一種新型多房棘球蚴亞單位疫苗的設(shè)計(jì)、制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種新型多房棘球蚴亞單位疫苗，其活性成分是一條多肽，主要由多房棘球蚴的表面抗原Emy162以及黏膜免疫佐劑霍亂毒素B亞基(CTB)構(gòu)成。本發(fā)明主要通過(guò)基因合成技術(shù)合成多房棘球蚴表面抗原Emy162基因序列，然后將該基因與霍亂毒素B亞基的基因序列相偶聯(lián)，形成一個(gè)融合基因。利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)該融合基因，經(jīng)蛋白純化后，獲得多房棘球蚴亞單位疫苗。該多房棘球蚴亞單位疫苗能夠誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)多房棘球蚴T細(xì)胞及B細(xì)胞免疫應(yīng)答和高滴度特異性抗體體液免疫應(yīng)答，可用于預(yù)防和治療多房棘球蚴感染相關(guān)性疾病。
【專利說(shuō)明】
一種新型多房棘球蚴亞單位疫苗的設(shè)計(jì)、制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及到一種新型多房棘球蝴亞單位疫苗的設(shè)計(jì)制 備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 多房棘球蝴(Alveolar Echinococcosis)導(dǎo)致泡型棘球蝴病，多房棘球蝴在中間 宿主肝內(nèi)以出芽的方式生長(zhǎng)或浸潤(rùn)式增殖，產(chǎn)生新囊泡，長(zhǎng)入肝組織，囊壁外角皮層很薄且 常不完整，囊體與周圍組織間無(wú)明顯界限，囊液持續(xù)滲漏可與肝組織接觸，引起局部肝組織 病變、增生、肝纖維化、萎縮、變性和壞死，，晚期似肝癌樣轉(zhuǎn)移能轉(zhuǎn)移至肺、腦、乳腺等臟器， 素有"蟲(chóng)癌"之稱，預(yù)后極差。世界范圍內(nèi)北半球高海拔地區(qū)為泡型棘球蝴病的高發(fā)區(qū)域。我 國(guó)三江源地區(qū)是多房棘球蝴病的世界罕見(jiàn)高發(fā)地區(qū)。多房棘球蝴病具有發(fā)病范圍廣、惡性 程度高、早期診斷難、預(yù)后效果差、術(shù)后易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)。目前針對(duì)多房棘球蝴病尚無(wú)令人滿 意的治療策略。大多數(shù)牧區(qū)患者出現(xiàn)癥狀時(shí)才就醫(yī)，而病情往往已至晚期，喪失手術(shù)機(jī)會(huì)， 即使進(jìn)行肝部分或半葉切除，術(shù)后復(fù)發(fā)率也很高。甲苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑等抗生素療法有一 定的治療效果，但是由于需長(zhǎng)期連續(xù)治療導(dǎo)致耐藥性的出現(xiàn)及治療后復(fù)發(fā)率高等缺限。 [0003]表面抗原是刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的基本功能單位，很多表面抗原可以用作疫苗 的研發(fā)。而亞單位疫苗基于表面抗原而制備，具有獨(dú)特的疫苗設(shè)計(jì)思路，是研制預(yù)防和治療 感染性疾病、惡性腫瘤和自身免疫性疾病等疫苗的新方向。亞單位疫苗具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1) 亞單位疫苗減少或消除了常規(guī)活疫苗或滅活疫苗難以去除的熱原、變應(yīng)原及其它有害的反 應(yīng)原;且由于亞單位疫苗不能在體內(nèi)復(fù)制，對(duì)宿主沒(méi)有致病風(fēng)險(xiǎn)，是最具安全性和穩(wěn)定性 的一種基因工程疫苗。（2)亞單位疫苗只含有病原體的一種或幾種只產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答 所必需的免疫原成分，而不含有病原體其他遺傳信息，故不含有感染性組分，因而無(wú)須滅 活，也無(wú)致病性，具有很好的穩(wěn)定性。（3)亞單位疫苗可采用大腸桿菌、酵母菌等原核表達(dá)系 統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。故亞單位疫苗產(chǎn)量很高，易純化，便于工業(yè)化生產(chǎn)。在多房棘球蝴疫苗研究領(lǐng) 域，亞單位疫苗與其他疫苗相比，同樣具有很大優(yōu)勢(shì)，既可激發(fā)更高特異性的抗多房棘球蝴 抗體，又可防止疫苗免疫引起的一些自身免疫性疾病，具有更高的免疫針對(duì)性和安全性。
