專利名稱：一株產(chǎn)菊粉酶細(xì)菌的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所屬微生物種類開發(fā)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一株產(chǎn)菊粉酶細(xì)菌的篩選和鑒定研究，適合工業(yè)化應(yīng)用。
背景技術(shù)：
菊粉(Inulin)又名菊糖，源自于菊芋塊根，是一種天然果糖聚合物，由D-呋喃果糖分子以β_(2，1)糖苷鍵連接而成的果聚糖。每個(gè)菊粉分子末端以α-(1，2)糖苷鍵連接一個(gè)葡萄糖殘基，聚合度通常為2-60，平均聚合度為10，其中聚合度較低時(shí)(Dp = 2-9)則可稱為低聚果糖。作為一種天然可溶性膳食纖維，菊粉幾乎不被胃酸水解和消化，而在結(jié)腸中被大量有益微生物發(fā)酵，因而具備多種保健功能，如控制血脂、降低血糖、改善腸道功能、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收等。菊粉不僅可以作為脂肪替代品應(yīng)用于低能量食品生產(chǎn)，而且具有膳食纖維以及益生素的生理功能，是一種優(yōu)秀的功能性食品基料。目前，菊粉廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健業(yè)、食品工業(yè)等領(lǐng)域。。菊粉酶(Inulinase)是能夠水解β _2，1_D_果糖苷鍵的一類酶，學(xué)名為β _2，1-D-果聚糖酶。它主要來源于菊科植物的組織和部分微生物。來源于植物的菊粉酶，其底物專一性較強(qiáng)，僅作用于菊粉；而由微生物產(chǎn)生的菊粉酶大部分都能水解含有β _2，I呋喃果糖苷健的糖，如菊糖、蔗糖和棉子糖，小部分僅能水解菊糖。菊粉酶按其水解果糖苷鍵的方式不同，可分為內(nèi)切和外切兩類。外切菊粉酶(EC 3.2.1.80)作用于菊粉鏈果糖末端的糖苷鍵，逐一水解釋放出果糖，直至最后的葡萄糖，主要產(chǎn)物為果糖；內(nèi)切菊粉酶(EC
3.2.1.7)僅作用于菊粉，隨機(jī)斷開菊粉鏈內(nèi)部的糖苷鍵，水解產(chǎn)物主要是菊粉型的低聚三糖、四糖和五糖。因此可通過菊粉酶的催化作用，以菊粉為原料，生產(chǎn)高果糖漿、低聚果糖、乙醇、丙酮-丁醇或琥珀酸等產(chǎn)品。這些產(chǎn)品由于具有廣闊的應(yīng)用前景，促使國外很多學(xué)者從20世紀(jì)80年代就開始深入開展菊粉酶的研究。毫無疑問，微生物合成是生產(chǎn)大量的工業(yè)用酶的唯一方法，30年來許多學(xué)者致力于尋找生產(chǎn)菊粉酶的最好微生物，尤其是日本、韓國和歐洲在這方面積累了豐富資料。我國關(guān)于菊粉酶的研究始于20世紀(jì)90年代，主要研究集中于菌株篩選和酶學(xué)性質(zhì)方面，并且正日益受到人們的重視。但目前能在工業(yè)中應(yīng)用的產(chǎn)菊粉酶的菌株篩選和發(fā)酵研究進(jìn)展比較緩慢，因此選育優(yōu)良的產(chǎn)菊粉酶菌株和發(fā)酵條件是菊芋生產(chǎn)乙醇工程的核心環(huán)節(jié)。我們從從自然界中選育得到了一株高產(chǎn)菊粉酶的細(xì)菌菌株，目前還沒對(duì)該菌株產(chǎn)菊粉酶進(jìn)行相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
1.本發(fā)明涉及一株產(chǎn)菊粉酶細(xì)菌的制備，其特征在產(chǎn)菊粉酶細(xì)菌的制備方法，包括以下過程:步驟(一):在濱海鹽堿地菊芋生長的根際土壤，加入適量菊粉誘菌20天；步驟(二): 取步驟(一)土壤5克于內(nèi)置50毫升無菌蒸懼水燒杯中，160r/min搖床震蕩分散20分鐘；步驟(三):取步驟(二 )稀釋液0.2毫升涂布于篩選培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)5天，利用透明圈法初篩出菊粉酶活力較高的菌株，平板劃線方法純化培養(yǎng)，移入斜面保藏；步驟(四):將步驟(三)純化后菌種接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天，進(jìn)行復(fù)篩；步驟(五):挑取步驟(四)中的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，30°C、160r/min搖振培養(yǎng)6d，提取菌株的總DNA作為模板，利用通用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，純化；步驟(六):將步驟(五)純化后的PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)公司測序。將測得的核苷酸序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行Blast比對(duì)，獲取與試驗(yàn)菌16S rDNA基因序列相似度高的菌種。采用ClustalW進(jìn)行多序列比對(duì)得出菌名；步驟(七):鑒定后的菌種保存?zhèn)溆谩?.根據(jù)本發(fā)明所述1，該菌株的16S rDNA序列長度為1455bp，產(chǎn)菊粉酶的該菌為巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)。3.根據(jù)本發(fā)明所述1，該菌株產(chǎn)菊粉酶的最佳發(fā)酵條件是:菊粉30.0g/L，酵母膏7.0g/L, NaCl 5.0, K2HPO4.3Η203.0g/L,初始 ρΗ6.0, 250mL 發(fā)酵三角瓶裝液量為 50mL,在30°C，160r/min 振蕩培養(yǎng) 2d。


