專利名稱：用于傳送異源核酸的微粒體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及藥物組合物。具體而言，本發(fā)明涉及具有吸附表面的聚合物微粒體或亞微粒體乳劑，在所述表面上，吸附有生物學(xué)活性試劑，具體是核酸，如質(zhì)粒DNA、真核生物層狀載體起始系統(tǒng)(ELVIS載體)或RNA載體構(gòu)建物。本發(fā)明還涉及制備所述微粒體和亞微粒體乳劑的方法，以及它們的用途，包括用于誘導(dǎo)免疫反應(yīng)、疫苗和傳送異源核苷酸序列給真核生物細(xì)胞和動物。
背景為了獲得受控的、胃腸外傳遞的治療用化合物，使用了微粒體載體。將這種載體設(shè)計(jì)為在傳遞系統(tǒng)中長時間地保持活性劑。微粒體載體的例子包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的微粒體載體，以及衍生自聚(丙交酯)(見美國專利3,773,919)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(被稱做PLG，見美國專利4,767,628)和聚乙二醇(被稱作PEG、見美國專利5,648,095)的微粒體。聚甲基丙烯酸甲酯聚合物是不可降解的，而PLG顆粒則通過酯鍵的隨機(jī)非酶促水解成乳酸和羥基乙酸而被生物降解，所生成的乳酸和羥基乙酸沿著正常的代謝途徑排泄。
例如，美國專利5,648,095描述了具有膠囊化藥物的微球體作為藥物傳遞系統(tǒng)在鼻、口、肺和口腔的傳遞中的用途。還描述了含有各種多肽生長因子的緩釋制劑。見例如，國際出版號WO 94/12158，美國專利5,134,122和國際出版號WO 96/37216。
Fattal等，Journal of Controlled Release 53137-143(1998)描述了從吸附了寡核苷酸的聚烷基氰基丙烯酸酯(PACA)制備的極小顆粒。
還已使用了具有吸附或嵌入抗原的微粒體載體，試圖引發(fā)適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)。這種載體給免疫系統(tǒng)提供了一個選擇性抗原的多個拷貝，并促進(jìn)局部淋巴結(jié)中抗原的引入和保持。這些顆?？梢员痪奘杉?xì)胞吞噬，并且可以通過細(xì) 其中劃成虛線的鍵是單鍵或E/Z-雙鍵，這里在雙鍵位于環(huán)上時，該化合物可以E和Z型存在，以及具有手性中心的化合物不但可以(R)-或(S)-型而且還可以作為對映體混合物存在，R1和R2相同或不同，表示氫或低級烷基，x表示具有1至4個碳原子的飽和亞烷基鏈和y表示具有4至10個碳原子的飽和亞烷基鏈，這里不包括其中R1和R2表示氫且x+y＝11個碳原子和其中R1表示甲基和R2表示氫且x+y＝8個碳原子的飽和化合物。
低級烷基通常表示具有1至6個碳原子的飽和烴基。例如可提及的是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、戊基、異戊基、己基和異己基。
優(yōu)選的基團(tuán)是氫、甲基和乙基。
具有1至4個碳原子的亞烷基鏈通常表示亞甲基、亞乙基、亞丙基和亞丁基。
這里優(yōu)選的是亞甲基、亞乙基和亞丁基。
具有4至10個碳原子的亞烷基鏈通常表示亞丁基、亞戊基、亞己基、亞庚基、亞辛基、亞壬基和亞癸基。
這里優(yōu)選亞丁基、亞辛基和亞壬基。
因此，本發(fā)明新的1，4-二噁環(huán)烷-2-酮和1，4-二噁環(huán)烯-2-酮包括14-至18-元飽和或不飽和、未取代或被低級烷基取代的1，4-二噁環(huán)烷-2-酮和1，4-二噁環(huán)烯-2-酮。
特別地可提及下列1，4-二噁環(huán)烷-2-酮和1，4-二噁環(huán)烯-2-酮1，4-二噁-(E/Z)-9-環(huán)十四烯-2-酮1，4-二噁環(huán)十四烷-2-酮3-甲基-1，4-二噁-(E/Z)-6-環(huán)十五烯-2-酮3-甲基-1，4-二噁環(huán)十五烷-2-酮1，4-二噁-(E/Z)-6-環(huán)十五烯-2-酮1，4-二噁環(huán)十五烷-2-酮3-甲基-1，4-二噁-(E/Z)-6-環(huán)十六烯-2-酮3-甲基-1，4-二噁環(huán)十六烷-2-酮1，4-二噁-(E/Z)-6-環(huán)十六烯-2-酮1，4-二噁環(huán)十六烷-2-酮1，4-二噁-(E/Z)-7-環(huán)十六烯-2-酮1，4-二噁-(E/Z)-7-環(huán)十七烯-2-酮3-甲基-1，4-二噁-(E/Z)-7-環(huán)十六烯-2-酮3-甲基-1，4-二噁-(E/Z)-7-環(huán)十七烯-2-酮3-甲基-1，4-二噁環(huán)十七烷-2-酮。
本發(fā)明其中官能團(tuán)相互緊密鄰近的1，4-二噁環(huán)烷-2-酮和1，4-二噁環(huán)烯-2-酮以理想的方式完成本發(fā)明的任務(wù)。除在香味上感興趣的類麝香味的特點(diǎn)外，它們的特點(diǎn)還在于非常好的附著性以及低的閾值。
飽和的在3-位上被甲基取代的1，4-二噁環(huán)烷-2-酮，特別是3-甲基-1，4-二噁環(huán)十五烷-2-酮和3-甲基-1，4-二噁環(huán)十六烷-2-酮具有嗅覺上特別吸引人的氣味。它與眾不同之處在于其甜的、木香-龍涎香、動物性、性感的和因此非常自然的麝香特點(diǎn)。不飽和3-甲基-1，4-二噁環(huán)烯-2-酮的嗅覺上的特征非常類似于飽和化合物，但是其強(qiáng)度較低。為了進(jìn)行比較，合成類似的3-位上無甲基取代的1，4-二噁環(huán)烷-2-酮和1，4-二噁環(huán)烯-2-酮。令人驚奇地，在不飽和1，4-二噁環(huán)烯-2-酮的情況下，為了嗅覺上所描述的金屬味暖香、熨斗味香，性感的、動物性暖香方面卻變得無足輕重。與此相反飽和的1，4-二噁環(huán)烷-2-酮，這里特別是1，4-二噁環(huán)十六烷-2-酮再次以其非常宜人的類天然麝香性而引人注目。
與已知的1，4-二噁環(huán)十七烷-2-酮和3-甲基-1，4-二噁環(huán)十四烷-2-酮相比，令人驚奇的是，本發(fā)明的1，4-二噁環(huán)烷-2-酮和1，4-二噁J.Immunol.，1998，160，5898-5906；PCT出版物WO 96/02555；PCT出版物WO 98/16247；PCT出版物WO 98/18810；PCT出版物WO 98/40100；PCT出版物WO 98/55495；PCT出版物WO 98/37919；和PCT出版物WO 98/52581，本文將上述公開的全部內(nèi)容納入作為參考。
還已顯示，可將陽離子性脂質(zhì)基的乳劑用作基因載體。參見，例如Yi等，Proc.Int′l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater，24653-654(1997)；Kim等，Proc.Int′l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater，25344-345(1998)；Kim等，Proc.Int′l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater，26，#5438(1999)。陽離子亞微粒體乳劑是最近用于傳送藥物的一種方法，這種乳劑首次顯示出攜帶小分子藥物的能力(Elbaz等，1993，Int.J.Pharm.，96 R1-R6)。已證明小的寡聚物〔Teixera等(1999)，Pharm Res，16，30-36〕和質(zhì)粒DNA〔Yi等(2000)，Pharm Res，17，314-320〕兩者都可使用帶電表面來穩(wěn)定結(jié)合和保護(hù)血清中的寡核苷酸。已顯示DOTAP基的乳劑能在體外和體內(nèi)增強(qiáng)轉(zhuǎn)染(Kim等，同上)。
因而需要能引起Th1細(xì)胞應(yīng)答增加并可用于預(yù)防和治療的佐劑。這種應(yīng)答有助于治療如病毒感染，以及使易受病毒感染的個體產(chǎn)生免疫。
美國專利5,814,482和6,015,686公開了真核生物分層載體起始系統(tǒng)(ELVIS載體)，特別是從α病毒基因組(如新德比斯病毒)衍生和構(gòu)建得到的載體，用于刺激針對抗原的免疫反應(yīng)、抑制病原體的方法、以及向(尤其是)真核生物的細(xì)胞和動物傳遞異源核苷酸序列。
共同擁有的國際專利申請PCT/US99/17308和美國專利申請09/715,902公開了吸附了大分子的微粒體的制備方法，這些大分子例如藥物、多核苷酸、多肽、蛋白質(zhì)、激素、酶、轉(zhuǎn)錄或翻譯介質(zhì)、代謝途徑的中間體、免疫調(diào)節(jié)劑、抗原、佐劑或它們的組合物等。
共同擁有的國際專利申請PCT/US00/03331公開了制備吸附了大分子的亞微粒體乳劑的方法，所述大分子例如藥物、多核苷酸、多肽、蛋白質(zhì)、激素、酶、轉(zhuǎn)錄或翻譯介質(zhì)、代謝途徑的中間體、免疫調(diào)節(jié)劑、抗原、佐劑或它們的組合物等。
