及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫學(xué)及基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種馬抗H7N9亞型流感特異免疫球蛋白F(ab’)2及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]根據(jù)對(duì)2013年春季出現(xiàn)的H7N9新亞型流感病毒進(jìn)行病毒分子遺傳背景分析的結(jié)果，在H7N9亞型流感病毒的8個(gè)基因片段中，H7片段與浙江鴨群中分離的禽流感病毒相似，往上追溯，又與東亞地區(qū)野鳥(niǎo)中分離的禽流感病毒基因相似；N9片段與東亞地區(qū)野鳥(niǎo)中分離的禽流感病毒相似。其余6個(gè)基因片段(PB2、PB1、PA、NP、M、NS)與H9N2禽流感病毒相似，且H9N2禽流感病毒來(lái)源于中國(guó)上海、浙江、江蘇等地的雞群。
[0003]H7N9流感病毒屬于基因組為單股、正鏈、8節(jié)段的正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒成員，A型流感病毒囊膜表面糖蛋白血凝素(HA)包括16種、神經(jīng)氨酸酶(NA)包括9種，它們之間的不同組合，導(dǎo)致新亞型不斷出現(xiàn)，迄今為止已發(fā)現(xiàn)130余種，因此，當(dāng)新亞型流感突發(fā)時(shí)，現(xiàn)有的預(yù)防、治療措施很難跟上。
[0004]盡管疫苗是防控流感病毒的有效方法，但流感病毒的高度變異特性，導(dǎo)致疫苗的研發(fā)與生產(chǎn)相對(duì)滯后；目前臨床應(yīng)用的抗流感病毒藥物，如M2離子通道抑制劑(金剛烷胺和金剛乙胺)、神經(jīng)氨酸酶抑制劑(帕拉米韋、奧司他韋和扎那米韋)等存在保護(hù)效率低、耐藥性及嚴(yán)重副作用等問(wèn)題，特別是其發(fā)揮有效的治療作用需要在感染早期即能診斷并使用，因此，臨床作用還很有限。
[0005]近年來(lái)，禽流感病毒感染恢復(fù)者血清和抗禽流感中和抗體已在病人救治及動(dòng)物模型攻毒保護(hù)方面顯示出良好的效果。中和抗體在新發(fā)傳染病早期，沒(méi)有疫苗的緊急情況下，即可作為預(yù)防性藥物接種免疫力低下的人群增強(qiáng)抗病力，也可作為治療性藥物應(yīng)用于早期確診病人，甚至能用于重癥肺炎，挽救重癥患者的生命，降低致死率。
[0006]在各類研發(fā)的中和抗體中，以動(dòng)物高免血清制備的多克隆抗體、抗病毒免疫球蛋白以及精制抗病毒免疫球蛋白F(ab’)2等一系列產(chǎn)品，具有來(lái)源廣、制備周期短、成本低、效價(jià)高等優(yōu)勢(shì)。高免血清用于抗病毒治療在臨床上應(yīng)用多年，已納入我國(guó)生物制品規(guī)程獲批準(zhǔn)生產(chǎn)的，包括抗狂犬病毒高免血清、抗巨細(xì)胞病毒多克隆抗體等14種產(chǎn)品。但高免動(dòng)物血清有一定致敏性，保存時(shí)間短等缺點(diǎn)，如何脫敏，提高血清制品質(zhì)量是亟待解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種高效、安全、可靠的馬抗H7N9亞型流感特異免疫球蛋白F(ab’)2及其制備方法。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的馬抗H7N9亞型流感特異免疫球蛋白F(ab’ )2的制備方法，將H7N9亞型流感病毒株A/shanghai2/2013的病毒滅活液與免疫佐劑混合作為免疫原，通過(guò)多次免疫健康馬匹，獲得高免血漿，分離純化IgG蛋白，經(jīng)胃蛋白酶酶切，將酶切產(chǎn)物過(guò)Protein G瓊脂糖凝膠柱，收集流穿液，經(jīng)超濾濃縮后，即得馬抗H7N9亞型流感特異免疫球蛋白F(ab’)2。
[0009]具體地，上述方法包括以下步驟:
[0010]I)將H7N9亞型流感病毒株A/shanghai2/2013接種7-9日齡SPF雞胚，37°C孵育72h，收獲雞胚尿囊液，用甲醛37°C滅活72h，滅活病毒接種7-9日齡SPF雞胚，盲傳3代，3代雞胚尿囊液中均檢不出病毒為滅活合格；收獲雞胚尿囊液，4°C離心，沉淀用PBS溶解后，進(jìn)行蔗糖密度梯度離心，獲得純化濃縮的H7N9亞型流感病毒滅活液；
[0011]2)將上述病毒滅活液與弗氏完全佐劑混合，馬經(jīng)過(guò)背部皮下分點(diǎn)注射的方法進(jìn)行初免、多次加強(qiáng)免疫，檢測(cè)馬血漿效價(jià)達(dá)到1:5000以上時(shí)，采血；采用飽和硫酸銨沉淀法，分離純化IgG蛋白，然后用胃蛋白酶進(jìn)行酶切；
[0012]3)將酶切產(chǎn)物過(guò)Protein G瓊脂糖凝膠柱，收集流穿液，經(jīng)超濾濃縮后，即得馬抗H7N9亞型流感特異免疫球蛋白F(ab’)2。