圖1是BI菌株16S rDNA分子生物鑒定結(jié)果圖，圖2是不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)菊粉酶活力的影響圖，圖3是不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)菊粉酶活力的影響圖，圖4是初始pH對(duì)菌株產(chǎn)菊粉酶活力的影響圖，圖5是培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)菊粉酶活力的影響圖，圖6不同裝液量對(duì)菌株產(chǎn)菊粉酶活力的影響圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的涉及一株產(chǎn)菊粉酶細(xì)菌的制備包括以下實(shí)施例，下面的實(shí)施例可進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1:產(chǎn)高活力菊粉酶細(xì)菌的篩選I材料和方法1.1 材料1.1.1分離試樣山東威海濱海鹽堿地菊芋生長的根際土壤，加入適量菊粉誘菌20d。1.1.2主要試劑及儀器菊粉，化學(xué)純，廣州澤鈺生物科技有限公司；3，5- 二硝基水楊酸，化學(xué)純，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；智能生化培養(yǎng)箱，寧波海曙萊特儀器廠；恒溫振蕩器，江蘇省金壇市醫(yī)療器械儀器廠；721分光光度計(jì)，北京市六一儀器廠。1.2培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)基(g/L):菊粉10.0, MgSO4.7Η200.5，NaNO3L 5，ΝΗ4Η2Ρ042.0, KCl 0.5，F(xiàn)eSO4.7Η2040.1，K2HPO4L 0，瓊脂 20.0，初始 ρΗ6.0。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):菊粉20.0、酵母膏 5.0、NaCl5.(KK2HPO4.3Η203.0，初始 ρΗ6.0。
PDA培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯(去皮，切碎)200.0，葡萄糖20.0，瓊脂20.0，pH自然。斜面培養(yǎng)基:查氏培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基在配置完成后，均需115°C高壓滅菌30min。1.3菊粉酶活力測定3,5- 二硝基水楊酸法(DNS比色法):取0.5ml粗酶液，加人4ml用0.lmol/L,pH5.0的醋酸緩沖液配制的2%的菊粉溶液，50°C水浴中反應(yīng)20min。沸水浴中5分鐘終止反應(yīng)。取反應(yīng)液0.5ml加人1.5mlDNS混勻，沸水浴中反應(yīng)5min，迅速冷卻并稀釋至20ml，在540nm處，用分光光度計(jì)測定其吸光度A，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算生成的還原糖含量[3]。菊粉酶活力單位定義為:在 上述條件下,每分鐘生成Iumol還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位(U)。1.4產(chǎn)菊粉酶菌株的篩選1.4.1分離、初篩分組取土壤5g于內(nèi)置50ml無菌蒸懼水的250ml錐形瓶中，30°C, 160r/min搖床20min。取稀釋液0.2毫升涂布于篩選培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)5天，利用透明圈法初篩出菊粉酶活力較高的菌株，平板劃線方法純化培養(yǎng)，移入斜面保藏；1.4.2 純化將分離、初篩后所得的菌株利用平板劃線方法分離純化，并重復(fù)進(jìn)行多次分離，肯定為純種菌后作為鑒定實(shí)驗(yàn)用的菌源。1.4.3 復(fù)篩(I)菌懸液制備:挑取一接種環(huán)菌體于50ml無菌生理鹽水，充分均勻備用。(2)發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)基裝量為50ml的250ml錐形瓶中加入以上菌懸液2ml，30°C發(fā)酵培養(yǎng)3天。(3)粗酶液制備:取發(fā)酵液于4000r/min離心lOmin，上清液即為粗酶液。進(jìn)而進(jìn)行酶活測定，篩選出酶活較高的菌株。1.5菊粉酶性質(zhì)的測定通常用Ι/S的大小來區(qū)分內(nèi)切型菊粉酶和外切型菊粉酶，I是以菊粉作底物時(shí)的酶活，即菊粉酶酶活力；S是以蔗糖作底物時(shí)的酶活，即轉(zhuǎn)化酶酶活力。