利用鏈置換交換反應(yīng)檢測非核酸分析物的制作方法
【專利說明】利用鏈置換交換反應(yīng)檢測非核酸分析物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種分析物檢測系統(tǒng)。具體地，本發(fā)明涉及一種分析物檢測系統(tǒng)，其中 分析物不是核酸（即DNA和RNA)。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 多種不同方法可用于檢測樣品中的肽/蛋白質(zhì)和其他分子，如ELISA、SPR、QCM、 電化學(xué)傳感器等。這些基于表面的方法賦有較高的靈敏性和多重傳感能力，但固定化規(guī) 程可能干擾蛋白質(zhì)-配體結(jié)合，而且經(jīng)常需要仔細清洗和封閉以對抗非特異性吸附。僅 有少數(shù)完善確立的同質(zhì)性測定法（homogeneous assay)，其中焚光偏振被廣泛用于研宄小 分子-蛋白質(zhì)相互作用(Analysis of protein-ligand interactions by fluorescence polarization, Ana Rossi&Colin Taylor, Nature protocols,2011)〇
[0004] 電化學(xué)生物傳感器通常基于產(chǎn)生或消耗電子的反應(yīng)的酶促催化。酶聯(lián)免疫吸附測 定法（ELISA)是基于板的測定法，其設(shè)計用于檢測和量化物質(zhì)如肽、蛋白質(zhì)、抗體和激素。 表面等離振子共振（SPR)檢測固定化配體在其結(jié)合較大蛋白質(zhì)時的尺寸增加，其通過記錄 薄金屬膜表面處折射系數(shù)的變化進行。石英晶體微天平（QCM)檢測方案基于對堆積于晶體 表面上的薄層的質(zhì)量變化和物理特性的測量。熒光偏振檢測小熒光配體對較大蛋白質(zhì)的結(jié) 合，其使用平面偏振光來檢測有效分子體積的變化進行。
[0005] 還存在一系列能檢測樣品中的核酸分子的測定法，如PCR、Southern印跡、 Northern印跡和FISH。最近的一種辦法是DNA立足點交換（toehold exchange)反應(yīng)。 DNA立足點交換反應(yīng)是一種系統(tǒng)，其中各具有特定立足點區(qū)的兩個DNA鏈彼此競爭以與 充當?shù)孜锏牡谌鼶NA鏈雜交。由于其極大的模塊性、可設(shè)計性和靈敏性，已將其用于建 立催化性DNA網(wǎng)絡(luò)（Zhang等Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA. Science2〇〇7,318, im-1125)、控制DNA鏈置換動力學(xué)（Zhang等 Control of DNA strand displacement kinetics using toehold exchange. J Am Chem Soc2009, 131，17303-17314)、和優(yōu)化核酸雜交的特異性（Zhang等Optimizing the specificity of nucleic acid hybridization. Nat Chem2012,4,208_214)〇 然而，這些 系統(tǒng)僅涉及檢測核酸分子。
[0006] 因此，用于檢測不同于DNA和RNA的分子的改進檢測系統(tǒng)將是有利的，特別是一種 用于檢測不同于DNA和RNA的小分子的更有效和/或更可靠的檢測系統(tǒng)將是有利的。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明提供用于檢測不同于DNA和RNA的分析物的分析物檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)包含 可以以特異性方式彼此雜交且能基于特異性雜交事件生成信號的一組寡核苷酸。該系統(tǒng)依 賴于在存在分析物時寡核苷酸之間的雜交平衡的變化，其導(dǎo)致信號變化。