[0004] 對(duì)于多房棘球蝴抗原的尋找一直是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一，現(xiàn)階段包蟲(chóng)病研究主要 集中在包蟲(chóng)病診斷抗原，對(duì)預(yù)防、抑制多房棘球蝴感染的抗原研究還較少;加之多房棘球蝴 感染宿主的免疫逃逸機(jī)制復(fù)雜，目前還未形成對(duì)多房棘球蝴的免疫治療方式。研究發(fā)現(xiàn) Emyl62具有很強(qiáng)的免疫作用，并穩(wěn)定表達(dá)于棘球蝴生命周期的各階段(原頭節(jié)、培養(yǎng)的棘球 蝴、未成熟成蟲(chóng)與成熟成蟲(chóng)），在棘球蝴的粘附及運(yùn)動(dòng)生理學(xué)中發(fā)揮重要的作用。
[0005] 本課題擬將多房棘球蝴的表面抗原Emyl62與黏膜免疫佐劑霍亂毒素 B亞基進(jìn)行基 因融合，經(jīng)原核系統(tǒng)表達(dá)純化得到亞單位疫苗CTB-Emy 162，免疫BALB/C小鼠，使用脾淋巴細(xì) 胞增殖、特異性ELISA等方法確證亞單位疫苗的免疫原性及免疫特異性。
[0006] 本發(fā)明的思路如下:根據(jù)機(jī)體對(duì)多房棘球蝴的免疫保護(hù)性機(jī)制，篩選出具有良好 免疫原性的多房棘球蝴表面抗原Emy-162,利用分子生物學(xué)技術(shù)與黏膜免疫佐劑霍亂毒素 B 亞基(CTB)相偶聯(lián)，設(shè)計(jì)出一個(gè)科學(xué)合理、結(jié)構(gòu)新穎的多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62。 利用小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖、ELISA等多種免疫學(xué)方法檢測(cè)多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62的免疫原性和免疫特異性。研究表明多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62能夠激發(fā) BALB/c小鼠產(chǎn)生的T細(xì)胞、B細(xì)胞免疫應(yīng)答和有效抑制多房棘球蝴活性的高滴度特異性抗 體，具有很好的免疫原性和免疫特異性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供了一種新型多房棘球蝴亞單位疫苗。
[0008] 本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供了多房棘球蝴亞單位疫苗的制備方法。
[0009] 本發(fā)明的第三個(gè)方面是公布了多房棘球蝴亞單位疫苗的用途。
[0010] 本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供了一種針對(duì)多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62。該多 房棘球蝴亞單位疫苗主要由Emyl62和霍亂毒素 B亞基構(gòu)成，多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62的整體氨基酸序列如(序列1)所示，表面抗原Emyl62的氨基酸序列如(序列3)所示。 [0011]本發(fā)明的新型多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62具有以下優(yōu)點(diǎn)：（l)Emyl62是多 房棘球蝴表面抗原，被公認(rèn)為是多房棘球蝴疫苗的理想候選抗原能夠取得良好的保護(hù)作 用。多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62能夠引起T細(xì)胞及B細(xì)胞免疫應(yīng)答和特異性抗體體 液免疫應(yīng)答。（3)Emy 162抗原表位肽的分子量很小，免疫原性很低，本發(fā)明的多房棘球蝴亞 單位疫苗CTB-Emyl62采取"偶聯(lián)分子內(nèi)免疫佐劑"的設(shè)計(jì)思路來(lái)增強(qiáng)表面抗原Emyl62的免 疫原性，從而誘發(fā)高滴度的特異性抗體產(chǎn)生。
[0012] 本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供多房棘球蝴亞單位疫苗的制備方法，其技術(shù)路線詳述 如下： (1)新型多房棘球蝴亞單位疫苗抗原分子的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì) 根據(jù)機(jī)體對(duì)多房棘球蝴的免疫保護(hù)性機(jī)制，合理選擇具有良好免疫原性的多房棘球蝴 表面抗原Emy-162,并與黏膜免疫佐劑霍亂毒素 B亞基(CTB)相偶聯(lián)，設(shè)計(jì)出一個(gè)科學(xué)合理、 結(jié)構(gòu)新穎的多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emy 162。