發(fā)明綜述本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，通過使載體構(gòu)建物吸附到具有吸附表面的聚合物微粒體或亞微粒體乳劑上，可增強(qiáng)核酸，尤其是能表達(dá)核酸序列的載體構(gòu)建物(更具體是含有編碼抗原的異源核酸序列的載體構(gòu)建物，如pCMV載體、ELVIS載體或RNA載體構(gòu)建物)的各種用途的有效性，這種有效性有利于這些載體構(gòu)建物和含于該載體構(gòu)建物的異源核酸序列導(dǎo)入動物細(xì)胞中。
如上述國際專利申請PCT/US99/17308中所述，已發(fā)明了制備具有吸附表面的能吸附各種大分子的微粒體的方法。在一個實(shí)施例中，這些微粒體由聚合物和去污劑組成。本發(fā)明的微粒體相對于目前能獲得的微粒體，能更有效地吸附這類大分子。
本發(fā)明的幾個實(shí)施例利用從聚合物衍生得到的與去污劑形成的微粒體，這些聚合物如聚(α-羥基酸)、聚羥基丁酸、聚己酸內(nèi)酯、聚原酸酯、多酐、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯等等，所述去污劑如陽離子、陰離子或非離子去污劑，這些去污劑可混合使用。本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)，這些微粒體提供載體構(gòu)建物(如ELVIS載體，RNA載體構(gòu)建物)以及病毒抗原的改善的吸附，并提供優(yōu)良的免疫反應(yīng)。
如上述國際專利申請PCT/US00/03331所述，已發(fā)明了含有具有離子表面活性劑的油滴亞微粒體乳劑的微粒體制品。這種組合物容易吸附大分子，如DNA、蛋白質(zhì)和其它抗原分子。本發(fā)明的幾個實(shí)施例利用由油滴乳劑衍生得到的微粒體，該乳劑較佳含有可代謝的油和乳化劑，該微粒體較佳是成水包油乳劑形式，基本上所有的油滴的直徑都小于1微米，較佳小于250納米。較佳的是，該組合物處于缺乏任何聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物的狀態(tài)之下。油較佳是動物油、未飽和的烴類、萜類，如角鯊烯，或者是植物油。該組合物較佳在水性介質(zhì)中含有0.5-20體積％的油。乳化劑較佳含有非離子去污劑，如聚氧乙烯山梨糖醇單酯、二酯或三酯，或者山梨糖醇單酯、二酯或三酯、較佳的是，該組合物含有約0.01-5重量％的乳化劑。
因此，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明組合物的顆粒部分是具有吸附表面的微粒體，其中該微粒體含有選自聚(α-羥基酸)、聚羥基丁酸、聚己酸內(nèi)酯、聚原酸酯、多酐、聚氰基丙烯酸酯的聚合物。
在其它一些實(shí)施例中，本發(fā)明組合物的顆粒部分是亞微粒體乳劑，它含有與離子型去污劑配置而成的油滴乳劑。
在其它一些實(shí)施例中，所述微粒體還含有能表達(dá)核酸序列(如吸附于該微粒體表面上的選擇的ELVIS載體或RNA載體構(gòu)建物)的載體構(gòu)建物，該載體構(gòu)建物含有編碼多肽、蛋白質(zhì)、激素、酶、轉(zhuǎn)錄或翻譯介質(zhì)、代謝途徑中間物、免疫調(diào)節(jié)子、抗原、佐劑或它們的組合等等的異源核苷酸序列。
在其它實(shí)施例中，本發(fā)明涉及含有核酸、較佳是能表達(dá)吸附于本發(fā)明的微粒體上的核酸序列的載體構(gòu)建物(如選擇的pCMV載體、ELVIS載體或RNA載體構(gòu)建物)和藥學(xué)上可接受的賦形劑的微粒體組合物。
在其它實(shí)施例中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)吸附了核酸、較佳是能表達(dá)核酸序列的載體構(gòu)建物(如ELVIS載體或RNA載體構(gòu)建物)的微粒體的方法，該方法包括(a)將聚合物溶液與陰離子、陽離子或非離子去污劑混合，形成聚合物/去污劑混和物；其中，所述聚合物溶液含有選自聚(α-羥基酸)、聚羥基丁酸、聚己內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酐和聚氰基丙烯酸酯的聚合物，該聚合物的濃度為約占有機(jī)溶劑的1-30％，該去污劑與聚合物的比值為0.001-10(w/w)；(b)分散所得聚合物/去污劑混合物；(c)除去有機(jī)溶劑；(d)回收微粒體；(f)將ELVIS載體或RNA載體構(gòu)建物吸附到微粒體的表面上，其中所述ELVIS載體或RNA載體構(gòu)建物含有編碼多肽、蛋白質(zhì)、激素、酶、轉(zhuǎn)錄或翻譯介質(zhì)、代謝途徑中間物、免疫調(diào)節(jié)子、抗原、佐劑或它們的組合等等的異源核苷酸序列。
較佳的是，在除去有機(jī)溶劑之前，先將該聚合物/去污劑混合物乳化形成乳劑。
在其它實(shí)施例中，本發(fā)明涉及由上述方法產(chǎn)生的微粒體。更佳的是，產(chǎn)生還含有藥學(xué)上可接受的賦形劑的微粒體組合物。
在其它實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種傳送異源核苷酸序列給脊椎動物的方法，該方法包括向脊椎動物對象給予上述任何一種組合物。
在額外的實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種在脊椎動物對象中引起細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法，該方法包括向所述脊椎動物對象給予治療有效量的吸附于本發(fā)明的微粒體上的選擇異源核苷酸序列。
在其它實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種免疫法，該方法包括向脊椎動物對象給予治療有效量的上述任一種微粒體組合物。該組合物可任選地含有游離的大分子，還可任選地含有佐劑(包括鋁鹽，如磷酸鋁)，或者含有至少一個CpG基序的寡核苷酸。
在幾個優(yōu)選的實(shí)施例中。所述微粒體由聚(α-羥基酸)形成，較佳的是由聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)形成，最佳是由聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)形成。
先前有限描述的各個吸附微粒體還可任選地含有包埋于其中或存在于自由溶液中的大分子。因此，本發(fā)明包括各種組合，其中核酸分子被吸附在微粒體上，其它核酸分子被俘獲或吸附。此外，本發(fā)明的微粒體可具有一種以上核酸吸附于其上，以及其它的抗原大分子吸附于其上。此外，微粒體中可具有幾種核酸和/或其它抗原大分子包埋于其中。
在其它優(yōu)選的實(shí)施例中，以上述亞微粒體乳劑的形式制備所述微粒體。
本發(fā)明還涉及含有免疫刺激量的核酸(如能表達(dá)核酸序列的載體構(gòu)建物，如選擇的ELVIS載體或RNA載體構(gòu)建物，其中ELVIS載體或RNA載體構(gòu)建物的異源核酸序列部分可編碼抗原)和本文所述的免疫刺激量的佐劑組合物的免疫原性組合物。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述免疫原性組合物含有CpG寡核苷酸以及吸附于微粒體上的核酸。吸附的大分子本身較佳是編碼抗原性多肽的ELVIS載體或RNA載體構(gòu)建物。
在本發(fā)明一些優(yōu)選的實(shí)施例中，抗原性多肽從以下的病毒獲得C型肝炎病毒(HCV)、B型肝炎病毒(HBV)、皰疹病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、流感病毒(flu)、狂犬病毒。較佳的是，抗原性多肽選自HSV糖蛋白gD、HIV糖蛋白gp120、HIV糖蛋白gp140、HIV p55 gg，以及從pol與tat區(qū)域獲得的多肽。在本發(fā)明其它優(yōu)選的實(shí)施例中，抗原性多肽從細(xì)菌得到，如霍亂、白喉、破傷風(fēng)、鏈球菌(如B鏈球菌)、百日咳、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria Meningitidis)(如B型腦膜炎)、淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)、幽門螺旋菌(Helicobacter pylori)、流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenza)。在本發(fā)明其它優(yōu)選的實(shí)施例中，抗原性多肽從寄生蟲獲得，如瘧疾寄生蟲。
