裸鼴鼠細(xì)胞因子il-6基因pcr檢測(cè)引物及檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域，具體設(shè)及裸廳鼠細(xì)胞因子IL-6基因檢測(cè)技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 裸廳鼠化eterocephalusgl油er，nakedmolerat,NMR)是一種特別的曬齒類 動(dòng)物，其壽命是曬齒類動(dòng)物中最長(zhǎng)的，最老的個(gè)體超過(guò)30歲，20歲左右的動(dòng)物身體狀態(tài) 普遍良好，超過(guò)25歲的裸廳鼠表現(xiàn)虛弱的跡象，大都死于老年??；裸廳鼠死于癌癥的情況 從未發(fā)現(xiàn)，解剖結(jié)果也從未發(fā)現(xiàn)腫瘤，具有一定的抗癌機(jī)制。裸廳鼠抗腫瘤特性機(jī)制的探 索將給腫瘤的研究翻開新的篇章。目前，很多的基礎(chǔ)、臨床和流行病學(xué)的研究已經(jīng)證實(shí)， 炎癥是一個(gè)明確可W導(dǎo)致腫瘤的危險(xiǎn)因素。病原學(xué)導(dǎo)致某種特定腫瘤發(fā)病的機(jī)制并不適 用于其他癌種，但是本質(zhì)上的發(fā)病機(jī)制都是相同的，就是炎癥的誘導(dǎo)和維持。白細(xì)胞介素 6(;[]1161'16址;[]1-6，比-6)(人比-6的66]1610:3569，小鼠比-6的66]16 10:16193)能誘導(dǎo) B細(xì)胞分化和產(chǎn)生抗體，并誘導(dǎo)T細(xì)胞活化增殖、分化，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，是炎性反應(yīng)的 促發(fā)劑。因此，對(duì)裸廳鼠IL-6基因表達(dá)水平的檢測(cè)有利于掲示其可能存在的抗腫瘤特性的 機(jī)制。
[0003] 目前，由于裸廳鼠性成熟晚（雌性性成熟年齡為228天，是小鼠的6. 5倍；雄性性 成熟年齡為12個(gè)月，是小鼠的8.1倍）、妊娠期長(zhǎng)（68天，是小鼠的3.2倍），且野生裸廳鼠 生活在炎熱、干燥的東非地區(qū)，終生在黑暗的地下，難W捕捉。因此，裸廳鼠的數(shù)目相對(duì)較 少，極大地制約了它的應(yīng)用研究。體外培養(yǎng)的細(xì)胞具有分裂和增殖能力，適應(yīng)性強(qiáng)，易培養(yǎng) 等特點(diǎn)，因此，體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可W解決裸廳鼠研究材料來(lái)源較少的問題。
[0004] 目前，研究中對(duì)細(xì)胞因子比-6基因表達(dá)的檢測(cè)主要通過(guò)化ISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行， 該方法中需要應(yīng)用特異性抗體，然而目前尚沒有針對(duì)裸廳鼠的特異性抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了裸廳鼠細(xì)胞因子IL-6基因PCR檢測(cè) 的引物及檢測(cè)試劑盒，利用PCR檢測(cè)技術(shù)定量和定性的檢測(cè)比-6基因表達(dá)，簡(jiǎn)單快捷，適合 推廣使用。
[0006] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種裸廳鼠細(xì)胞因子比-6基因PCR檢測(cè)引物：
[0007] 正向引物：5,-ACGCTAGTCCTCCACGAT-3,（沈QIDN0:1)，
[0008] 反向引物：5'-GGTTGTTTAACATTGCCTTT-3'（沈QIDN0:2)。
[0009] 本發(fā)明的第二方面，提供一種裸廳鼠細(xì)胞因子比-6基因PCR檢測(cè)試劑盒，其檢測(cè) 引物為：
[0010] 正向引物：如沈QIDNO: 1所示，
[0011] 反向引物：如沈QIDN0:2所示。
[0012] 上述裸廳鼠細(xì)胞因子IL-6基因PCR檢測(cè)試劑盒，還包括：
[0013] 2XSYBRPremixExTaq加1，R0XReferenceDye(50X) 0. 2ul，（1地2〇 3.6ul。
[0014] 較佳的，本發(fā)明所述的一種裸廳鼠細(xì)胞因子IL-6基因PCR檢測(cè)試劑盒，包括：
[001引正向引物：如沈QIDNO: 1所示，
[0016] 反向引物：如沈Q IDN0:2所示；
[0017] 2XSYBRPremixExTaqSul；
[0018]ROXReferenceDye(50X)0.2ul；
[001引（1地20 3.6ul。
[0020]本發(fā)明的第Ξ方面，提供了 一種裸廳鼠細(xì)胞因子IL-6基因的檢測(cè)方法，所述的 檢測(cè)方法利用上述特異性檢測(cè)引物；或利用上述檢測(cè)試劑盒，所述的檢測(cè)方法包括如下步 驟：