[0009] 本文中我們呈現(xiàn)了一種利用DNA立足點交換反應(yīng)來進行非核酸靶物檢測的檢測 系統(tǒng)，其通過將小分子（例如抗原或半抗原）附接于三條DNA鏈的一條或多條上。小分子 與其受體蛋白質(zhì)或抗體之間的特異性結(jié)合使初始平衡迀移，且可通過例如FRET (Fdrster共 振能量轉(zhuǎn)移）信號監(jiān)測溶液中每種組分的群體變化。該方案顯示如下：
[0011] 此處A、B和S是三種DNA寡核苷酸，其中A和B兩者均部分互補于S。X代表A上 標記的小分子，而Y是其相應(yīng)的結(jié)合蛋白質(zhì)。例如，沒有Y時，A和B具有相等或幾乎相等 的與S雜交的能力，而有Y時，該蛋白質(zhì)的大體積（bu 1 kiness)、電荷或其他作用將影響雜交 能量，如此它們的百分數(shù)將例如從50:50變?yōu)?0:80。該概念基本上利用了以下事實，即用 于每種雜交形成的能量的小擾動將導(dǎo)致兩種DNA雜合物之間的平衡的相對較大的迀移。
[0012] 在典型的立足點交換反應(yīng)系統(tǒng)中，兩個共享相同分支迀移區(qū)（branch migration region)但立足點區(qū)不同的DNA鏈將彼此動態(tài)競爭以與第三DNA雜交。完整的置換循環(huán)例 示于圖2。例如，開始時鏈A(A)與鏈S(S)配對以形成AS雙鏈體。由于S具有用于鏈B(B) 的另一個立足點區(qū)，B上的立足點有機會與S上的立足點雜交。由于序列對稱性，A和B兩 者剛與S結(jié)合就會發(fā)生分支迀移過程。在該過程中，A和B具有相等的置換彼此的機會，從 而一半的產(chǎn)物將是B完全具有S的分支迀移區(qū)，而A僅經(jīng)由立足點與S結(jié)合。由于立足點 通常較短，該雜交不穩(wěn)定且短暫，最終留下溶液中的BS加A的組分。上述所有步驟均可逆。 注意這里B通常在分支迀移區(qū)中具有經(jīng)標記的結(jié)合模塊。
[0013] 在存在分析物時，分析物對連接于B的小分子的結(jié)合可能對立足點結(jié)合沒有較大 影響，但將對B實施分支迀移過程產(chǎn)生增加的能量障礙，從而使B相比于A在對S的競爭性 結(jié)合中不利（或偶爾有利）。因此，在終產(chǎn)物中，熱動力平衡被移向形成更多AS雙鏈體（偶 爾更多的BS雙鏈體）以及與靶分析物結(jié)合的單鏈B的方向，而且這種群體變化可通過FRET 或其他光學(xué)方法檢測到。
[0014] 在實施例部分，不同的研宄類型顯示這一概念對于檢測不同于RNA和DNA的分析 物確實有功能。
[0015] 總之，已開發(fā)了一種新的檢測系統(tǒng)，其可以基于微調(diào)（fine-tuned)的立足點交換 反應(yīng)來檢測蛋白質(zhì)和小分子兩者。該測定法是無酶的，且與傳統(tǒng)測定法如ELISA相比，它避 免了蛋白質(zhì)修飾和尋找二價抗原/抗體的工作。
[0016] 這類測定法可以用作靈敏、特異、強力和高通量的平臺以檢測健康、食品、獸醫(yī)和 環(huán)境相關(guān)活動中的多種靶物。
[0017] 如此，本發(fā)明的一個目的涉及提供一種檢測系統(tǒng)，其可以檢測不同于DNA和RNA的 分子。另一個目的是提供一種檢測系統(tǒng)，其可以檢測不同于DNA和RNA的小分子且僅需要 分析物上的一個結(jié)合位點來檢測分析物。這與例如需要分析物上的兩個結(jié)合位點的ELISA 測定法形成對比。對于小分析物，可能不存在兩個結(jié)合位點。
[0018] 如此，本發(fā)明的一個方面涉及用于檢測不同于DNA和RNA的分析物的分析物檢測 系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含至少第一寡核苷酸A、第二寡核苷酸B和第三寡核苷酸S，其中：
[0019] 寡核苷酸A和B各自包含與寡核苷酸S上的序列互補或部分互補的序列，且其中 寡核苷酸A和B在動態(tài)平衡中競爭與寡核苷酸S的雜交，且任選地其中寡核苷酸A和B的 至少一種包含能與不同于DNA和RNA的分析物相互作用的共價連接的結(jié)合模塊；且