佐劑組合物可包括如鋁鹽?；蛘撸魟┙M合物可包括含有至少一個CpG基序的寡核苷酸。佐劑組合物還含有產(chǎn)生正電荷乳劑的任選組分。寡核苷酸較佳含有至少一個硫代磷酸酯鍵或肽核酸鍵。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，寡核苷酸含有選自SEQ ID NO1-28的核苷酸序列。在本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施例中，寡核苷酸含有在其5′端直接連接兩個嘌呤、在其3′端直接連接兩個嘧啶的CpG基序。在本發(fā)明其它優(yōu)選的實(shí)施例中，寡核苷酸含有選自SEQ ID NO19-28的核苷酸序列。最佳的序列是SEQ ID NO28。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施例中，佐劑組合物還含有分離的免疫刺激劑，該刺激劑優(yōu)選選自鋁鹽、細(xì)菌細(xì)胞壁成分和胞壁酰肽。佐劑組合物本身可以是第二種微粒體的形式。所述第二種微粒體可吸附和/或俘獲各種核酸和/或抗原性多肽，或者其它抗原性大分子。此外，免疫原性組合物可含有存在于溶液中的游離核酸。
本發(fā)明還涉及在宿主動物中刺激免疫反應(yīng)的方法，該方法包括向該動物給予有效誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的量的本文所述免疫原性組合物。所述宿主動物較佳是哺乳動物，更佳是獼猴，仍更佳是人。
本發(fā)明還涉及使宿主動物針對病毒、細(xì)菌或寄生蟲產(chǎn)生免疫的方法，該方法包括向所述動物給予其量能有效誘導(dǎo)保護(hù)性反應(yīng)的本文所述免疫原性組合物。所述宿主動物較佳是哺乳動物，更佳是獼猴，還更佳是人。
本發(fā)明還涉及增加宿主動物中的Th1免疫反應(yīng)或CTL反應(yīng)或淋巴細(xì)胞增殖或細(xì)胞因子生產(chǎn)的方法，該方法包括向所述動物給予其量能有效誘導(dǎo)Th1免疫反應(yīng)或CTL反應(yīng)或淋巴細(xì)胞增殖或細(xì)胞因子生產(chǎn)的本文所述的免疫原性組合物。所述宿主動物較佳是哺乳動物，更佳是獼猴，還更佳是人。
本發(fā)明還涉及增強(qiáng)宿主動物中的免疫反應(yīng)的方法，該方法包括先給予所述動物其量能有效引起免疫反應(yīng)的含有編碼第一抗原的異源核酸序列的吸附于微粒體上的大分子(如質(zhì)粒DNA、如pCMV或ELVIS載體，或者RNA載體構(gòu)建物)。接著給予該動物第二種抗原。
這些實(shí)施例中的第一種抗原和第二種抗原可以相同或不同，較佳是相同。較佳的抗原包括細(xì)菌和病毒抗原，如HIV抗原(如gp120、gp140、gp160、p24gag和p55gag)、C型肝炎病毒抗原、A型流感病毒抗原、B型腦膜炎細(xì)菌抗原和B型鏈球菌細(xì)菌抗原。第二種抗原較佳吸附在本文所述的微粒體上，或者與佐劑如MF59一同給予。如果需要，該大分子還可以與佐劑一同給予。在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，該大分子在給予該第二抗原之前可給予2次或多次，而該第二抗原也可以給予2次或多次。
根據(jù)一個特殊的實(shí)施例(1)該大分子(a)在初次給予時給予；(b)在初次給予后1-8周的時間范圍內(nèi)給予；(c)在初次給予后4-32周的時間范圍內(nèi)給予；和(2)第二抗原(a)在初次給予后8-50周的時間范圍內(nèi)給予；和(b)在初次給予后8-100周的時間范圍內(nèi)給予。
可采用任何已知方法傳送本發(fā)明微粒體組合物，包括直接注射(如皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi))，還可使用電穿孔來增強(qiáng)這種傳送(參見，如美國專利申請09/499023，本文將該文的全部公開內(nèi)容納入作為參考)。電穿孔向細(xì)胞施加短的電脈沖，以增加細(xì)胞膜的滲透性，從而促進(jìn)細(xì)胞攝取DNA。最近已發(fā)現(xiàn)，對體內(nèi)組織施加電場明顯增加了DNA的攝取和基因表達(dá)(Mathiesen，I.，1999，Gene Therapy，6508)。作為體內(nèi)電穿孔的目標(biāo)的組織有皮膚、肝、腫瘤和肌肉。對于DNA疫苗的應(yīng)用，Widera等已顯示，體內(nèi)電穿孔大大增強(qiáng)了DNA疫苗在小鼠、豚鼠和兔子中的效力(Widera，G.等，2000，J.Immunol.，1644635)。
上述實(shí)施例的ELVIS載體通常是含有在真核細(xì)胞中起作用的啟動子、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是RNA載體構(gòu)建物(如α病毒RNA載體復(fù)制子)的cNDA序列和3′終止區(qū)域的DNA分子。該RNA載體構(gòu)建物較佳含有從小RNA病毒、披膜病毒、黃病毒、冠形病毒、副粘病毒、黃熱病毒或α病毒(新德比斯病毒、塞姆利基森林病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒或羅斯河病毒)得到的RNA基因組，更佳是α病毒基因組，該基因組已通過用編碼感興趣的基因產(chǎn)物的選定的異源核酸序列取代一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白基因而產(chǎn)生變異。本發(fā)明的RNA載體構(gòu)建物通常從DNA模板體外轉(zhuǎn)錄獲得。
在閱讀了本文的公開內(nèi)容后，本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員將易于理解本發(fā)明的這些和其它方面。
附圖的簡單描述

圖1提供編碼變異的HIV-1 p55gag多肽的DNA序列(SEQ ID NO63)。
圖2提供編碼變異的HIV-1 p55gag多肽的DNA序列(SEQ ID NO64)。
圖3提供編碼變異的HIV-1包膜多肽的DNA序列(SEQ ID NO65)。
圖4提供編碼變異的HIV-1包膜多肽的DNA序列(SEQ ID NO66)。
圖5提供編碼變異的HIV-1 p5gag多肽的DNA序列(SEQ ID NO67)。
圖6提供編碼變異的HIV-1 p55gag多肽的DNA序列(SEQ ID NO68)。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明以吸附了核酸分子〔較佳是能表達(dá)核酸序列的載體構(gòu)建物，更佳是含有編碼抗原的異源核酸序列的載體構(gòu)建物，如pCMV載體、ELVIS載體或RNA載體構(gòu)建物)的微粒體引起增強(qiáng)的免疫反應(yīng)這一驚人發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)。此外，吸附了核酸分子的微粒體(如吸附了pCMV載體、ELVIS載體或RNA載體構(gòu)建物的微粒體)和佐劑的混合物也可用于引起增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明還以含有編碼抗原的核酸序列的載體構(gòu)建物(如pCMV載體、ELVIS載體或RNA載體構(gòu)建物)與隨后給予的抗原能引起增強(qiáng)的免疫反應(yīng)的驚人發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)。
除非另外說明，否則本發(fā)明的實(shí)施將使用，本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的化學(xué)、聚合物化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)和藥理學(xué)等常規(guī)方法。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有全面的解釋。見如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton，PennsylvaniaMack Publishing Company，1990)；Methods InEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan編，Academic Press，Inc.)；Handbook ofExperimental Immunology，I-IV卷，(D.M.Weir和C.C.Blackwell編，1986，Blackwell科學(xué)出版社)，Sambrook，等，Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版，1989)；Handbook of Surface and Colloidal Chemistry(Birdi，K.S.編，CRC Press，1997)和Seymour/Carraher’s Polymer Chemistry(第四版，MarcelDekker Inc.，1996).