[002。 提取裸廳鼠巨隧細(xì)胞細(xì)胞的總mRNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為檢測(cè)樣品，運(yùn)用 Real-timePCR方法進(jìn)行檢測(cè)，得出IL-6的表達(dá)水平，引物序列如下：
[0022] 正向引物：如沈QIDNO: 1所示，
[0023] 反向引物：如沈Q ID NO:2所示；
[0024] 上述裸廳鼠細(xì)胞因子IL-6基因的檢測(cè)方法，具體檢測(cè)步驟為：
[00巧]1)提取mRNA:
[0026] 分離培養(yǎng)裸廳鼠巨隧細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0027] 2)制備實(shí)時(shí)巧光定量PCR反應(yīng)體系lOul
[0028]取步驟 1)中cDNA模板 0. 8ul，2XSYBRPremixExTaq加 1，PCR正向引物 (1〇μΜ)〇.2ιι1，PCR反向引物（lOuM)O.化1，ROXReferenceDye(50X)0.2ul，ddH2〇 3.6ul。設(shè)置陰性對(duì)照。
[002引如進(jìn)行PCR反應(yīng)
[0030] 反應(yīng)循環(huán)設(shè)置為：保溫階段95°C30s循環(huán)階段95°C5s，60°C34s，72°C30s，40個(gè) 循環(huán)；溶解曲線階段95"€153,60"€1111；[]1，95"€153,40個(gè)循環(huán)。
[0031] 本發(fā)明的技術(shù)效果如下：
[0032] 所用的引物針對(duì)裸廳鼠IL-6的mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)，提取裸廳鼠巨隧細(xì)胞細(xì)胞的 總mRNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為檢測(cè)樣品，運(yùn)用Real-timePCR方法進(jìn)行檢測(cè)，得出比-6的 表達(dá)水平，作為判斷裸廳鼠IL-6基因表達(dá)發(fā)生改變的判斷依據(jù)，具有良好的特異性和實(shí)用 性。
【附圖說(shuō)明】：
[0033] 圖1是實(shí)施例1實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)的烙解曲線；
[0034]圖2是實(shí)施例1實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)的擴(kuò)增曲線；
[0035] 圖3是實(shí)施例2中另外Ξ對(duì)引物化、c、d)和本發(fā)明中的引物序列（a)實(shí)時(shí)巧光定 量PCR檢測(cè)的烙解曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 具體結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施并不僅限于 此。
[0037] 實(shí)施例1:
[0038] 根據(jù)GeneBank上裸廳鼠細(xì)胞因子IL-6基因的mRNA序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列 如下：
[0039]正向引物：5,-ACGCTAGTCCTCCACGAT-3,（沈QIDN0:1)
[0040]反向引物：5'-GGTTGTTTAACATTGCCTTT-3'（沈QIDN0:2)。
[0041] 具體檢測(cè)步驟如下：
[0042] 1)提取mRNA:
[0043] 分離培養(yǎng)裸廳鼠巨隧細(xì)胞，A組為空白對(duì)照組，標(biāo)記為1、2巧組為實(shí)驗(yàn)組，使用 病毒模擬物P〇lyI:C刺激巨隧細(xì)胞，標(biāo)記為3-6。分別提取細(xì)胞總RNAaaKaRaRNAiso Plus)(TangXL,XinY,etal.MetabolicCharacteristicsandResponsetoHigh AltitudeinPhrynocephaluserythrurus(Lacertilia:Agamidae),aLizardDwellat AltitudesHigherThanAnyOtherLivingLizardsintheWorld.PLoSOne. 2013Aug7 ; 8(8):e71976.)，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA(Fast如antRTKit(With曲化se)(KR106)，購(gòu)自天根生 化科技有限公司）。
[0044] 2)制備實(shí)時(shí)巧光定量PCR反應(yīng)體系lOul
[0045]取步驟 1)中cDNA模板 0. 8ul，2XSY