一種電化學(xué)dna生物傳感器及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供的一種電化學(xué)DNA生物傳感器，以金電極作為基體電極，地高辛抗原標(biāo)記的寡核苷酸鏈與二茂鐵標(biāo)記的寡核苷酸鏈結(jié)合，并由二茂鐵標(biāo)記的寡核苷酸鏈修飾在金電極表面。還提供了該傳感器的制備方法與應(yīng)用。該電化學(xué)DNA生物傳感器結(jié)構(gòu)簡單、制備工藝簡單，特異性好、靈敏度高，可用于地高辛抗體的檢測。
【專利說明】—種電化學(xué)DNA生物傳感器及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物檢測領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測地高辛抗體濃度的電化學(xué)DNA生物傳感器。
【背景技術(shù)】
[0002]地高辛(Digoxin)是一種從洋地黃提取出的beta抑制劑性的藥物,被廣泛用于治療高血壓、瓣膜性心臟病、先天性心臟病等急性和慢性心功能不全的一種藥物。由于地高辛的治療指數(shù)狹窄，用藥過量與用藥不足時(shí)的癥狀相似，加之其個(gè)體差異大，故中毒的發(fā)生率高，是臨床上劑量最難掌握藥物之一。
[0003]目前解除地高辛毒性的最有效的方法是應(yīng)用地高辛抗體。此外，采用抗地高辛抗體的免疫分析法監(jiān)測血清、血漿地高辛濃度已成為當(dāng)今治療性藥物監(jiān)測的典范。測定血清地高辛濃度，還可提供其不同個(gè)體間生物利用度及藥效學(xué)差異方面的信息，目前被廣泛用于判斷地高辛中毒及指導(dǎo)臨床用藥，對于保證其治療的有效性及安全性具有重要意義。
[0004]現(xiàn)在抗體檢測的方法眾多，除傳統(tǒng)的沉淀反應(yīng)、凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)外，標(biāo)記免疫測定(如酶聯(lián)免疫測定、放射免疫測定、熒光免疫測定、發(fā)光免疫測定等)已成為主要的免疫測定技術(shù)，然而這些方法靈敏度低、實(shí)驗(yàn)成本高。
[0005]DNA傳感器是一種以DNA為敏感元件，通過換能器將DNA與DNA、DNA與RNA、DNA與其它有機(jī)無機(jī)離子之間的作用的生物學(xué)信號轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓹z測的光、電、聲波等物理信號。近年來，DNA傳感器在基因診斷、環(huán)境監(jiān)控、藥物研究等領(lǐng)域的應(yīng)用研究受到廣泛重視，然而NA傳感器還沒有被應(yīng)用到地高辛抗體的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]發(fā)明目的:本發(fā)明的第一目的是提供一種電化學(xué)DNA生物傳感器及其制備方法。
[0007]本發(fā)明的第二目的是利用提供上述電化學(xué)DNA生物傳感器在地高辛抗體檢測中的應(yīng)用。
[0008]技術(shù)方案:本發(fā)明提供的一種電化學(xué)DNA生物傳感器，以金電極作為基體電極，地高辛抗原標(biāo)記的寡核苷酸鏈與二茂鐵標(biāo)記的寡核苷酸鏈結(jié)合，并由二茂鐵標(biāo)記的寡核苷酸鏈修飾在金電極表面。
[0009]本發(fā)明還提供了上述電化學(xué)DNA生物傳感器的制備方法，包括以下步驟:
[0010](I)修飾的金電極的制備:將金電極浸泡在二茂鐵標(biāo)記的寡核苷酸鏈溶液中使反應(yīng)，即得修飾的金電極；
[0011](2) DNA生物傳感器的制備:修飾的金電極浸入地高辛抗原標(biāo)記的寡核苷酸鏈、硝酸銀的混合溶液中，避光反應(yīng)，即得。
[0012]其中，步驟(I)中，反應(yīng)溫度為室溫，反應(yīng)時(shí)間為12h，二茂鐵標(biāo)記的寡核苷酸鏈溶液的摩爾濃度為lumol/L。