本文引用的所有出版物、專利和專利出版物，不論是上文或下文中的，全部引入以作參考。
本說明書和附帶的權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式“一個”和“該”包括其復(fù)數(shù)形式，除非文中另外明確指出。因此，例如，術(shù)語“微粒體”指一個或很多微粒體，等等。
A.定義描述本發(fā)明時將使用下列術(shù)語，定義如下除非另外說明，本文所用的所有百分比和比值都為重量比。
本文所用的術(shù)語“微粒體”指直徑為約10nm到150μm的微粒體，更佳是直徑約為200nm到30μm，最佳是直徑約為500nm到10μm。較佳的是，微粒體具有允許腸胃外或粘膜給予而不阻塞針頭和毛細(xì)管的直徑。微粒體的大小可通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，如光子相關(guān)光譜、激光衍射和/或掃描電鏡容易地測定。術(shù)語“顆?！币部墒褂糜谥高@里所定義的微粒體。微粒體還指本文所述的亞微粒體乳劑組合物。
本文所使用的聚合物微粒體是由無菌、無毒和可生物降解的材料制得的。這類材料包括(不僅限于此)聚(α-羥基酸)、多羥基丁酸、聚己酸內(nèi)酯、聚原酸酯、多酐、PACA、和聚氯基丙烯酸酯。較佳的是，本發(fā)明使用的微粒體是衍生自聚(α-羥基酸)，特別是由聚(丙交酯)(“PLA”)或D，L-丙交酯和乙交酯或羥基乙酸的共聚物，如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”或“PLGA”)，或D，L-丙交酯和己酸內(nèi)酯的共聚物衍生得到的聚合物微粒體。這些聚合物微粒體可衍生自任何各種聚合起始材料，這些材料具有各種分子量，就共聚物如PLG而言，為各種丙交酯與乙交酯的比值，聚合起始材料的選擇將是一個大問題，部分依賴于共給予的大分子。下面更全面地討論這些參數(shù)。或者，本發(fā)明的微粒體包含于亞微粒體乳劑中。
本文所用詞組“油滴乳劑”指含有可代謝的油和乳化劑的乳劑。術(shù)語“亞微粒體乳劑”在本文中指含有大小約為10-1000nm的液滴的本發(fā)明油滴乳劑。
術(shù)語“微粒體”在本文中可指本文所述的聚合物微粒體或者亞微粒體乳劑組合物。
本文所用的術(shù)語“去污劑”包括表面活性劑、分散劑、懸浮劑和乳劑穩(wěn)定劑。陰離子去污劑包括，但不僅限于此，SDS(十二烷基硫酸鈉)，SLS(月桂基硫酸鈉)，DSS(二磺基琥珀酸酯)、硫酸脂肪化醇等。陽離子去污劑包括，但不僅限于，溴棕三甲銨(十六烷基三甲基溴化銨或“CTAB”)、氯化苯甲烷銨(benzalkonium chloride)、DDA(二甲基2-十八烷基溴化銨)、DOTAP(二油?；?3-三甲基銨-丙烷)等等。非離子去污劑包括，但不僅限于，PVA、聚維酮(也稱做聚乙烯吡咯烷酮或PVP)、脫水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯、聚氧乙烯化乙二醇單醚、聚氧乙烯化烷基苯酚、聚羥亞烴等。
術(shù)語“ζ電勢”在本文中指在所有的固體和液體界面間存在的電勢，即帶電膠體顆粒周圍的離子擴(kuò)散層之間的電勢。可采用本領(lǐng)域周知的技術(shù)，由電泳淌度(即膠體顆粒在與要測量的物質(zhì)接觸的帶電電極之間運(yùn)行的速率)算得ζ電勢。
這里所用的術(shù)語“大分子”是指(不限于此)藥物、多核苷酸、多肽、激素、酶、轉(zhuǎn)錄和翻譯介質(zhì)、代謝途徑的中間體、免疫調(diào)節(jié)劑、抗原、佐劑或他們的組合物。下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明使用的具體的大分子。
術(shù)語“藥物”指生物活性化合物，如抗生素、抗病毒劑、生長因子、激素等等，將在下文做更詳細(xì)討論。
術(shù)語“佐劑”指輔助或調(diào)節(jié)藥物作用的任何物質(zhì)，包括但不僅限于免疫學(xué)佐劑，它使對抗原的免疫反應(yīng)增強(qiáng)或免疫反應(yīng)多樣化。
“多核苷酸”是一種核苷酸聚合物，它典型地編碼生物活性(如免疫性的或治療性的)蛋白質(zhì)或多肽。依據(jù)多核苷酸編碼的多肽的性質(zhì)，一個多核苷酸包括的核苷酸可少到10個，例如多核苷酸編碼抗原。另外，“多核苷酸”可包括雙鏈和單鏈序列，并涉及(但不僅限于)病毒cDNA、原核或真核生物mRNA、病毒的基因組RNA和DNA序列(例如RNA和DNA病毒以及逆轉(zhuǎn)錄酶病毒)或原核生物DNA，特別是合成的DNA序列。該術(shù)語還包括任何已知的DNA和RNA的堿基類似物的序列。該術(shù)語還包括對天然序列的變異，如缺失，添加和替換(自然情況下通常是保守的)，較佳是使核酸分子編碼治療用的或抗原性蛋白質(zhì)。這些變異可以是蓄意的，如通過定點(diǎn)誘變，或偶然突變，如通過產(chǎn)生抗原的宿主的突變。
術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”指氨基酸殘基的聚合物，并不限于最小長度的產(chǎn)物。因此，肽、寡肽、二聚體、多聚體等都包括在此定義中。該定義包含全長蛋白質(zhì)及其片段。該定義還包括對天然序列的變異，如缺失，添加和替換(自然情況下通常是保守的)，較佳是使蛋白質(zhì)保持引起免疫反應(yīng)的能力或?qū)λo予的對象具有治療效果。
“抗原”意指一個分子，該分子含有一個或多個表位，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明抗原存在時，所述表位能夠刺激宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生細(xì)胞抗原-特異性免疫反應(yīng)，或體液抗體反應(yīng)?？乖旧砘虍?dāng)與另一分子結(jié)合存在時，能夠引起細(xì)胞或體液應(yīng)答。正常地，一個表位包括約3-15個，較佳地約5-15個，更佳地7-15個氨基酸。給定蛋白質(zhì)的表位可以用本領(lǐng)域熟知的各種表位定位技術(shù)進(jìn)行鑒別。例如，可參見Methods in Molecular Biology，66卷中的Epitope MappingProtocols(Glenn E.Morris編，1996)Humana Press，Totowa，New Jersey。例如，可通過如在固體支持物上同時合成大量的肽(該肽對應(yīng)于蛋白質(zhì)分子的一部分)，并在肽還結(jié)合在支持物上時，使肽與抗體反應(yīng)而測定線性表位。本領(lǐng)域已知這些技術(shù)，并描述在如美國專利4,708,871；Geysen等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，813998-4002；Geysen等(1986)Molec.Immunol.23709-715，本文將它們的全部內(nèi)容引用以做參考。類似地，通過測定氨基酸的空間構(gòu)象，如使用X-射線晶體學(xué)和二維核磁共振，可容易地鑒別出構(gòu)象表位。例如，可參見Epitope Mapping Protocols，同上。
本文術(shù)語“抗原”是指雙亞基的抗原，也就是從其天然所結(jié)合的完整機(jī)體、以及被殺死的、減毒的或者滅活的細(xì)菌、病毒、寄生蟲或其它微生物中分離得到的抗原。抗體如抗-獨(dú)特型抗體或其片段，和可模擬抗原或抗原決定子的合成肽模擬型(mimotope)也包括在本文的抗原定義之中。類似地，表達(dá)治療性的或免疫遺傳蛋白、或體內(nèi)的抗原決定子(如在基因治療和核酸免疫應(yīng)用中)的寡聚核苷酸或多核苷酸也包括在本文的抗原定義中。