[0020] 寡核苷酸A和B的至少一種或結(jié)合于所述寡核苷酸的共價連接的結(jié)合模塊能與不 同于DNA和RNA的分析物相互作用，從而所述分析物與所述寡核苷酸或結(jié)合模塊的相互作 用導(dǎo)致雜交平衡的迀移，所述平衡的迀移提供可檢測信號。
[0021] 分析物檢測系統(tǒng)的例示性例子呈現(xiàn)于圖1和2。
[0022] 如背景部分中描述的，描述了類似于本測定法的用于DNA檢測的測定法。然而，所 述設(shè)置不適用于檢測不同于DNA和RNA的分析物，如蛋白質(zhì)和小有機分子。對于這類目的， 更適用不同的系統(tǒng)如ELISA。
[0023]本發(fā)明的另一個方面涉及成套試劑盒（kit of parts)，其包含依照本發(fā)明的分析 物檢測系統(tǒng)。
[0024] 本發(fā)明的又一個方面提供了一種成套試劑盒，其包含依照本發(fā)明的第一寡核苷 酸、第二寡核苷酸和第三寡核苷酸。
[0025] 本發(fā)明的再一個方面提供了一種用于檢測樣品中不同于DNA和RNA的分析物的存 在或水平的方法，所述方法包括：
[0026] a)提供包含或懷疑包含感興趣分析物的樣品；
[0027] b)提供依照本發(fā)明的分析物檢測系統(tǒng)；
[0028] c)將所述樣品與所述分析物檢測系統(tǒng)一起溫育；
[0029]d)將分析物的檢測水平與參照水平比較；和
[0030] e)測定所述樣品中分析物的存在或水平。
[0031] 附圖簡述
[0032]圖1
[0033] 圖1顯示了本發(fā)明的一個具體實施方案，其具有依照本發(fā)明的第一寡核苷酸 1(SEQ ID N0:1)、第二寡核苷酸3(SEQ ID N0:2)和第三寡核苷酸5(SEQ ID N0:3)的特定 序列。8、8'和9、9'指示立足點區(qū)而7、7'指示分支迀移區(qū)。箭頭指示寡核苷酸的5'至3' 方向。
[0034]圖 2
[0035] 圖2顯示當分析物結(jié)合結(jié)合模塊（4)時平衡如何變化的例子。編號如圖1中所示。 a)沒有靶分析物，A和B可設(shè)計為具有相等或接近相等的與S雜交的概率，產(chǎn)生對于AS和 BS而言的50/50比率。b)在存在分析物時，分析物（在此情況中為靶物）的空間或靜電效 應(yīng)導(dǎo)致對B在分支迀移過程中運行的能量屏障，產(chǎn)生對于AS和BS而言的80/20比率。
[0036]圖 3
[0037]圖3顯示了當生物素是結(jié)合模塊而鏈霉親合素（STV)是分析物時的檢測系統(tǒng)。呈 現(xiàn)了包含對依照本發(fā)明的第一寡核苷酸1(SEQ ID N0:4)、第二寡核苷酸3 (SEQ ID N0:5)和 第三寡核苷酸5(SEQ ID N0:6)的修飾的特定序列。編號如圖1中指示。另外，2和6指示 信號傳導(dǎo)系統(tǒng)（siganlling system)，而4指示結(jié)合模塊。
[0038]圖 4
[0039] 圖4顯示用于鏈霉親合素（STV)檢測和用于生物素檢測的三鏈系統(tǒng)的結(jié)果。（a) 對于分別有和無STV的兩份樣品的標準化FRET效率。（b)對于分別有和無STV的兩份樣 品的熒光譜。（c)STV檢測的滴定曲線。（d)STV檢測測定法的非變性凝膠分析。頭兩道是 具有單生物素的系統(tǒng)，而最后兩道是具有雙生物素的系統(tǒng)。嵌入圖（inset)是通過兩位點 相互作用結(jié)合于鏈B上的STV的圖示。（e)通過抑制性策略對生物素的定量檢測。分析物 (生物素）首先與STV混合，然后將混合物添加到測定法。分析物將占據(jù)STV上的結(jié)合位 點，其因此被失活。
[0040]B 5
[0041] 圖5顯示了傳感器測定法的3種策略。在策略1中，通過與ABS系統(tǒng)上的結(jié)合模 塊相互作用獲得對分析物/靶物（例如蛋白質(zhì)或抗體）的直接檢測。在抑制性策略2中， 將未知的標本和相應(yīng)的蛋白質(zhì)預(yù)混合，接著添加到正常測定法中。如果標本包括游離配體， 那么它們將阻斷蛋白質(zhì)的結(jié)合位點，使其不能在測定法上發(fā)揮功能。在競爭性策略3中，首 先將相應(yīng)蛋白質(zhì)與正常DNA測定法混合以形成新測定法，然后添加未知的標本以與鏈B上 的配體競爭以結(jié)合蛋白質(zhì)，如此對平衡具有相反效果。