[0013]其中，步驟(2)中，反應(yīng)溫度為室溫，反應(yīng)時(shí)間為2h ;混合溶液中寡核苷酸鏈的摩爾濃度為lumol/L，硝酸銀的摩爾濃度為10umol/L。
[0014]本發(fā)明還提供了上述電化學(xué)DNA生物傳感器在地高辛抗體檢測中的應(yīng)用。
[0015]所述應(yīng)用，具體為:將權(quán)利要求1所述的電化學(xué)DNA生物傳感器浸入待測溶液中反應(yīng)，在高氯酸鉀溶液中，檢測電化學(xué)信號，通過電化學(xué)信號的變化測定地高辛抗體濃度。
[0016]其中，反應(yīng)溫度為室溫,反應(yīng)時(shí)間為45min,高氯酸鉀溶液濃度為0.lmol/L。
[0017]有益效果:本發(fā)明提供的電化學(xué)DNA生物傳感器結(jié)構(gòu)簡單、制備工藝簡單，特異性好、靈敏度高，可用于地高辛抗體的檢測。
[0018]該電化學(xué)DNA生物傳感器利用抗體與抗原的結(jié)合使DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致電化學(xué)信號的變化來直觀的進(jìn)行檢測，檢測方法簡單快捷、穩(wěn)定性好。
[0019]該電極的工作原理為:
[0020](I)修飾的金電極的電化學(xué)信號:二茂鐵標(biāo)記的寡核苷酸鏈上的巰基能夠與金電極形成金-硫化學(xué)鍵，使得該條寡核苷酸鏈能夠固定到電極表面，此時(shí)的寡核苷酸鏈?zhǔn)前l(fā)卡式結(jié)構(gòu)，其一端標(biāo)記的二茂鐵離電極表面很近，因此電化學(xué)信號很強(qiáng)。
[0021](2)本發(fā)明DNA生物傳感器的電化學(xué)信號:銀離子與胞嘧啶、鳥嘌呤之間的化學(xué)作用，使得固定在電極表面的二茂鐵標(biāo)記的寡核苷酸鏈的發(fā)卡式結(jié)構(gòu)打開，與地高辛抗原標(biāo)記的寡核苷酸鏈形成穩(wěn)定的DNA三鏈結(jié)構(gòu)，同時(shí)使二茂鐵離電極的距離變遠(yuǎn)，因此電化學(xué)信號較弱。
[0022](3)地高辛抗體的檢測:待測溶液中若存在地高辛抗體，其與地高辛抗原標(biāo)記的寡核苷酸鏈上的地高辛抗原特異性結(jié)合，使得地高辛抗原標(biāo)記的寡核苷酸鏈脫離金電極表面，固定在金電極表面的二茂鐵標(biāo)記的寡核苷酸鏈恢復(fù)發(fā)卡式結(jié)構(gòu)，使二茂鐵離電極的距離變小，測得的電化學(xué)信號較強(qiáng)；通過電化學(xué)信號的變化間接的檢測抗體。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明電化學(xué)DNA生物傳感器的制備工藝流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0025]實(shí)施例1
[0026]電化學(xué)DNA生物傳感器的制備。
[0027]I試劑和儀器
[0028]試劑:地高辛抗體、地高辛抗原標(biāo)記的寡核苷酸鏈(Capture DNA)、二茂鐵標(biāo)記的寡核苷酸鏈(Fc-ριχΛθ DNA)、硝酸銀、醋酸鎂、磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉；
[0029]儀器:金電極、鉬電極、飽和氯化鉀電極、CHI電化學(xué)工作站。
[0030]2 方法
[0031](I)金電極的預(yù)處理
[0032]將金電極在濕潤的加有氧化鋁粉末(粒徑為0.05微米)的麂皮上打磨2分鐘，用乙醇和二次水依次沖洗，超聲5分鐘后，用氮?dú)獯蹈?；打磨的過程中會將殘留在電極表面的物質(zhì)去除并使電極表面光滑，便于對金電極修飾。
[0033](2)修飾的金電極的制備