另外，為了本發(fā)明的目的，抗原可以衍生自任何一些已知的病毒、細(xì)菌、寄生蟲和真菌，以及任何各種腫瘤抗原。并且，為了本發(fā)明的目的，“抗原”指一種蛋白質(zhì)并包括對其天然序列的變異，如缺失、添加和替換(通常自然條件下是保守的)，只要該蛋白質(zhì)保持引發(fā)免疫反應(yīng)的能力。這些變異可以是故意的，通過定點(diǎn)突變或偶然突變?nèi)缤ㄟ^產(chǎn)生抗原的宿主突變實(shí)現(xiàn)。
對抗原或組合物的“免疫反應(yīng)”是在對象的體液和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)中產(chǎn)生的針對存在于感興趣的組合物中的分子的反應(yīng)。為了本發(fā)明的目的，“體液免疫反應(yīng)”指抗體分子介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，而“細(xì)胞免疫反應(yīng)”是由T-淋巴細(xì)胞和/或其它白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。細(xì)胞免疫的一個重要方面涉及由溶細(xì)胞性T細(xì)胞(“CTL”)引起的抗原特異性反應(yīng)。CTL對肽抗原具有特異性，該抗原與由主要組織相容性復(fù)合物(MHC)編碼并在細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白質(zhì)結(jié)合并遞呈。CTL幫助誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)微生物的細(xì)胞內(nèi)破壞，或者感染這種微生物的細(xì)胞溶解。細(xì)胞免疫的另一個方面涉及由輔助T細(xì)胞引起的抗原特異性反應(yīng)。輔助T細(xì)胞協(xié)助刺激非特異性效應(yīng)細(xì)胞對抗那些在其表面上具有與MHC分子結(jié)合的肽抗原的細(xì)胞的功能，并且集中于此活性上?！凹?xì)胞免疫反應(yīng)”還指細(xì)胞因子、趨化因子和由活化的T-細(xì)胞和/或其它白細(xì)胞產(chǎn)生(包括衍生自CD4+和CD8+T-細(xì)胞)的其它這類分子的生產(chǎn)。
一種組合物，例如一種免疫原性組合物，或引起細(xì)胞免疫反應(yīng)的疫苗，可以通過在細(xì)胞表面呈遞與MHC分子結(jié)合的抗原而使脊椎動物對象敏感。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)就在其表面呈遞抗原的細(xì)胞中發(fā)生，或者在接近的位置上發(fā)生。另外，可以產(chǎn)生抗原特異性T-淋巴細(xì)胞，以使免疫宿主將來得到保護(hù)。
可通過一些分析測定具體的抗原或組合物刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的能力，如通過淋巴增殖(淋巴細(xì)胞活化)分析，CTL細(xì)胞毒性細(xì)胞分析，通過在一個致敏的對象體內(nèi)分析對抗原特異的T-淋巴細(xì)胞，或者通過測量T細(xì)胞應(yīng)答抗原的重復(fù)刺激而產(chǎn)生的細(xì)胞因子。這種分析在本領(lǐng)域是熟知的。見如Erickson等，J.Immunol.(1993)1514189-4199；Doe等，Eur.J.Immunol.(1994)242369-2376；以及下面的實(shí)施例。
因此，本文所使用的免疫反應(yīng)可以是刺激CTL的生產(chǎn)的反應(yīng)，和/或是刺激輔助T-細(xì)胞的生產(chǎn)或活化的反應(yīng)。感興趣的抗原也可引發(fā)抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。所以，免疫反應(yīng)可以包括一個或多個以下效果B-細(xì)胞引起的抗體的生產(chǎn)，和/或抑制性T細(xì)胞和/或特異性地針對一種抗原或存在于感興趣的組合物或疫苗中的抗原的γδT細(xì)胞的活化。這些反應(yīng)可用于中和感染，和/或調(diào)節(jié)抗體-補(bǔ)體，或抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)，以給免疫的宿主提供保護(hù)?？梢杂帽绢I(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)免疫分析和中和分析測定這些反應(yīng)。
含有吸附于微粒體上的選擇抗原的一種組合物，當(dāng)它擁有的引起免疫反應(yīng)的能力比不與微粒體一起傳遞的等量抗原引起的免疫反應(yīng)能力強(qiáng)的時候，顯示“增強(qiáng)的免疫原性”，因此，一種組合物可以顯示“增強(qiáng)的免疫原性”是因?yàn)橛捎诳乖降轿⒘ｓw上而具有更強(qiáng)的免疫原性的緣故，或者是因?yàn)闉榱嗽谒o予的對象中引發(fā)免疫反應(yīng)而需要使用低劑量的抗原的緣故。通過給予動物微粒體/抗原組合物和抗原對照，然后采用本領(lǐng)域所熟知的兩種正在使用的標(biāo)準(zhǔn)分析方法(如放射免疫分析和ELISA)比較抗體的滴度，從而可測定這種增強(qiáng)的免疫原性。
本文術(shù)語，所給組合物的“有效量”或“藥物學(xué)有效量”是指無毒但足以提供所需反應(yīng)(如免疫學(xué)反應(yīng))和產(chǎn)生相應(yīng)的治療效果的組合物的量，或者在傳遞治療蛋白質(zhì)的情況下，足以影響對象的治療效果的組合物的量，如下文所述。下文將要指出的是，所需的確切量隨患者不同而不同，依據(jù)它們的物種、年齡、對象的總體條件、要治療的病癥的嚴(yán)重程度、以及感興趣的具體大分子、給藥的方式等等。在任何個別的案例中合適的“有效”量可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定。
“脊椎動物對象”是指科達(dá)(cordata)亞門的任何成員，包括但不限于哺乳動物如牛、綿羊、豬、山羊、馬和人；家養(yǎng)動物如狗和貓；和鳥類，包括馴化的、野生的和比賽鳥類如公雞和母雞包括小雞、火雞和其它雞形目鳥類。該術(shù)語不指定具體年齡，因此，包括成體和新生的動物。
“藥學(xué)上可接受的”或“藥理學(xué)可接受的”指非生物學(xué)的或不理想的材料，即材料可以和微粒體制劑一起給予個體，而不會在個體體內(nèi)引起不理想的生物反應(yīng)，或與組合物中含有的任何其它成分進(jìn)行有害的相互作用。
術(shù)語“賦形劑”指通常在完成劑型中提供的物質(zhì)，包括賦形藥、粘合劑、崩散劑，填充劑(稀釋劑)、滑潤劑、助流劑(流動增強(qiáng)劑)、濃縮助劑、顏料、甜味劑、防腐劑、懸浮/分散劑、膜形成器/包衣、調(diào)味劑和印刷墨水。
“生理學(xué)pH”或“生理學(xué)范圍內(nèi)的pH”指約7.2-8.0范圍內(nèi)(包括本數(shù))的pH，更典型為約7.2-7.6范圍內(nèi)(包括本數(shù))的pH。
本文所用的“治療”指任何(i)感染和再感染的預(yù)防，如傳統(tǒng)疫苗中進(jìn)行的，(ii)癥狀的減少或消除，和(iii)所懷疑的病原體或病癥的基本或完全消除。治療可以是預(yù)防性的(感染前)或治療性的(感染后)。
本文使用的短語“核酸”指DNA、RNA，或它們形成的嵌合體。
本文使用的短語“含有至少一個CpG基序的寡聚核苷酸”指含有至少一個CpG二核苷酸的多核苷酸。含有至少一個CpG基序的寡聚核苷酸可含有多個CpG基序。這些寡聚核苷酸在本領(lǐng)域中也被稱作“CpG寡聚核苷酸”。本文所用的短語“CpG基序”指胞嘧啶核苷和鳥嘌呤核苷依次連接的寡聚核苷酸的二核苷酸部分。在胞嘧啶的位置上可用5-甲基胞嘧啶替代。