[0013] (2)重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-CTB-Emyl62(含有融合基因 CTB-Emy 162)的構(gòu)建 首先構(gòu)建一個(gè)含有霍亂毒素 B亞基(CTB)基因的重組表達(dá)載體pET-CTB;然后通過(guò)基因 合成技術(shù)合成一個(gè)多房棘球蝴表面抗原Emyl62的核苷酸序列，并將其插入重組表達(dá)載體 pET-CTB中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a-CTB-Emy 162。
[0014] (3)融合蛋白CTB-Emyl62的原核表達(dá)及純化 將重組表達(dá)載體pET28a-CTB-Emyl62轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21(DE3)中，構(gòu)建重組基因工程 菌株BL21(DE3)/ pET28a-CTB-Emyl62。利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并通過(guò)Ni-NTA鎳離子親和層析 能夠獲得高純度融合蛋白CTB-Emy 162,即為多房棘球蝴亞單位疫苗。
[0015] 本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供了多房棘球蝴亞單位疫苗的用途。多房棘球蝴亞單位 疫苗CTB-Emy 162可用于預(yù)防和治療多房棘球蝴感染相關(guān)性疾病。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1:新型多房棘球蝴亞單位疫苗的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)特點(diǎn)。
[0017] 圖2:Emyl62基因 PCR結(jié)果圖。
[0018] 泳道I:DNA Marker;泳道2為Emy 162 DNA片段經(jīng)PCR后的結(jié)果 圖3:重組表達(dá)載體pET28a-CTB-Emyl62的雙酶切鑒定。
[0019] 泳道 1:DNA Marker;泳道2:pET28a-CTB-Emyl62質(zhì)粒經(jīng)Nco I和 Xho I雙酶切后 圖4:重組表達(dá)載體pET28a-CTB-Emy 162質(zhì)粒圖譜。
[0020] Nco I和Xho I之間為插入的融合基因 CTB-Emyl62 圖5:多房棘球蝴融合蛋白CTB-Emy 162的原核表達(dá)。
[0021] 泳道I: BL21 (DE3) / pET-28a全菌蛋白；泳道2:蛋白質(zhì)Marker;泳道3: BL21 (DE3) / pET-28a-CTB-Emyl62全菌蛋白；泳道4:BL21(DE3)/ pET-28a- CTB-Emyl62可溶蛋白；泳道 5: BL21 (DE3) /CTB-Emy 162包涵體蛋白。
[0022]圖6:多房棘球蝴融合蛋白CTB-Emyl62的Ni-NTA親和層析純化。
[0023] 泳道1:純化前的CTB- Emyl62蛋白樣品；泳道2:經(jīng)Ni-NTA純化后的CTB- Emyl62蛋 白樣品。
[0024] 圖7 :多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62誘發(fā)抗CTB-Emyl62及Emyl62抗原表位 E7-13、El29-129抗體的檢測(cè)。
[0025] 多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emy 162能夠誘發(fā)較高滴度的針對(duì)CTB-Emy 162及 Emyl62抗原表位E7-l3、El29-l29的抗體。
[0026] 圖8:多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62抗體效價(jià)檢測(cè)。
[0027]圖9:多房棘球蝴亞單位疫苗CTB_Emyl62致敏小鼠脾臟淋巴細(xì)胞對(duì)抗原刺激的增 殖反應(yīng)。
[0028]圖10:多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62誘發(fā)抗多房棘球蝴抗體分型的檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】 [0029] 材料 I. IPTG溶液:稱取1.2g IPTG置于50ml離心管中，加入40ml無(wú)菌水，充分混勻溶解后， 定容至50ml。用0.22μπι濾器過(guò)濾除菌，小份分裝，-20°C保存。
[0030] 2.卡那青霉素(Kana)JC液（lg/mL):稱取Ig卡那青霉素(Kana)溶于ImL無(wú)菌水， 制得濃度為lg/mL的貯存液，通過(guò)0.22μπι細(xì)菌濾器過(guò)濾除菌，溶液分裝保存于-20°C冰箱 中。
