，可解決國(guó)內(nèi)原有疫苗的對(duì)該 病只能提供部分保護(hù)的問(wèn)題，更為有效預(yù)防水貂出血性肺炎的發(fā)生。
[0008] 通過(guò)對(duì)二聯(lián)疫苗的研制及關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新，研制出一種高效、副作用小、市場(chǎng)推廣可 行的二聯(lián)苗，解決了單苗免疫程序上的復(fù)雜問(wèn)題，滿足行業(yè)和養(yǎng)殖戶的迫切需求，具有廣闊 的市場(chǎng)應(yīng)用前景。
[0009] 現(xiàn)有技術(shù)是用轉(zhuǎn)瓶通氣的培養(yǎng)技術(shù)將運(yùn)兩株銅綠假單胞菌用PYG培養(yǎng)基增菌培 養(yǎng)，37°C 18化/m搖床培養(yǎng)12h后收菌，用細(xì)菌平板計(jì)數(shù)法測(cè)定兩株菌的菌量分別達(dá)到40X IO8CFlVml，將G型菌株和B型菌株按2:1的比例混合；（1)用終濃度為0.15%的甲醒溶液對(duì)銅 綠假單胞菌進(jìn)行滅活，于37°C滅活2地，期間振搖2~3次；（2)將滅活后的菌液加20%比例的 氨氧化侶膠，混勻后即可得到水貂銅綠假單胞菌多價(jià)滅活疫苗。原有的培養(yǎng)基:PYG培養(yǎng)基 成份:蛋白腺2%，葡萄糖1 %，氯化鋼0.5%，酵母粉0.3%，用去離子水配制，配完調(diào)pH值7.2 ~7.4,116°C 30min。但是使用轉(zhuǎn)瓶通氣培養(yǎng)菌體，接種比例為3%~4%，通氣培養(yǎng)12~ 15h，由于疫苗的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝落后，轉(zhuǎn)瓶數(shù)目較多接菌時(shí)易于污染，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，生產(chǎn)菌數(shù) 少，在20~40億CRJ/ml之間，只適用于疫苗研制前期的小批量生產(chǎn)。
[0010] 選用銅綠假單胞菌的當(dāng)前主要流行血清型G、B型和肺炎克雷伯菌Kl型3種菌株制 備成滅活疫苗。免疫了 WlO%滅活肺炎克雷伯困為佐劑的疫苗，保護(hù)率為83% ;免疫了 W 10%A1(0H)3佐劑的疫苗，保護(hù)率為71%;而作為空白對(duì)照組，僅注射了生理鹽水的第6組小 鼠的存活率為33%。相對(duì)于傳統(tǒng)的A1(0H)3佐劑，肺炎克雷伯菌本身可W作為疫苗成分，保 護(hù)機(jī)體免于該病原菌的感染，同時(shí)又兼有良好的免疫調(diào)節(jié)活性，加強(qiáng)了機(jī)體對(duì)銅綠假單胞 菌的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生了更高的抗體水平和提供了更好的免疫保護(hù)，獸醫(yī)臨床具有一定的應(yīng) 用價(jià)值。
[0011] W上幾種研制的水貂出血性肺炎中使用的疫苗株血清型主要包含2種或3種，即G 型，B型，或G型、C型、I型，根據(jù)本單位進(jìn)行的水貂出血性肺炎流行病學(xué)調(diào)查，2010年至2015 年的流行血清型新出現(xiàn)了F型、I型和C型，而由于各種流行血清型之間的交叉保護(hù)率低，大 約為20%-30%。所W有必要加入所有可能的流行血清型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 有鑒于此，本發(fā)明提供了菌株及其應(yīng)用，W及疫苗及其制備方法。該疫苗免疫期為 6個(gè)月，免疫保護(hù)率80% W上，可同時(shí)用于預(yù)防水貂細(xì)小病毒性腸炎和水貂出血性肺炎的， 減少了養(yǎng)殖戶的免疫工作量和水貂應(yīng)激反應(yīng)，市場(chǎng)應(yīng)用前景較好。
[0013] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供W下技術(shù)方案：
[0014] 本發(fā)明提供了 一種銅綠假單胞菌株，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 11988。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種銅綠假單胞菌株，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 11990。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種銅綠假單胞菌株，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 11989。
[0017] 本發(fā)明還提供了保藏編號(hào)為CGMCC No. 11988、CGMCC No. 11990和CGMCC No. 11989 的銅綠假單胞菌株在制備水貂出血性肺炎疫苗中的應(yīng)用。
[001 引本發(fā)明還提供了保藏編號(hào)為CGMCC No. 11988、CGMCC No. 11990和CGMCC No. 11989 的銅綠假單胞菌株在制備水貂細(xì)小病毒性腸炎、出血性肺炎二聯(lián)滅活疫苗中的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明提供了一種水貂出血性肺炎疫苗，由本發(fā)明保藏編號(hào)為CGMCC No. 11988、 CGMCC No. 11990和CGMCC No. 11989的銅綠假單胞菌株W及水貂銅綠假單胞菌G型化15株、B 型化08株制得。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種水貂細(xì)小病毒性腸炎、出血性肺炎的二聯(lián)滅活疫苗，由本發(fā) 明保藏編號(hào)為CGMCC No. 11988、CGMCC No. 11990和CGMCC No. 11989的銅綠假單胞菌株W及 水貂銅綠假單胞菌G型化15株、B型化08株和水貂細(xì)小病毒毒株MEVB株制得。
[0021] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，二聯(lián)滅活疫苗的制備方法包括如下步驟：
[0022] 步驟 1:取本發(fā)明保藏編號(hào)為CGMCC No.11988、CGMCC No.11990和CGMCC No.11989 的銅綠假單胞菌株W及水貂銅綠假單胞菌G型DL15株、B型化08株分別接種于培養(yǎng)基培養(yǎng)后 混合、滅活后制得滅活后銅綠假單胞菌五價(jià)苗半成品菌液；
[0023] 步驟2:取水貂細(xì)小病毒毒株MEVB株接種細(xì)胞，收獲、滅活制得細(xì)小病毒半成品；
[0024] 步驟3:取步驟1制得的滅活后銅綠假單胞菌五價(jià)苗半成品菌液與步驟2制得的細(xì) 小病毒半成品混合制得混合液；
[0025] 步驟4:取步驟3制得的混合液與佐劑混合。
[0026] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，