本文中“α病毒RNA載體復(fù)制子”、“RNA載體復(fù)制子”、“RNA載體構(gòu)建物”和“復(fù)制子”指在靶細(xì)胞中能指導(dǎo)自身進(jìn)行擴(kuò)增或體內(nèi)自我復(fù)制的RNA分子。α病毒衍生的RNA載體復(fù)制子應(yīng)含有如下順序的元件復(fù)制所需的順式5’病毒序列(也稱作5’CSE)，表達(dá)時編碼生物活性α病毒非結(jié)構(gòu)蛋白(如nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)的序列，復(fù)制所需的順式3’病毒序列(也稱作3’CSE)，和聚腺苷酸化序列。α病毒衍生的RNA載體復(fù)制子還可含有病毒亞基因組“連接區(qū)域”啟動子、來自一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白基因或其部分的序列、具有足夠大小以產(chǎn)生活病毒的外部核酸分子，以及要表達(dá)的異源序列。
本文中“真核生物分層載體起始系統(tǒng)”、“ELVIS”或“ELVIS載體”指能指導(dǎo)感興趣的序列或基因表達(dá)的系統(tǒng)。真核生物分層載體起始系統(tǒng)應(yīng)包含能夠在體內(nèi)(即細(xì)胞內(nèi))啟動cDNA合成RNA的5’啟動子，和在真核細(xì)胞內(nèi)能夠指導(dǎo)其自身復(fù)制并表達(dá)異源序列的病毒載體序列。在較佳的實(shí)施例中，核酸載體序列是α病毒衍生序列，含有能夠啟動α病毒RNA的轉(zhuǎn)錄的5’序列(也稱作5’CSE)，以及當(dāng)表達(dá)時編碼生物活性α病毒非結(jié)構(gòu)蛋白(即nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)的序列，和α病毒RNA聚合酶識別序列(也稱作3’CSE)。另外，載體序列可包括病毒亞基因組“連接區(qū)域”啟動子、從一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白基因或其部分得到的序列、具有足夠大小以允許最佳擴(kuò)增的外部核酸分子、要表達(dá)的異源序列、用于插入異源序列的一個或多個限制位點(diǎn)，以及聚腺苷酸化序列。真核生物分層載體起始系統(tǒng)還可包括剪接識別序列、催化性核酶加工序列、核輸出信號和轉(zhuǎn)錄終止序列。
“α病毒載體構(gòu)建物”指能夠指導(dǎo)感興趣的序列或基因表達(dá)的裝配物。這種載體構(gòu)建物通常含有能夠啟動α病毒RNA的轉(zhuǎn)錄的5’序列(也稱作5’CSE)、以及當(dāng)表達(dá)時編碼生物活性α病毒非結(jié)構(gòu)蛋白(即nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)的序列、和α病毒RNA聚合酶識別序列(也稱作3’CSE)，以及聚腺苷酸序列。另外，這種載體構(gòu)建物可包括病毒亞基因組“連接區(qū)域”啟動子、從一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白基因或其部分得到的序列、具有足夠大小以允許產(chǎn)生活病毒的外部核酸分子、體外或體內(nèi)能夠啟動從cDNA合成病毒RNA的5’啟動子、要表達(dá)的異源序列，以及用于插入異源序列的一個或多個限制位點(diǎn)。
本文使用的短語“載體構(gòu)建物”通常指能指導(dǎo)感興趣的核酸序列或基因的表達(dá)的任何裝配物。載體構(gòu)建物一般包括轉(zhuǎn)錄啟動子/增強(qiáng)子或位點(diǎn)限定元件，或者用其它方法(如交替剪接、核RNA輸出、信使RNA的翻譯后修飾或蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后修飾)控制基因表達(dá)的其它元件。此外，載體構(gòu)建物通常包括在轉(zhuǎn)錄時操作性連接于感興趣的序列或基因的序列，起到翻譯啟動序列的作用。載體構(gòu)建物還可任選地含有指導(dǎo)多腺苷酸化的信號、可選擇的標(biāo)記物，以及一個或多個限制性位點(diǎn)和翻譯終止序列。此外，如果將載體構(gòu)建物放置到逆轉(zhuǎn)錄病毒中，該載體構(gòu)建物可含有包裝的信號、長末端重復(fù)序列(LTR)，以及適用于所使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒的正鏈和反鏈引物結(jié)合位點(diǎn)(如果還未存在的話)。載體構(gòu)建物的例子包括ELVIS載體(該載體含有RNA載體構(gòu)建物的cDNA補(bǔ)體)、RNA載體構(gòu)建物本身、α病毒載體構(gòu)建物、CMV載體構(gòu)建物等。
載體構(gòu)建物的一種特殊類型是“質(zhì)粒”，質(zhì)粒指環(huán)狀的雙鏈DNA，它與可連接的額外DNA片段形成環(huán)狀。下面描述的特殊的質(zhì)粒包括pCMV和pSINCP。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，提供了治療(包括預(yù)防性和/或治療性免疫)宿主動物使其抵抗病毒、真菌、支原體、細(xì)菌或原生動物感染以及腫瘤的組合物和方法。本發(fā)明的方法可用于賦予哺乳動物(較佳是人)以預(yù)防性的和/或治療性的免疫。本發(fā)明的方法還可在除人以外的哺乳動物上實(shí)施，包括生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域使用的哺乳動物。
B.總的方法1.吸附了大分子的聚合物微粒體聚合物微粒體，包括PLA和PLG微粒體，能有效地吸附生物活性大分子。此外，這些微粒體吸附各種分子，包括帶電的和/或龐大的大分子。因此，可將用于本發(fā)明的大分子/微粒體用作傳送系統(tǒng)，用于傳送生物活性成分，以治療、預(yù)防和/或診斷各種疾病。
本發(fā)明可用于通過與微粒體結(jié)合傳送各種各樣的大分子，包括但不僅限于藥物如抗生素和抗病毒劑、非類固醇抗炎藥、止痛劑、血管擴(kuò)張劑、心血管藥物、治精神病的藥、精神抑制藥、抗抑郁劑、抗帕金森癥藥、β-受體阻斷劑、鈣通路阻斷劑、舒緩激肽抑制劑、ACE-抑制劑、血管擴(kuò)張劑、促乳素抑制劑、類固醇、激素對抗劑、抗組胺劑、血清素對抗劑、肝素、化療劑、抗腫瘤藥和生長因子，包括但不僅限于PDGF、EGF、KGF、IGF-1和IGF-2、FGF、編碼治療性或免疫原性蛋白的多核苷酸、用于疫苗的免疫原性蛋白質(zhì)及其表位，包括肽激素的激素，如胰島素、胰島素原、生長激素、GHRH、LHRH、EGF、生長激素抑制素、SNX-111、BNP、促胰島素、ANP、FSH、LH、PSH和hCG、性腺類固醇激素(雄激素、雌激素和黃體酮)、甲狀腺-刺激激素、抑制素、膽囊收縮素、ACTH、CRF、強(qiáng)啡肽、內(nèi)啡肽、內(nèi)皮素、纖連蛋白片段、甘丙肽、胃泌素、促胰島素、胰高血糖素、GTP-結(jié)合蛋白片段、鳥苷蛋白、白細(xì)胞激肽、爪蟾抗菌肽、肥大細(xì)胞脫粒肽、皮抑菌肽(dermaseptin)、系統(tǒng)素、神經(jīng)調(diào)節(jié)肽、神經(jīng)降壓肽、胰抑制素、胰多肽、P物質(zhì)、促胰液素、胸腺素等，酶、轉(zhuǎn)錄或翻譯介質(zhì)、代謝途徑的中間體、免疫調(diào)節(jié)劑，如各種細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-3、白細(xì)胞介素-4，和γ-干擾素、抗原和佐劑。
在本發(fā)明一些優(yōu)選實(shí)施例中，大分子是核酸，更佳是載體構(gòu)建物，如ELVIS載體或RNA載體構(gòu)建物。本發(fā)明的具體的優(yōu)越性是在脊椎動物對象中，吸附了ELVIS載體的微粒體產(chǎn)生細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的能力。本發(fā)明的抗原/微粒體針對選擇性抗原引發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的能力，提供了抵抗各種各樣的病原體感染的強(qiáng)有力的工具。因此，本發(fā)明的抗原/微粒體可以摻和入疫苗組合物。