[0031] 3.培養(yǎng)基：（I)LB液體培養(yǎng)基:稱取IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g NaCl，加蒸 餾水至1000 ml，調(diào)整pH至7.4，高壓蒸氣滅菌。（2)LB固體培養(yǎng)基：1.5g瓊脂粉/100ml LB培養(yǎng) 液，高壓滅菌后，傾倒平板。
[0032] 4. DNA電泳緩沖液（50 X TAE):稱取242g Tris、37.2g Na2EDTA · 2H20和57.1ml 冰乙酸，加水至1000ml，使用時(shí)稀釋50倍。
[0033] 5·SDS-PAGE電泳緩沖液(5X):稱取Tris粉末15.1g、甘氨酸94g、SDS5.0g;加入 約800ml的去離子水，攪拌溶解;加去離子水定容至1L，室溫保存;注意：加水時(shí)應(yīng)讓水延著 壁緩緩流下，以避免由于SDS的原因產(chǎn)生很多泡沫。
[0034] 6.考馬斯亮藍(lán)R-250染液:0.25g考馬斯亮藍(lán)R-250溶解在100mL脫色液中。（3)固定 液:500ml乙醇、100mL冰醋酸用蒸餾水稀釋至1000 ml。（4)脫色液:250ml乙醇、80ml冰醋酸用 蒸餾水稀釋至1000 ml。（5)保存液:25ml 87%甘油溶于225ml脫色液中。
[0035] 9 .實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：（2)BALB/c小鼠：為SPF級(jí)，雄性，6~7周齡，購(gòu)自北京，許可證號(hào)： SCXK(京）2012-0001。
[0036] 12.淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)主要試劑（1)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊锛?術(shù)有限公司）（2)RPMI-1640完全培養(yǎng)液:在RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液加入10%胎牛血清、100U/ ml青霉素、100μg/ml鏈霉素。
[0037] 實(shí)例1:多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emy 162的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì) 在獲取Emy 162氨基酸序列的基礎(chǔ)上，在此基礎(chǔ)上添加分子內(nèi)粘膜免疫佐劑CTB，設(shè)計(jì)出 具有科學(xué)合理結(jié)構(gòu)的多房棘球蝴融合蛋白，以達(dá)到有效提高體內(nèi)粘膜免疫反應(yīng)。
[0038]結(jié)果：多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)特點(diǎn)和思路如（圖1)所 不。
[0039]實(shí)例2:重組表達(dá)載體(含有融合基因 CTB-Emy 162 )的構(gòu)建 (1)多房棘球蝴表面抗原Emyl62核苷酸序列的基因合成 將前期獲取的Emyl62的氨基酸序列，按照大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性原則轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的核 苷酸序列，委托南京金斯瑞生物科技公司進(jìn)行基因合成。合成后的Emyl62進(jìn)行PCR，反應(yīng)體
PCR反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性5min，95°C變性30 sec，72°C退火30 sec，72°C延伸40sec， 共30個(gè)循環(huán);最后72°C延伸10 min。然后用1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察電泳結(jié)果（圖2)。利用 DNA片段凝膠回收純化試劑盒(北京天根生物技術(shù)有限公司）回收純化PCR擴(kuò)增的Emyl62基 因，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。
[0040] (2)重組表達(dá)載體pET28a-CTB(含有霍亂素素 B亞基基因）的構(gòu)建 通過(guò)質(zhì)粒小量提取試劑盒(天根)提取重組質(zhì)粒PET-CTB-UE(由郭樂(lè)教授惠贈(zèng)），用
37Γ _切反應(yīng)2 h，然后用1%瓊脂糖凝股電泳。分別利用瓊脂糖凝股DNA回收純化試 劑盒回收多表位肽UE基因和pET28a-CTB表達(dá)載體雙酶切產(chǎn)物，pET28a-CTB以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使 用。
