專利名稱：：個(gè)體rhd基因合子型測定的pcr引物及試劑盒及測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于個(gè)體RHD基因合子型測定或RHD基因數(shù)目測定的PCR引物，及用于個(gè)體RHD基因合子型測定或PHD基因數(shù)目測定的試劑盒、及個(gè)體RHD基因合子型測定或RHD基因數(shù)目測定的方法。
背景技術(shù)：
：2000年德國Wagner等發(fā)現(xiàn)在PHD基因兩側(cè)各有一段高度同源的序列，約9000bp，在RHD基因5'-端稱為上游Rh盒子，3'-端稱為下游Rh盒子。RHD陰性單倍體的RHD基因缺失即發(fā)生在上、下游盒子之間，并形成一個(gè)融合Rh盒子。根據(jù)這一原理，RHD(+)/RHD(+)和RHD(-)/PHD(-)純合體分別擁有上、下游Rh盒子以及僅擁有融合Rh盒子，而PHD(+)/PHD(-)雜合體則同時(shí)擁有三種Rh盒子。Rh血型D抗原(D抗原在紅細(xì)胞膜表達(dá)與否定義為Rh陽性或Rh陰性)是引起嚴(yán)重新生兒溶血病的主要紅細(xì)胞抗原，編碼D抗原的基因?yàn)镽HD基因，一般一名Rh陽性個(gè)體擁有一條RHD基因[RHD雜合子，RHD(+)/RHD(-)]或二條RHD基因[RHD純合子，RHD(+)/RHD(+)]，Rh陰性個(gè)體則缺失RHD基因[RHD缺失純合體，RHD(-)/RHD(-)]。以往RHD基因數(shù)目或RHD合子型測定主要是根據(jù)Rh小因子表型估計(jì)，或通過復(fù)雜的家系調(diào)查，或根據(jù)RhD抗原的量等間接方法鑒別，2000年國際上建立了第一個(gè)RHD基因合子型直接測定技術(shù)，為限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)方法，該方法采用一對PCR引物同時(shí)擴(kuò)增下游和融合Rh盒子，然后采用限制性內(nèi)切酶作酶切，再電泳分析片段大小多態(tài)性，一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以判斷三種RHD合子型，但是該方法操作復(fù)雜、耗時(shí)較長。2001年和2002年，中國香港學(xué)者和奧地利學(xué)者分別獨(dú)立報(bào)道了采用擴(kuò)增突變阻滯檢測系統(tǒng)和實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-timePCR)技術(shù)檢測已知Rh陽性表型個(gè)體的RHD基因數(shù)目，該技術(shù)同樣較為復(fù)雜且要求特殊的儀器，而且不能區(qū)分RHD(+)/RHD(-)和RHD(-)/RHD(-)合子型。2003年本專利發(fā)明人之一邵超鵬等設(shè)計(jì)建立了簡易的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測方法，一次可判斷三種RHD合子型，但是在隨后的應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)由于引物位置和反應(yīng)區(qū)域等原因，造成存在一定比率的假陽性和假陰性現(xiàn)象。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個(gè)目的是針目前國內(nèi)外個(gè)體PHD基因合子型測定或RHD基因數(shù)目測定的方法存在的上述各種問題，提供特異性的用于個(gè)體RHD基因合子型測定的PCR引物。本發(fā)明的第二個(gè)目的是采用本發(fā)明的特異性PCR引物，提供一種能克服之前方法復(fù)雜或需特殊儀器設(shè)備等局限性，能降低之前方法存在的假陽性或假陰性率，能準(zhǔn)確進(jìn)行3個(gè)體PHD基因合子型測定或PHD基因數(shù)目測定的試劑盒。