所以，除了常規(guī)的抗體反應(yīng)，本文描述的系統(tǒng)還可以提供如表達(dá)的抗原與I類MHC分子的結(jié)合，這樣就可以產(chǎn)生(mount)針對感興趣的抗原的體內(nèi)細(xì)胞免疫反應(yīng)，這種反應(yīng)刺激CTL的生產(chǎn)，以在將來識別該抗原。另外，通過輔助T-細(xì)胞該方法可引發(fā)抗原特異性反應(yīng)。因此，對于需要細(xì)胞和/或體液免疫反應(yīng)的情況，本發(fā)明的方法將使用任何大分子，較佳是衍生自可誘導(dǎo)抗體的病毒病原體的抗原、T-細(xì)胞輔助表位和T-細(xì)胞細(xì)胞毒素表位。這些抗原包括但不僅限于由人和動物病毒編碼的抗原，對應(yīng)于結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白。
本發(fā)明的微粒體對于針對通常引起弱的免疫反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)病毒的免疫特別有用。例如，本發(fā)明將可用于刺激針對來自皰疹病毒家族的各種蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)，這些蛋白質(zhì)包括衍生自單純皰疹病毒(HSV)類型1和2的蛋白質(zhì)，如HSV-1和HSV-2糖蛋白gB、gD和gH；衍生自水痘帶狀皰疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)和巨細(xì)胞病毒(CMV)的抗原，包括CMV gB和gH；以及衍生自其它人皰疹病毒的抗原，如HHV6和HHV7〔例如，可參見Chee等，Cytomegaloviruses(J.K.McDougall編，Springer-Verlag 1990)125-169頁，一篇關(guān)于巨細(xì)胞病毒蛋白質(zhì)編碼內(nèi)容的綜述；McGeoch等，J.Gen.Virol.(1988)691531-1574，關(guān)于各種HSV-1編碼蛋白質(zhì)的討論；美國專利5,171,568，關(guān)于HSV-1和HSV-2 gB和gD蛋白及其編碼基因的討論；Baer等Nature(1984)310207-211，EBV基因組中蛋白質(zhì)編碼序列的識別；和Davison和Scott，J.Gen.Virol.(1986)671759-1816關(guān)于VZV的綜述〕。
肝炎病毒家族〔包括肝炎A病毒(HAV)、肝炎B病毒(HBV)、肝炎C病毒(HCV)、δ肝炎病毒(HDV)、肝炎E病毒(HEV)、和肝炎G病毒(HGV)〕的抗原也可以方便地用于本發(fā)明描述的方法。作為例子，HCV的病毒基因組序列是已知的，獲得序列的方法也是已知的。見如，國際出版物WO89/04669；WO90/11089；和WO90/14436。HCV基因組編碼幾種蛋白質(zhì)，包括E1(也稱E)和E2(也稱E2/NS1)和N-末端核殼蛋白(稱為“核心”)〔見Houghton等，Hepatology(1991)14381-388，關(guān)于HCV蛋白(包括E1和E2)的討論〕。這些蛋白質(zhì)中的每一種以及它們的抗原片段將在本發(fā)明的組合物和方法中使用。
類似地，來自HDV的δ-抗原序列是已知的(見如美國專利5,378,814)并且該抗原也可方便地用于本發(fā)明的組合物和方法。另外，衍生自HBV的抗原，如核心抗原、表面抗原(sAg)、以及前表面(presurface)序列(pre-S1和pre-S2，以前稱作pre-S)，以及上述的組合，如sAg/pre-S1、sAg/pre-S2、sAg/pre-S1/pre-S2和pre-S1/pre-S2將在本文所用。見如“HBV疫苗-從實(shí)驗(yàn)室到獲得許可——一個案例的研究”，Mackett，M.和Williamson，J.D.，HumanVaccines and Vaccination，159-176頁，關(guān)于HBV結(jié)構(gòu)的討論；美國專利4,722,840，5,098,704，5,324,513，本文將它們的全部內(nèi)容引入以作參考；Beames等，J.Virol.(1995)696833-6838，Birnbaum等，J.Virol.(1990)643319-3330；和Zhou等，J.Virol.(1991)655457-5464。
衍生自其它病毒的抗原也可用于本公開的組合物和方法中，例如，但不限于此，來自小RNA病毒科成員的蛋白質(zhì)(如脊髓灰質(zhì)炎病毒等)；杯狀病毒科；披蓋病毒科(如風(fēng)疹病毒、登革病毒等)；黃病毒科；冠形病毒科；呼腸弧病毒科；雙RNA病毒科；彈狀病毒科(如狂犬病毒等)；線狀病毒科；副粘病毒科(如流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸合胞病毒等)；正粘病毒科(如流感病毒A、B、C型等)；本雅病毒科；沙粒病毒科；反轉(zhuǎn)錄病毒科〔HTLV-I；HTLV-II；HIV-1(也稱作HTLV-III，LAV，ARV，hTLR等)〕，包括但不僅限于，來自分離物HIVIIIb，HIVSF2，HIVLAV，HIVLAI，HIVMN)的抗原；HIV-1CM235，HIV-1US4；HIV-2；尤其是猿免疫缺陷病毒(SIV)。另外抗原也可衍生自人乳頭瘤病毒(HPV)和蜱媒腦炎病毒。見如Virology，第3版(W.K.Joklik編，1988)；Fundamental Virology，第2版(B.N.Fields和D.M.Knipe編，1991)，關(guān)于這些和其它病毒的描述。
更具體地說，已知和報(bào)道了來自任何上述HIV分離物的gp120或gp140包膜蛋白，包括各種HIV遺傳亞類成員〔見如Myers等，Los Alamos Database，Los Alamos National Laboratory，Los Alamos，New Mexico(1992)；Myers等，Human Retroviruses and Aids，1990，Los Alamos，New MexicoLos AlamosNational Laboratory；和Modrow等J.Virol.(1987)61570-578，關(guān)于HIV分離物的多樣性的包膜序列的比較)，衍生自任何這些分離物的抗原將用于本方法。另外，本發(fā)明同樣適用于衍生自任何各種HIV分離物的其它免疫原性的蛋白質(zhì)，包括任一不同的胞膜蛋白如gp160和gp41，gag抗原如p24gag和p55gag，以及衍生自pol和tat區(qū)域的蛋白質(zhì)。任何這些蛋白質(zhì)和抗原還可改變，以用于本發(fā)明。例如圖1、2、5和6提供了編碼修飾的gag抗源的DNA序列(SEQ ID No63，64，67和68)，圖3和4提供了編碼修飾的包膜抗原的DNA序列(SEQ DI No65和66)。
流感病毒是本發(fā)明特別使用的病毒的又一個例子。具體地說，對于免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，特別感興趣的是A型流感病毒的包膜糖蛋白HA和NA。已鑒別了大量的A型流感病毒的HA亞類(Kawaoka等，Virology(1990)179759-767；Webster等，“A型流感病毒中的抗原變化”127-168頁，P.Palese和D.W，Kingsbury(編)，Genetics of influenza viruses.Springer-Verlag，紐約)。因此，衍生自任何這些分離物的蛋白質(zhì)也用于這里所描述的組合物和方法。