[0041 ] (3)多房棘球蝴表面抗原Emyl62基因與pET28a-CTB表達(dá)載體的連接 將回收的pET28a-CTB線性化質(zhì)粒載體和PCR后回收的Emyl62基因通過(guò)互補(bǔ)的粘性末 端，在T4 DNA連接酶的作用下(4°C過(guò)夜)連接成閉合環(huán)狀的DNA分子，即形成重組表達(dá)質(zhì)粒 nRT28a-CTR-Rmvlfi2"T4 DNA 連梓BS連梓體系加下，
結(jié)果:利用Afco IAfto I雙酶切待檢重組質(zhì)粒pET28a-CTB-Emyl62，37°C反應(yīng)2h，用1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)雙酶切的DNA片段約790bp，與融合基因 CTB-Emy 162的理論大 小一致(圖3所示）。
[0042] 將pET28a-CTB-Emyl62送交南京金斯瑞生物科技公司，采用T7啟動(dòng)子和終止子通 用引物進(jìn)行基因測(cè)序，證明pET28a-CTB-Emyl62中融合基因 CTB-Emyl62的核苷酸序列完全 正確，且無(wú)移碼突變。重組表達(dá)載體pET28a-CTB-Emyl62的質(zhì)粒圖譜如（圖4)所示。
[0043]實(shí)例3多房棘球蝴融合蛋白CTB-Emy 16 2的原核表達(dá) 將測(cè)序100%成功的重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-CTB-Emyl62轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli BL21(DE3)菌株 中。在預(yù)先制備好的含50ug/mL Kana的LB平板上，接種環(huán)劃線基因工程菌株pET28a-CTB-Emy 162/BL21 (DE3)，倒置于37°C培養(yǎng)箱，過(guò)夜培養(yǎng)12~16h后，挑取單個(gè)菌落，接種于含50μ g/mL Kana的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，190rpm，培養(yǎng)6-8h。以1%接種量分別接種重組菌于含50 Ug/mL Kana LB液體培養(yǎng)基中，37 °C，180rpm振蕩過(guò)夜，次日晨再將該菌液以1%接種量接種 于含SOyg/mL Kana的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，190rpm搖瓶9h后，加入IPTG使終濃度達(dá)到 ImmoI/L，28 °C，190rpm誘導(dǎo)表達(dá)，以空載體菌pET28a/BL21 (DE3)作為陰性對(duì)照。
[0044] 結(jié)果：將基因工程重組菌株pET28a-CTB-Emyl62/BL21(DE3)在PH值為7、IPTG濃度 為lmmol/L、誘導(dǎo)溫度28°C、誘導(dǎo)時(shí)間為9h的情況下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。與對(duì)照菌株對(duì)比，基因工 程重組菌株pET28a-CTB-Emy162/BL21(DE3)在約33KD處出現(xiàn)目的蛋白條帶，與多房棘球蝴 重組融合蛋白CTB-Emyl62的理論大小相符合（圖5)。多房棘球蝴重組融合蛋白CTB-Emyl62 在包涵體蛋白中存在。
[0045] 實(shí)例4:多房棘球蝴多表位肽融合蛋白CTB-EMY162的純化 (DNi-NTA鎳離子親和層析柱的純化 將Ni-NTA填料充分混勻后加入層析柱中，溶液可通過(guò)重力作用緩慢流出，待完全加入 后，將上層篩板平放入柱中；向裝填好的柱中加入適量的去離子水將乙醇沖洗干凈后，加入 8倍柱體積的Binding buffer平衡，平衡結(jié)束后即可上樣;收集菌體后，每IOOmg菌體加入1_ 5ml Binding Buffer，冰浴超聲裂解菌體；12000rpm離心，棄上清，將沉淀重懸于Binding Buffer中，進(jìn)行超聲波處理，直至包涵體清洗干凈（呈較潔凈的乳白色狀）；將沉淀重懸于 含8M尿素的Binding Buffer中，冰浴lh，使包涵體溶解;將菌體裂解液負(fù)載上柱，流速為10 倍柱體積/小時(shí);使用15倍柱體積的Wash buffer沖洗柱子，收集流穿峰;使用5倍柱體積的 Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰；依次使用3倍柱體積的Binding Buffer和5倍柱體積 的去離子水洗滌后，用3倍柱體積的20%乙醇平衡，4°C保存。