測定篩得酶對(duì)2%的菊粉溶液的活性和2%蔗糖溶液的活性，計(jì)算出Ι/S值。一般認(rèn)為當(dāng)I/S > 10時(shí)，酶表現(xiàn)為內(nèi)切活性；I/S < 10時(shí)，表現(xiàn)為外切酶活性。2結(jié)果與討論2.1菌株篩選2.1.1初篩與純化通過“透明圈”法篩選產(chǎn)菊粉酶活力較高的菌株，經(jīng)平板劃線純化培養(yǎng)得到產(chǎn)酶活力較高的15株菌。2.1.2 復(fù)篩將初篩得到的15株菌經(jīng)進(jìn)一步進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，得到產(chǎn)酶活力相對(duì)較高的菌4株，經(jīng)初步鑒定均為桿菌類。得到產(chǎn)菊粉酶活力見表I。表I細(xì)菌產(chǎn)菊粉酶活力(U/mL)
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一株產(chǎn)菊粉酶細(xì)菌的制備，其特征在產(chǎn)菊粉酶細(xì)菌的制備方法，包括以下過程: 步驟(一):在濱海鹽堿地菊芋生長的根際土壤，加入適量菊粉誘菌20天； 步驟(二):取步驟(一)土壤5克于內(nèi)置50毫升無菌蒸懼水燒杯中，160r/min搖床震蕩分散20分鐘； 步驟(三):取步驟(二)稀釋液0.2ml涂布于篩選培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)5天，利用透明圈法初篩出菊粉酶活力較高的菌株，平板劃線方法純化培養(yǎng)，移入斜面保藏； 步驟(四):將步驟(三)純化后菌種接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天，進(jìn)行復(fù)篩； 步驟(五):挑取步驟(四)中的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，30°C、160r/min搖振培養(yǎng)6d，提取菌株的總DNA作為模板，利用通用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，純化； 步驟(六):將步驟(五)純化后的PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)公司測序。將測得的核苷酸序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行Blast比對(duì)，獲取與試驗(yàn)菌16S rDNA基因序列相似度高的菌種。采用ClustalW進(jìn)行多序列比對(duì)得出菌名； 步驟(七):鑒定后的菌種保存?zhèn)溆谩?br> 2.根據(jù)本發(fā)明所述1，該菌株的16SrDNA序列長度為1455bp，產(chǎn)菊粉酶的該菌為巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)。
3.根據(jù)本發(fā)明所述1，該菌株產(chǎn)菊粉酶的最佳發(fā)酵條件是:菊粉30.0g/L，酵母膏7.0g/L，NaCl 5.0, K2H PO4.3H203.0g/L，初始 ρΗ6.0，250mL 發(fā)酵三角瓶裝液量為 50mL，在 30°C，160r/min振蕩培養(yǎng)2d。
全文摘要
本發(fā)明所屬微生物種類開發(fā)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一株產(chǎn)菊粉酶細(xì)菌的制備和發(fā)酵方法在濱海鹽堿地菊芋生長的根際土壤，加入適量菊粉誘菌20天，取土壤5克于內(nèi)置50毫升無菌蒸餾水燒杯中，震蕩分散20分鐘；取稀釋液0.2毫升涂布于篩選培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)5天，利用透明圈法初篩出菊粉酶活力較高的菌株，平板劃線方法純化；然后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)6d，提取菌株的總DNA送上海生工生物技術(shù)公司測序；將測得的核苷酸序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行Blast比對(duì)，獲取與試驗(yàn)菌16S rDNA基因序列相似度高的菌種，采用ClustalW進(jìn)行多序列比對(duì)得該菌為巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)；該菌株產(chǎn)菊粉酶的最佳發(fā)酵條件是菊粉30.0g/L，酵母膏7.0g/L，NaCl5.0，K2HPO4·3H2O3.0g/L，pH6.0，250mL發(fā)酵三角瓶裝液量為50毫升，在30℃，160r/min振蕩培養(yǎng)2天。
文檔編號(hào)C12R1/11GK103232956SQ20131012849
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月4日
發(fā)明者朱啟忠, 張揚(yáng), 張瑞 申請人:山東大學(xué)(威海)