本發(fā)明的第三個(gè)目的是采用本發(fā)明的試劑盒，提供一種操作簡便的個(gè)體RHD基因合子型測定方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的個(gè)體RHD基因合子型測定或RHD基因數(shù)目測定技術(shù)采用序列特異性引物-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，(sequencespecificprimer-polymorasechainreaction,縮寫PCR-SSP或SSP-PCR或PCR/SSP)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)又稱體外擴(kuò)增技術(shù)，序列特異性引物_聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)是其一種方式，也有稱為等位基因特異性或核甘酸特異性的PCR技術(shù)。我們根據(jù)美國國家生物信息中心(NCBI)GenBank記錄的基因序列或核酸序列，確定了二對特異性寡核苷酸引物，用于個(gè)體RHD基因合子型測定或RHD基因數(shù)目測定。本發(fā)明的二對特異性寡核苷酸引物分別如下(1)上游引物Hy-s:其3，端位置是在Rh融合盒子(hybridRhesusbox，序列見NCBIGenBankAJ252313)第4988位堿基處；下游引物Hy-a:其3'端位置是在Rh融合盒子第7710位堿基處；(2)上游引物Dl-s:其3'端位置是在相對RHD基因編碼區(qū)第一個(gè)堿基位置的-554位堿基處(序列見NCBIGenBankAJ252314);下游引物Dl_a:其3'端位置是在RHD基因第一內(nèi)含子的第18位堿基處。上述每段特異性寡核苷酸引物的長度為21-28個(gè)核苷酸。引物序列以靠近3'端的4-5個(gè)堿基決定其反應(yīng)特異性，靠近5'端的堿基可根據(jù)情況增加或較少。上述二對特異性寡核苷酸引物使用如下序列較佳(1)上游引物Hy-s:5，-TGAGCCTATAAAATCCAAAGCAAGTTAG-3，，下游引物Hy-a:5，-CCTTTTTTTGTTTGTTTTTGGCGGTGC-3，，(2)上游弓|物Dl-s:5'-TCAACTGTGTAACTATGAGGAGTCAG-3，，下游引物Dl_a:5，-GCTATTTGCCTGTGACCACTT-3，。上述較佳引物的核苷酸序列及所處的位置請見如下表1:<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>表1表1中"IC"為一對內(nèi)對照引物，檢測人類血小板抗原，"基因序列"為在美國國家生物信息中心(NCBI)GenBank進(jìn)行登記的基因序列編號，"bp"表示擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長度。采用本發(fā)明的上述特異性寡核苷酸引物，制備成本發(fā)明的用于個(gè)體RHD基因合子型測定或RHD基因數(shù)目測定的試劑盒。本發(fā)明的用于個(gè)體RHD基因合子型測定或PHD基因數(shù)目測定的試劑盒，包含本發(fā)明的上述一對或二對特異性寡核苷酸引物。當(dāng)試劑盒包含本發(fā)明的第一對特異性寡核苷酸引物時(shí)，可用來鑒別RHD(+)/RHD(+)與RHD(+)/RHD(-)，或鑒別RHD(+)/RHD(+)與RHD(-)/RHD(-)合子型；當(dāng)試劑盒包含本發(fā)明的第二對特異性寡核苷酸引物時(shí)，鑒別RHD(-)/RHD(-)與RHD(+)/RHD(+)，或鑒別RHD(-)/RHD(-)與RHD(+)/RHD(-)合子型。當(dāng)試劑盒包含本發(fā)明的兩對特異性寡核苷酸引物時(shí)，可一次判斷三種RHD基因合子型，即一次測定個(gè)體是三種中的哪一種RHD基因合子型。本發(fā)明的試劑盒可以是僅包含一對或二對特異性寡核苷酸引物，還可以包含有PCR擴(kuò)增反應(yīng)液。二對引物可裝于同一容器內(nèi)，也可分別裝于二個(gè)容器內(nèi)，分別裝于二個(gè)容器內(nèi)較佳。