[0042]圖6
[0043] 圖6顯示了對照實驗。A)添加物對圖3中描述但無結(jié)合模塊的ABS系統(tǒng)的影響。 3種熒光團設(shè)置。B)添加物對圖3中描述但具有生物素結(jié)合模塊的ABS系統(tǒng)的影響。2種 熒光團設(shè)置。在添加任意分析物后沒有觀察到可檢測的變化，但當向含有生物素結(jié)合模塊 的系統(tǒng)添加鏈霉親合素時除外。
[0044]圖 7
[0045] 圖7顯示了鏈霉親合素結(jié)合測定法的動力學(xué)。分別具有4nt (左）和6nt (右）的 立足點長度的兩種測定法的比較。在這兩種測定法中，生物素修飾位于B的立足點區(qū)上，且 A和S具有一對熒光團（Alexa488&Alexa555)。結(jié)果指示更長的立足點（在A和B兩者上） 確保更快的平衡，其代價是導(dǎo)致更小的STV結(jié)合效果，這由（b)中的FRET結(jié)果確認。最終 設(shè)計優(yōu)選為動力學(xué)和信噪比的折中。另外，F(xiàn)RET測量表明3小時溫育足以使4nt系統(tǒng)在添 加STV后達到平衡（數(shù)據(jù)未顯示）。
[0046] B 8
[0047]圖8例示了當洋地黃毒苷（DIG)是結(jié)合模塊而抗洋地黃毒苷（aD)是分析物時的 檢測系統(tǒng)。圖A)顯示包含依照本發(fā)明的第一寡核苷酸1(SEQ ID N0:7)、第二寡核苷酸3(SEQ ID N0:8)和第三寡核苷酸5(SEQ ID N0:6)的修飾的特定序列。編號如圖1中指示。另外， 2和6指示信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，而4指示結(jié)合模塊。條形圖B)顯示在檢測aD時的原始FRET信 號變化。C)洋地黃毒苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖D)顯示在aD滴定到寡核苷酸1，3和5時的FRET 信號變化。E)顯示天然聚丙烯酰胺凝膠的熒光圖像，其中僅寡核苷酸A可見。在添加aD時 看到AS群體的增加。
[0048] M9
[0049]圖9例示了當洋地黃毒苷（DIG)是結(jié)合模塊而抗洋地黃毒苷（aD)是分析物時人 血漿中的檢測系統(tǒng)。圖A)編號與圖8A相同。圖B)是三重對照實驗的結(jié)果，其與具有人血 漿的樣品比較沒有任何添加人血漿的傳感器（ABS)的設(shè)置。第1和3欄顯示在沒有人血漿 的情況下檢測aD時的FRET變化，而第2和5欄顯示人血漿中的FRET變化。第4和6欄分 別顯示在沒有和具有人血漿的情況下檢測游離洋地黃毒苷的競爭性測定法。
[0050]圖 10
[0051] 圖10例示了當洋地黃毒苷〇)IG)是結(jié)合模塊而抗洋地黃毒苷（aD)是分析物時人 唾液中的檢測系統(tǒng)。圖A)編號與圖8A相同。條形圖B)顯示在唾液樣品中檢測aD時AS 群體中的變化。
[0052] 圖 11
[0053] 圖11例示了當幾種洋地黃毒苷（DIG)分子充當結(jié)合模塊而抗洋地黃毒苷（aD)是 分析物時的檢測系統(tǒng)。圖A)顯示了包含依照本發(fā)明的第一寡核苷酸1(SEQ ID N0:7)、第二 寡核苷酸3 (SEQ ID NO: 9)和第三寡核苷酸5 (SEQ ID NO: 6)的修飾的特定序列。該圖還例 示了用于aD結(jié)合的幾種DIG模塊。條形圖B)顯示了檢測aD時AS群體中的變化。
[0054]圖12
[0055] 圖12例示了當充當競爭性/抑制性傳感器時的檢測系統(tǒng)。這里洋地黃毒苷（DIG) 與抗洋地黃毒苷（aD) -起充當結(jié)合模塊而游離DIG充當分析物。圖A)編號與圖8A相同。 條形圖B)顯示檢測緩沖液、人血漿和人唾液中的游離DIG的抑制性測定法中的AS群體變 化。
[0056]圖13