[0046]結(jié)果:經(jīng)Ni-NTA鎳離子親和層析柱的純化后，收集的各個(gè)蛋白峰進(jìn)行SDS-PAGE分 析，可以發(fā)現(xiàn)目的蛋白集中在50mM咪唑和250mM咪唑洗脫產(chǎn)生的蛋白峰。通過(guò)凝膠成像檢 測(cè)儀分析在250mM咪唑洗脫的目的蛋白純度均在85%以上（圖6)。
[0047] 實(shí)施例5:多房棘球蝴多表位疫苗CTB-EMY162的免疫原性和免疫特異性研究 (l)BALB/c小鼠的免疫 實(shí)驗(yàn)分組:將SPF級(jí)BALB/c小鼠隨機(jī)分為2組，分別為新型多房棘球蝴多表位融合蛋白 CTB-Emyl62免疫組、PBS免疫組。每組12只BALB/c小鼠，共24只，詳細(xì)分組如下圖所示： 衷I :SPF級(jí)MLR/c小鼠分鉬及免痦方鑾
免疫萬(wàn)式：用75% 稩對(duì)小鼠腹部消毐，然后腹腔注射里組蛍臼和弗氏芫全佐刑的混 合乳化劑;每隔一周加強(qiáng)免疫一次，第2和3周加弗氏不完全佐劑，第4周直接注射重組蛋白 溶液加強(qiáng)免疫。
[0048] 抗血清的采集:在末次免疫后第五天，摘小鼠眼球采血，收集血液，放置待血清完 全分離，3000rpm離心5分鐘分裝血清，一 80°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0049] (2 )抗血清中特異性抗體的ELI SA檢測(cè) 將抗原Emyl62、Emyl62特異性抗原表位小肽(E7-13、E129-139)、I?S用包被液稀釋成5μg/ ml，100μl/孔包被ELISA板，4°C過(guò)夜。用洗滌液洗4次后，每孔加入300μl封閉液，37°C封閉 2h。用洗滌液洗4次后，將抗血清（鼠抗CTB-Emy 162抗血清、和鼠抗CTB抗血清)和小鼠陰性血 清倍比稀釋后加入ELISA板，100μΙ/孔，在37°C下孵育60min。用洗滌液洗4次后，加入HRP標(biāo) 記的羊抗鼠 IgG(l :2000)，100μ1/孔，在37°C下孵育lh。用洗滌液洗4次后，加入TMB底物顯色 液，室溫避光反應(yīng)15min，加50μ1終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔0D45Q值。將OD值大于設(shè) 定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍的孔對(duì)應(yīng)的稀釋度，定為該樣品的效價(jià)。
[0050] 結(jié)果:Emyl62的包被濃度為5μg/ml，通過(guò)ELISA檢測(cè)，CTB-EMY162亞單位疫苗能夠 產(chǎn)生針對(duì)Emyl62抗原的IgG抗體，而PBS免疫組不能產(chǎn)生針對(duì)Emyl62抗原的IgG抗體;E7-13及 E129-139包被濃度為5μg/ml，通過(guò)ELISA檢測(cè)，CTB-EMY162亞單位疫苗能產(chǎn)生針對(duì)Emyl62特異 性抗原表位肽E7- 13&E129-139的IgG抗體，而I3BS不能產(chǎn)生針對(duì)Emyl62特異性抗原表位肽E7- 13 及已129-139的IgG抗體（圖7,8)。上述結(jié)果說(shuō)明亞單位疫苗CTB-Emyl62能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì) Emy 162的高滴度特異性抗體，具有很好的免疫原性。
[0051 ] (3)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將經(jīng)抗原免疫的小鼠脫白處死，泡75%酒精5min后，移入超凈工作臺(tái)。用剪刀小心剪開(kāi) 小鼠的腹部外皮，再剪開(kāi)小鼠的腹腔，用鑷子取出小鼠脾臟(暗紅色）。在20 ml的無(wú)菌小燒 杯中放入4~5 ml EZ-Sep TM Mouse IX淋巴細(xì)胞分離液;用鑷子固定尼龍網(wǎng)，然后用注射器 活塞輕輕研磨小鼠脾臟，使得分散的單細(xì)胞透過(guò)尼龍網(wǎng)進(jìn)入到淋巴細(xì)胞分離液中；把懸有 脾臟細(xì)胞的分離液立即轉(zhuǎn)移到離心管中，離心前再覆蓋上大約200yl的1640培養(yǎng)基;800 g 離心30 min。離心結(jié)束后淋巴細(xì)胞會(huì)漂浮上來(lái)，在1640覆蓋層下面聚集。用含10%小牛血清 的RPMI-1640培養(yǎng)基制備成一定濃度的細(xì)胞懸液(5 X 104/ml)。在96孔平底培養(yǎng)板中，每孔 加入100μΙ細(xì)胞，同時(shí)加入CTB-Emy 162、E7-13、E129-139、PBS(20μg/ml)，終體積為200μ1/孔，每 組做3個(gè)平行孔。將加好的96孔平底培養(yǎng)板放置37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，向各孔中 加入MTT溶液(5mg/ml)30μ1，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，輕輕吸出上清，每孔加入DMSO 100μΙ振蕩混勻 后用酶標(biāo)儀讀取OD570值。