當(dāng)二對特異性寡核苷酸引物分別裝于二個(gè)容器時(shí)，每個(gè)容器內(nèi)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)液包含:PCRBuffer、MgCl22.5mM、dNTPs200iiM、甘油5%(v/v)、甲酚紅0.005%(w/v)，其余為純水，特異性寡核苷酸引物的濃度為0.6pmol/yL，。本發(fā)明的試劑盒還可包含有內(nèi)對照引物，例如表1中所示的內(nèi)對照引物IC。本發(fā)明的試劑盒還可包含有DNA聚合酶。上述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、內(nèi)對照引物可裝在或不裝在包含有本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物的每個(gè)容器內(nèi)。采用本發(fā)明的試劑盒對個(gè)體PHD基因合子型或RHD基因數(shù)目進(jìn)行測定，該方法包括如下順序的步驟(1)試劑盒的準(zhǔn)備試劑盒包含兩種RHD基因檢測用PCR測定混合液，分裝于2個(gè)容器內(nèi)，每種測定混合液包含有PCRBuffer、MgCl22.5mM、dNTPs200iiM、甘油5%(v/v)、甲酚紅0.005%(w/v)、權(quán)利要求1中所述的二對中的一對特異性寡核苷酸引物0.06pmo1/iiL、內(nèi)對照引物0.25pmo1/iiL，其余為純水；(2)在各反應(yīng)容器內(nèi)分別加入兩種中的一種測定混合液8ul;(3)每個(gè)反應(yīng)容器加入lulDNA樣品，含DNAO.05-0.1微克；(4)每個(gè)反應(yīng)容器內(nèi)加入lul稀釋好的DNA聚合酶，含DNA聚合酶0.2活力單位；(5)根據(jù)PCR擴(kuò)增儀類型，加或不加1滴石蠟油覆蓋反應(yīng)液；(6)離心數(shù)秒后放入PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增，在95t:下預(yù)變性5-10分鐘，接著進(jìn)入循環(huán)，在92t:下變性20秒鐘，在64t:下退火30秒鐘，在68t:下延伸5分鐘，共40個(gè)循環(huán)，在40循環(huán)后，繼續(xù)在72t:下延伸5分鐘；(7)上步所得PCR產(chǎn)物直接點(diǎn)樣，于2X瓊脂糖凝膠電泳15-20分鐘，在紫外光下拍照記錄。本發(fā)明的用于個(gè)體RHD基因合子型測定的試劑盒及測定方法具有如下優(yōu)點(diǎn)1.先進(jìn)性、特異性和高準(zhǔn)確率。本發(fā)明的第二對引物設(shè)計(jì)，避開檢測目前觀察到的存在基因變異的下游Rh盒子(downstreamRhesusbox)，而根據(jù)中國人的Rh分子背景一一尚未發(fā)現(xiàn)個(gè)體RHD基因第一外顯子缺失的現(xiàn)象，定為檢測RHD基因的第一外顯子；本發(fā)明的第一對引物檢測融合Rh盒子，亦避開與下游Rh盒子序列相對應(yīng)的區(qū)域(二同源大于96%)，因此擴(kuò)增產(chǎn)物片段較大(為2778bp)。二對引物經(jīng)對511例樣本檢測，未發(fā)現(xiàn)假陽性或假陰性現(xiàn)象，顯示較好的穩(wěn)定性和可靠性。2.本發(fā)明的試劑盒及測定方法易于操作和簡便。本發(fā)明的試劑盒及測定方法采用序列特異性引物-PCR技術(shù)，對PCR擴(kuò)增儀的型號無嚴(yán)格要求，9700型、9600型、2400型及梯度變溫型擴(kuò)增儀等均可；PCR產(chǎn)物電泳無需上樣緩沖液，可直接電泳；DNA聚合酶可用熱啟動酶(金牌酶)，也可用普通Taq酶。因此本發(fā)明的試劑盒及測定方法應(yīng)用彈性比較大，實(shí)驗(yàn)人員不需要特殊培訓(xùn)，根據(jù)說明書即可操作。圖1是實(shí)施例一的凝膠電泳圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例一—、個(gè)體RHD基因合子型測定或PHD基因數(shù)目測定試劑盒組成包括二種PHD基因合子型檢測用PCR測定混合液及DNA聚合酶稀釋液，二種測定混合液分裝于2個(gè)試管內(nèi)，分別標(biāo)記為H和D。