[0034]將處理好的金電極在摩爾濃度為lumol/L的二茂鐵標(biāo)記的寡核苷酸鏈(Fc-probeDNA)的水溶液中室溫浸泡12小時(shí)，二次水沖洗、氮?dú)獯蹈桑吹谩?br> [0035](3)電化學(xué)DNA生物傳感器的制備修飾的金電極
[0036]將修飾的金電極浸入含硝酸銀和地高辛抗原標(biāo)記的寡核苷酸鏈(Capture DNA)的混合溶液中避光室溫反應(yīng)2小時(shí)，其中，混合溶液中寡核苷酸鏈的摩爾濃度為lumol/L，硝酸銀的摩爾濃度為10umol/L ;二次水沖洗、氮?dú)獯蹈桑吹谩?br> [0037]實(shí)施例2電化學(xué)DNA生物傳感器檢測地高辛抗體濃度
[0038]將實(shí)施例1至3制得的電化學(xué)DNA生物傳感器應(yīng)用于地高辛抗體檢測，設(shè)定三組平行實(shí)驗(yàn)。
[0039]實(shí)施例1 組:配置濃度分別為 10ng、lng、500pg、100pg、50pg、10pg、5pg 和 Ipg 的地高辛抗體溶液，將電化學(xué)DNA生物傳感器置于分別置于不同濃度的地高辛抗體溶液中室溫反應(yīng)45min，二次水沖洗，在0.lmol/L高氯酸鉀溶液中檢測電化學(xué)信號，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程式 y=5.334x+66.069。
[0040]在空白樣中依次加入lng、250pg、10pg待測物，將實(shí)施例1至3制得的電化學(xué)DNA生物傳感器測定一組待測樣品，結(jié)果見表1。
[0041]現(xiàn)有方法步驟為:
[0042]表1測定一組待測樣品中地高辛抗體濃度結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種電化學(xué)DNA生物傳感器，其特征在于:以金電極作為基體電極，地高辛抗原標(biāo)記的寡核苷酸鏈與二茂鐵標(biāo)記的寡核苷酸鏈結(jié)合，并由二茂鐵標(biāo)記的寡核苷酸鏈修飾在金電極表面。
2.—種權(quán)利要求1所述的電化學(xué)DNA生物傳感器的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)修飾的金電極的制備:將金電極浸泡在二茂鐵標(biāo)記的寡核苷酸鏈溶液中使反應(yīng)，即得修飾的金電極； (2)DNA生物傳感器的制備:修飾的金電極浸入地高辛抗原標(biāo)記的寡核苷酸鏈、硝酸銀的混合溶液中，避光反應(yīng)，即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種權(quán)利要求1上述的電化學(xué)DNA生物傳感器的制備方法，其特征在于:步驟(I)中，反應(yīng)溫度為室溫，反應(yīng)時(shí)間為12h，二茂鐵標(biāo)記的寡核苷酸鏈溶液的摩爾濃度為I μ mol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種權(quán)利要求1上述的電化學(xué)DNA生物傳感器的制備方法，其特征在于:步驟(2)中，反應(yīng)溫度為室溫，反應(yīng)時(shí)間為2h ;混合溶液中寡核苷酸鏈的摩爾濃度為lymol/L，硝酸銀的摩爾濃度為10 μ mol/L。
5.權(quán)利要求1所述的電化學(xué)DNA生物傳感器在地高辛抗體檢測中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:具體為:將權(quán)利要求1所述的電化學(xué)DNA生物傳感器浸入待測溶液中反應(yīng)后，在高氯酸鉀溶液中，檢測電化學(xué)信號，通過電化學(xué)信號的變化測定地高辛抗體濃度。
【文檔編號】G01N27/327GK103792274SQ201410035109
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月24日
【發(fā)明者】衛(wèi)偉, 倪薔薇, 劉松琴 申請人:東南大學(xué)