[0052] 結(jié)果：多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62致敏過(guò)的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，gCTB- Emyl62、E7-i3、E129-139刺激均均能夠發(fā)生明顯的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，而PBS免疫組的小鼠脾臟 淋巴細(xì)胞接受上述抗原刺激時(shí)均未發(fā)生淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，說(shuō)明多房棘球蝴亞單位疫苗 CTB-Emyl62保持有其免疫學(xué)特性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答(圖9)。
[0053] (4)抗血清中特異性抗體分型的ELISA檢測(cè) 將抗原Emy 162、PBS用包被液稀釋成5μg/ml，100μΙ/孔包被ELISA板，4°C過(guò)夜。用洗滌液 洗4次后，每孔加入300μ1封閉液，37°C封閉2h。用洗滌液洗4次后，將抗血清和小鼠陰性血清 倍比稀釋后加入ELISA板，100μΙ/孔，在37°C下孵育60min。用洗滌液洗4次后，加入HRP標(biāo)記 的羊抗鼠 IgA、IgGI、IgG2a，抗體稀釋液稀釋，稀釋比例（1:2000)，100μ1 /孔，在37 °C下孵育 Ih。用洗滌液洗4次后，加入TMB底物顯色液，室溫避光反應(yīng)15min，加50μ1終止液終止反應(yīng)。 用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD 450值。
[0054] 結(jié)果：如（圖10)所示，PBS免疫對(duì)照組相比，多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-EMY162能 夠產(chǎn)生抗Emy 162的I gG I、I gGA和I gG2a抗體。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種多房棘球蝴亞單位疫苗，其活性成分是一條多肽，主要由霍亂毒素 B亞基(CTB) 和棘球蝴表面抗原Emyl62構(gòu)成，其氨基酸序列如序列1所示。2. 如權(quán)利要求1所述，一種多房棘球蝴亞單位疫苗CTB-Emyl62,其核苷酸序列如序列2 所示。3. -種多房棘球蝴表面抗原Emyl62的氨基酸序列如序列3所示。4. 如權(quán)利要求3所述，多房棘球蝴表面抗原Emyl62的核苷酸序列如序列4所示。5. 包含權(quán)利要求2和4中所述的核苷酸序列的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌。6. 如權(quán)利要求1所述，霍亂毒素 B亞基（CTB)和多房棘球蝴表面抗原Emyl62之間的間隔 序列為DPRVPSS。7. -種多房棘球蝴亞單位疫苗的制備方法，通過(guò)基因合成技術(shù)合成多房棘球蝴表面抗 原Emyl62的核苷酸序列，將其融合在霍亂毒素 B亞基(CTB)基因的下游，構(gòu)建含有融合基因 CTB-Emy 162的重組表達(dá)載體pET28a-CTB-Emy 162及其重組基因工程菌BL-21 (DE3)， 重組基因工程菌株發(fā)酵后，經(jīng)Ni-NTA鎳離子交換層析純化，獲得該疫苗的融合蛋白 CTB-Emy162〇8. 按照權(quán)利要求1和6所述的多房棘球蝴亞單位疫苗，其特征在于能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針 對(duì)多房棘球蝴T細(xì)胞免疫應(yīng)答和有效抑制多房棘球蝴的高滴度特異性抗體。9. 按照權(quán)利要求1和7所述的多房棘球蝴亞單位疫苗，其特征是可以用作預(yù)防和治療多 房棘球蝴感染的藥物組合。
【文檔編號(hào)】C12P21/02GK106075416SQ201610417912
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月15日 公開(kāi)號(hào)201610417912.8, CN 106075416 A, CN 106075416A, CN 201610417912, CN-A-106075416, CN106075416 A, CN106075416A, CN201610417912, CN201610417912.8
【發(fā)明人】樊海寧, 格日力, 陽(yáng)旦才讓, 湯鋒, 周虎, 李潤(rùn)樂(lè)
【申請(qǐng)人】青海大學(xué)