每種測定混合液總體積為25ul，含10XPCRBuffer2.5ul、25mMMgCl22.5ul、10mMdNTPsO.5ul、50%(v/v)甘油2.5ul、0.05%(w/v)甲酚紅2.5ul、前述本發(fā)明較佳的二對特異性寡核苷酸引物(表1中的Dl-s和Dl-a及Hy-s和Hy-a)中的一對特異性寡核苷酸引物2.5ul(濃度為0.6pmol/ul)、以及濃度為2.5pmo1/ul的內(nèi)對照引物IC(參見表1)2.5ul，其余為純水。試劑盒直接放于_201:以下凍存。二、個(gè)體PHD基因合子型或PHD基因數(shù)目測定3個(gè)待檢DNA樣品A、B、C。—塊96孔的微孔板，每個(gè)樣品2個(gè)反應(yīng)孔?？譇l-A2為樣品A，孔A3-A4為樣品B，孔A5-A6為樣品C。測定步驟如下1.每個(gè)樣品的兩個(gè)反應(yīng)孔中分別加入二種不同的測定混合液8ul;2.每個(gè)反應(yīng)孔加入lulDNA樣品，含DNAO.05-0.1微克；3.每個(gè)反應(yīng)孔加入lul金牌DNA聚合酶稀釋液，約含0.2活力單位；4.采用9600型PCR擴(kuò)增儀，加1滴石蠟油覆蓋反應(yīng)液；5.離心數(shù)秒后放入PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增，在95t:下預(yù)變性5-10分鐘，接著進(jìn)入循環(huán)，在92t:下變性20秒鐘，在64t:下退火30秒鐘，在68t:下延伸5分鐘，共40個(gè)循環(huán)，在40循環(huán)后，繼續(xù)在72t:下延伸5分鐘；6.把上步所得PCR產(chǎn)物直接點(diǎn)樣，于2%瓊脂糖凝膠電泳20分鐘，紫外光下拍照記錄。三、結(jié)果電泳圖請見圖1，圖1中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，內(nèi)對照產(chǎn)物為367bp。RHD(-)/RHD(-)個(gè)體和RHD(+)/RHD(+)個(gè)體分別為僅融合Rh盒子(圖中Hyb，2778bp)或RHD基因(圖中Exon，767bp)擴(kuò)增為陽性，而RHD(+)/RHD(-)雜合型個(gè)體則同時(shí)出現(xiàn)2778bp條帶和767bp條帶。由此，可得出各個(gè)樣品的RHD基因型如下A為RHD基因缺失純合體，可記錄為RHD(-)/RHD(-)個(gè)體，其RHD基因數(shù)目為零；B為RHD基因雜合體，可記錄為RHD(-)/RHD(+)個(gè)體，其PHD基因數(shù)目為1;C為RHD基因純合體，可記錄RHD(+)/RHD(+)個(gè)體，其RHD基因數(shù)目為2。核苷酸序列表〈110〉深圳市血液中心〈120〉個(gè)體RHD基因合子型測定的PCR引物及試劑盒及測定方法〈160>4〈170>Patent-inVersion3.1〈210〉1〈211>28〈212>DNA〈213〉人(Homosapiens)〈400〉1TGAGCCTATAAAATCCAAAGCAAGTTAG28〈210>2〈211>27〈212>DNA〈213>人(Homosapiens)〈400〉2CCTTTTTTTGTTTGTTTTTGGCGGTGC27〈210>3〈211>26〈212>DNA〈213〉人(Homosapiens)〈400〉3TCAACTGTGTAACTATGAGGAGTCAG26〈210>4〈211>21〈212>DNA〈213〉人(Homosapiens)〈400〉4GCTATTTGCCTGTGACCACTT2權(quán)利要求一種用于個(gè)體RHD基因合子型測定的PCR引物，為如下一對特異性寡核苷酸引物上游引物D1-s其3’端位置是在相對RHD基因編碼區(qū)第一個(gè)堿基位置的-554位堿基處；下游引物D1-a其3’端位置是在RHD基因第一內(nèi)含子的第18位堿基處；上述每段特異性寡核苷酸引物的長度為21-28個(gè)核苷酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于個(gè)體RHD基因合子型測定的PCR引物，其核苷酸序列分別為上游引物Dl-s:5'-TCAACTGTGTAACTATGAGGAGTCAG-3，，下游引物Dl-a:5'-GCTATTTGCCTGTGACCACTT-3'。