[0057] 圖13例示了通過抑制性測定法或競爭性測定法的DIG滴定曲線。
[0058] 圖 14
[0059] 圖14例示了當維生素D(VD)是結(jié)合模塊而維生素D結(jié)合蛋白（DBP)是分析物時 的檢測系統(tǒng)。此外，它還顯示在抑制性和競爭性測定法中作為靶物的游離維生素D。該示意 圖顯示通過DBP對B上VD的結(jié)合輔助的B鏈置換。條帶迀移測定法顯示天然聚丙烯酰胺 凝膠的熒光圖像，其中僅寡核苷酸A可見。在添加DBP時看到AS群體的增加。第一個圖顯 示DBP到傳感器的滴定。第二和第三個圖分別顯示對VD的抑制性和競爭性檢測。
[0060]圖15
[0061] 圖15顯示了用于DNA檢測的三鏈適體系統(tǒng)的設(shè)計和結(jié)果。呈現(xiàn)了包含依照本發(fā)明 的第一寡核苷酸1(SEQ ID N0:10)、第二寡核苷酸3 (SEQ ID N0:11)和第三寡核苷酸5 (SEQ ID N0:12)的修飾的特定序列。編號如圖1和3中指示的。（A)通過結(jié)構(gòu)-轉(zhuǎn)換適體的ATP 檢測方案。ATP的結(jié)合將縮短B上的有效立足點，由此阻礙BS的形成。（B)ATP檢測的滴定 曲線。
[0062] 圖 16
[0063] 圖16顯示了當使用拆分DNA過氧化物酶（split DNA peroxidase)信號傳導(dǎo)系統(tǒng) 時的系統(tǒng)。呈現(xiàn)了包含依照本發(fā)明的第一寡核苷酸1(SEQ ID N0:13)、第二寡核苷酸3(單 生物素：SEQ ID N0:5和雙生物素：SEQ ID N0:14)和第三寡核苷酸5 (SEQ ID N0:15)的修 飾的特定序列。編號如圖1和3中指示的。使用兩生物素系統(tǒng)，甚至可以肉眼檢查。顯示 了使用一個生物素和兩個生物素的檢測。（A)通過使用拆分DNA過氧化物酶信號傳導(dǎo)系統(tǒng) 的STV檢測的方案和結(jié)果。當在B上摻入兩個生物素時，顏色差異在存在STV時是明顯的， 甚至可由肉眼區(qū)分。（B)在一個或兩個生物素的情況下有或無STV的樣品的吸光度。
[0064]圖17
[0065] 圖17顯示依照本發(fā)明的單鏈系統(tǒng)的設(shè)計。編號如圖1和3中指示的。另外，11指 示接頭區(qū)。
[0066]圖 18
[0067] 圖18呈現(xiàn)了用于STV檢測的單鏈系統(tǒng)和當使用實施例12中呈現(xiàn)的序列時獲得的 結(jié)果。（a)通過使用單鏈系統(tǒng)的STV檢測方案。立足點交換反應(yīng)在分子內(nèi)發(fā)生，且所得構(gòu) 象可通過來自拆分DNA過氧化物酶的顏色變化來鑒定。（b)有或無STV的單鏈樣品的吸光 度。
[0068]圖 19
[0069] 圖19呈現(xiàn)了用于檢測特殊小分子或離子的策略。（a)通過利用經(jīng)由氫鍵鍵合的 兩面三聚氰胺-胸腺嘧啶識別的三聚氰胺檢測方案（嵌入圖）。沒有三聚氰胺，鏈A比鏈B 具有更長的立足點，如此具有更高的與S結(jié)合的優(yōu)先權(quán)。當有三聚氰胺（其可充當T-T錯 配的連接物）時，鏈B比A具有更長的立足點，因此預(yù)期更多的BS雙鏈體。（b)使用與（a) 相同的設(shè)置，可檢測二價汞陽離子，因為Hg2+因其在DNA中的T-T錯配位點形成高度特異性 的"夾心"復(fù)合物而出名，其中Hg2+在任一側(cè)上的胸腺嘧啶殘基的N1氮之間線性鍵合（嵌 入圖）。
[0070]圖20
[0071]圖20例示了更先進的策略，其中鏈S在內(nèi)部具有一個（a)或兩個（b)發(fā)夾。內(nèi)部 發(fā)夾的功能是在經(jīng)標記配體及其結(jié)合蛋白質(zhì)的位置周圍構(gòu)建多臂匯合點（junction)，目的 是通過其三維構(gòu)象生成更大的空間阻礙以阻止S與具有結(jié)合蛋白質(zhì)的B之間的雜交。
[0072] 現(xiàn)將以更多細節(jié)在下文描述本發(fā)明。
[0073] 發(fā)明詳述
[0074] 分析物檢測系統(tǒng)
[0075] 在一個方面，本發(fā)明涉