[0013]其中，步驟2)中病毒滅活液與弗氏完全佐劑按1:2的體積比混合。
[0014]步驟2)中所述飽和硫酸銨沉淀法具體為:a)將I體積血漿與2體積無(wú)熱原水混合后，加入3體積的飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，使溶液中硫酸銨濃度達(dá)到50%，全部加入后于室溫靜置30-40min，5000rpm離心20min，棄上清；b)取沉淀用2體積無(wú)熱原水重懸，加入I體積的飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，使溶液中硫酸銨濃度達(dá)到33.3%，全部加入后于室溫靜置30-40min，5000rpm離心20min，取沉淀；重復(fù)b) 2-3次，獲得純化的IgG蛋白。
[0015]步驟3)中使用的親和層析柱中填料為Sepharose 4B。洗脫親和層析柱時(shí)使用的洗脫緩沖液成分為:pH2.71mM Tris-HCl。洗脫后用IM Tris中和。
[0016]本發(fā)明還提供按照上述方法制備的馬抗H7N9亞型流感特異免疫球蛋白F(ab’)2。
[0017]本發(fā)明還提供所述馬抗H7N9亞型流感特異免疫球蛋白F(ab’)2在制備用于預(yù)防和/或治療H7N9亞型流感藥物中的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明還提供由所述馬抗H7N9亞型流感特異免疫球蛋白F(ab’)2制備的用于預(yù)防和/或治療H7N9亞型流感的藥物。
[0019]本發(fā)明中制備的免疫球蛋白F(ab’)2含量不低于總蛋白含量的95.0%。本發(fā)明產(chǎn)品為凍干粉劑型，具有高效價(jià)的中和H7N9亞型流感病毒特異性，可成為治療H7N9病人的一種新的有效藥物，用于H7N9亞型流感感染患者的緊急救治。
[0020]本發(fā)明提供的馬抗H7N9亞型流感特異免疫球蛋白F(ab’)2，是用于預(yù)防和治療H7N9亞型流感病毒所引起的重癥肺炎型H7N9流感的有效藥物，對(duì)H7N9亞型流感病毒感染重癥患者具有顯著療效，提高患者的存活率。本品將填補(bǔ)國(guó)內(nèi)此類藥物空白。本發(fā)明的制備工藝采用獨(dú)特的工藝參數(shù)控制，用常規(guī)的分離法生產(chǎn)出所述特異性免疫球蛋白，適于工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)品安全可靠。用于制備馬抗H7N9亞型流感特異免疫球蛋白F(ab’)d^原料血漿有穩(wěn)定高效的來(lái)源，能滿足血漿的供給。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0022]實(shí)施例1馬抗H7N9亞型流感特異免疫球蛋白F(ab’)2的制備方法
[0023]所述制備方法包括以下步驟:
[0024]1、將H7N9亞型流感病毒株A/shanghai2/2013接種7-9日齡SPF雞胚，37°C孵育72h，收獲雞胚尿囊液，用甲醛37°C滅活72h，滅活病毒接種7-9日齡SPF雞胚，盲傳3代，3代雞胚尿囊液中均檢不出病毒為滅活合格；收獲雞胚尿囊液，4°C 5000g離心后，4°C 10000g離心2h，沉淀用滅菌PBS溶解后，進(jìn)行蔗糖密度梯度離心(用20%、30%、60%蔗糖密度梯度離心后，可以在30%和60%之間得到純化的流感病毒)，獲得純化濃縮的H7N9亞型流感病毒滅活液。
[0025]2、將上述病毒滅活液與弗氏完全佐劑、弗式不完全佐劑按1:2的體積比混合均勻，馬(挑選健康馬，優(yōu)選4-6歲體質(zhì)健康的馬匹，按照《中國(guó)生物制品規(guī)程》中，生物制品生產(chǎn)用馬匹檢疫及管理規(guī)程進(jìn)行檢疫和管理)經(jīng)過(guò)背部皮下分點(diǎn)注射的方法進(jìn)行初免、多次加強(qiáng)免疫，檢測(cè)馬血漿效價(jià)達(dá)到1:5000以上時(shí)，采血。
[0026]3、采用飽和硫酸銨沉淀法，分離純化IgG蛋白:
[0027]①無(wú)菌條件下，將I體積血漿與2體積無(wú)熱原水混合后，加入3體積的飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，使溶液中硫酸銨濃度達(dá)到50%，全部加入后于室溫靜置30-40min，5000rpm離心20min，棄上清。
[0028]②取沉淀用2體積無(wú)熱原水重懸，加入I體積的飽和硫酸錢溶液，邊加邊攪拌，使溶液中硫酸銨濃度達(dá)到33.3%，全部加入后于室溫靜置30-40min，5000rpm離心20min，取沉淀；重復(fù)b) 2-3次，獲得純化的IgG蛋白。
[0029]4、用胃蛋白酶酶切純化的IgG蛋白。具體為:向10mL馬血清中加入2倍體積的除熱源的水后，用NaOH調(diào)pH到3.3-3.4，加入終濃度為10000IU/mL的胃蛋白酶，混勻。于30°C，消化2.5h。消化后樣品保存于_80°C。
[0030]5、將酶切產(chǎn)物過(guò)Protein G瓊脂糖凝膠柱，