3.—種用于個(gè)體RHD基因合子型測定的試劑盒，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的一對特異性寡核苷酸引物。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于個(gè)體RHD基因合子型測定的試劑盒，其特征在于還包含有PCR擴(kuò)增反應(yīng)液。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于個(gè)體RHD基因合子型測定的試劑盒，其特征在于PCR擴(kuò)增反應(yīng)液和一對特異性寡核苷酸引物裝于一個(gè)容器內(nèi)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)液包含有PCRBuffer、MgCl22.5mM、dNTPs200iiM、甘油5%(v/v)、甲酚紅0.005%(w/v)，其余為純水，特異性寡核苷酸引物的濃度為0.06pmol/iiL。6.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的用于個(gè)體RHD基因合子型測定的試劑盒，其特征在于還包含有內(nèi)對照引物。7.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的用于個(gè)體RHD基因合子型測定的試劑盒，其特征在于還包含有DNA聚合酶。8.—種個(gè)體RHD基因合子型的測定方法，其特征在于包括如下順序的步驟(1)試劑盒的準(zhǔn)備試劑盒包含RHD基因檢測用PCR測定混合液，裝于一個(gè)容器內(nèi)，PCR測定混合液包含有PCRBuffer、MgCl22.5mM、dNTPs200iiM、甘油5%(v/v)、甲酚紅0.005%(w/v)、權(quán)利要求1所述的一對特異性寡核苷酸引物0.06pmol/iiL、內(nèi)對照引物0.25pmo1/iiL，其余為純水；(2)在各反應(yīng)容器內(nèi)分別加入PCR測定混合液8ul;(3)每個(gè)反應(yīng)容器加入lulDNA樣品，含DNAO.05-0.1微克；(4)每個(gè)反應(yīng)容器加入lul稀釋好的DNA聚合酶，含DNA聚合酶0.2活力單位；(5)根據(jù)PCR擴(kuò)增儀類型，加或不加1滴石蠟油覆蓋反應(yīng)液；(6)離心數(shù)秒后放入PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增，在95t:下預(yù)變性5-10分鐘，接著進(jìn)入循環(huán)，在92t:下變性20秒鐘，在64t:下退火30秒鐘，在68t:下延伸5分鐘，共40個(gè)循環(huán)，在40循環(huán)后，繼續(xù)在72t:下延伸5分鐘；(7)把上步所得PCR產(chǎn)物直接點(diǎn)樣，于2%瓊脂糖凝膠電泳15-20分鐘，在紫外光下拍照記錄。全文摘要本發(fā)明為一種個(gè)體RHD基因合子型測定的PCR引物及試劑盒及測定方法。本發(fā)明的引物用于檢測RHD基因的第一外顯子，其上游引物的3’端位置是在相對RHD基因編碼區(qū)第一個(gè)堿基位置的-554位堿基處，下游引物的3’端位置是在RHD基因第一內(nèi)含子的第18位堿基處?；谠撎禺愋怨押塑账嵋锏谋景l(fā)明的試劑盒及測定方法，具有先進(jìn)性、特異性和高準(zhǔn)確率，而且在測定時(shí)簡便和易于操作。文檔編號C12N15/11GK101748202SQ20081021367公開日2010年6月23日申請日期2004年3月25日優(yōu)先權(quán)日2004年3月25日發(fā)明者邵超鵬申請人:深圳市血液中心