本文描述的組合物和方法還使用了大量的細(xì)菌抗原，例如衍生自引起白喉、霍亂、肺結(jié)核、破傷風(fēng)、百日咳、腦膜炎和其它疾病的生物的抗原，包括但不限于，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitides，A、B、C、Y)，淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、幽門螺旋菌(Helicobacter pylori)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)、B型流感嗜血桿菌(Hemophilus influenza type B，HIB)、幽門螺旋菌以及它們的組合物。衍生自腦膜炎奈瑟球菌B抗原的例子在如下共同擁有的專利申請中公開PCT/US99/09346；PCT IB98/01665；PCT IB99/00103。寄生蟲抗原的例子包括衍生自引起瘧疾和萊姆病的生物的抗原。
本發(fā)明使用的其它抗原，其中一些也列在本申請的其它地方，包括如下(參考文獻(xiàn)如下所列)-衍生自腦膜炎奈瑟球菌血清組B的蛋白質(zhì)抗原，如下文參考文獻(xiàn)中1-7。
-衍生自腦膜炎奈瑟球菌血清組B的外膜載體(OMV)制劑，如下文參考文獻(xiàn)8，9，10，11等所公開的。
-衍生自腦膜炎奈瑟球菌血清組A、C、W135和/或Y的糖類抗原，如下文參考文獻(xiàn)12中所公開的衍生自血清組C的寡糖(也見參考文獻(xiàn)13)。
-衍生自肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖類抗原[如參考文獻(xiàn)14，15，16]。
-衍生自淋病奈瑟球菌的抗原[如參考文獻(xiàn)1，2，3]。
-衍生自肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)的抗原[如參考文獻(xiàn)17，18，19，20，21，22，23]。
-衍生自沙眼衣原體的抗原[如24]。
-衍生自A型肝炎病毒的抗原，如滅活病毒[如參考文獻(xiàn)25，26]。
-衍生自B型肝炎病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[如參考文獻(xiàn)26，27]。
-衍生自C型肝炎病毒的抗原[如參考文獻(xiàn)28]。
-衍生自百日咳桿菌(Bordetella pertussis)的抗原，如百日咳全毒素(PT)和衍生自百日咳桿菌的絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，還任意地與維持素(pertactin)和/或凝集元2和3結(jié)合[如參考文獻(xiàn)29，30]。
-白喉抗原，如白喉類毒素[如參考文獻(xiàn)31的第3章]，如CRM197突變體[如參考文獻(xiàn)32]。
-破傷風(fēng)抗原，如破傷風(fēng)類毒素[如參考文獻(xiàn)31的第4章]。
-衍生自幽門螺旋菌的蛋白質(zhì)抗原，如CagA[如參考文獻(xiàn)33]，VacA[如參考文獻(xiàn)33]，NAP[如參考文獻(xiàn)34]，HopX[如參考文獻(xiàn)35]，HopY[如參考文獻(xiàn)35]，和/或尿素酶。
-衍生自流感嗜血桿菌B的糖類抗原[如參考文獻(xiàn)13]。
-衍生自牙齦卟啉單胞菌(Porphyramonas gingivalis)的抗原[如參考文獻(xiàn)36]。
-脊髓灰質(zhì)炎抗原[如參考文獻(xiàn)37，38]如IPV或OPV。
-狂犬病抗原[如參考文獻(xiàn)39]，如凍干滅活病毒[如參考文獻(xiàn)40，RabavertTM]。
-麻疹、腮腺炎和/或風(fēng)疹抗原[如參考文獻(xiàn)31的第9，10和11章]。
-流感抗原[如參考文獻(xiàn)31的第19章]，如紅血球凝集素和/或神經(jīng)氨酸酶表面蛋白。
-衍生自粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)[如參考文獻(xiàn)41]。
-衍生自無乳鏈球菌的抗原(B組鏈球菌)[如參考文獻(xiàn)42，43]。
-衍生自化膿鏈球菌的抗原(A組鏈球菌)[如參考文獻(xiàn)43，44，45]。
-衍生自金黃色葡萄球菌的抗原[如參考文獻(xiàn)46]。
-含有一種或多種這些抗原的組合物。
當(dāng)使用糖類或碳水化合物抗原時，較佳的是這類抗原與載體蛋白偶聯(lián)，以增強(qiáng)免疫原性[如參考文獻(xiàn)47-56]。較佳的載體蛋白是細(xì)菌毒素或類毒素，如白喉或破傷風(fēng)類毒素。CRM197白喉類毒素是特別優(yōu)選的。其它適合的載體蛋白包括腦膜炎外膜蛋白[如參考文獻(xiàn)57]，合成肽[如參考文獻(xiàn)58，59]，熱休克蛋白[如參考文獻(xiàn)60]，百日咳蛋白[參考文獻(xiàn)61，62]，衍生自流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)D[參考文獻(xiàn)63]，衍生自C.difficile的毒素A或B[參考文獻(xiàn)64]等。當(dāng)一種混合物含有來自血清組A和C的囊糖類時，較佳是的MenA糖與MenC糖的比(w/w)大于1(如2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，10∶1或更高)。從不同的腦膜炎血清組得到的糖類可以與相同或不同的載體蛋白偶聯(lián)。
可以使用任何一種適合的偶聯(lián)反應(yīng)，所需之處可以配有任意適合的連接子。
需要時毒性蛋白抗原可被脫毒(如用化學(xué)和/或方法脫去百日咳毒素的毒性)[參考文獻(xiàn)30]。
當(dāng)組合物含有白喉抗原時，較佳的是該組合物還含有破傷風(fēng)抗原和百日咳抗原。類似地，當(dāng)組合物含有破傷風(fēng)抗原時，較佳的是該組合物還含有白喉抗原和百日咳抗原。類似地，當(dāng)組合物含有百日咳抗原時，較佳的是該組合物還含有白喉抗原和破傷風(fēng)抗原。
很明顯本發(fā)明可用于傳遞各種大分子，因此而治療、預(yù)防和/或診斷大量的疾病。在一些實(shí)施例中本發(fā)明的大分子/微粒體組合物可用于定點(diǎn)特異性靶位傳遞。例如，靜脈內(nèi)給予大分子/微粒體組合物可用于針對肺、肝、脾、血液循環(huán)或骨髓。
通過任何結(jié)合-相互反應(yīng)機(jī)制，使大分子吸附到吸附的微粒體表面(或吸附到本發(fā)明的亞微粒體乳劑)，這些機(jī)制包括但不僅限于，離子鍵結(jié)合、氫鍵結(jié)合、共價鍵結(jié)合、范德華力結(jié)合、物理捕獲和通過親水/疏水基相互作用結(jié)合。本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員可以容易地選擇適合于要吸附的大分子類型的去污劑。
例如，在帶電的去污劑(如陰離子或陽離子去污劑)中生產(chǎn)微粒體，可產(chǎn)生能夠吸附各種分子的表面帶有凈負(fù)電荷或凈正電荷的微粒體。例如，用陰離子去污劑如十二烷基硫酸鈉(SDS)生產(chǎn)的微粒體(如SDS-PLG的微粒體)吸附帶正電的抗原(如蛋白質(zhì))。類似地，用陽離子去污劑如CTAB生產(chǎn)的微粒體(如CTAB-PLG微粒體)吸附帶負(fù)電的大分子(如DNA)。如果要吸附的大分子具有正電荷和負(fù)電荷區(qū)域，那么陽離子或陰離子、非離子或兩性離子去污劑都適用。
本發(fā)明使用的用于生產(chǎn)微粒體的可生物降解的聚合物很容易地從Boehringer Ingelheim、Germany and Birmingham Polymers，Inc.、Birmingham，AL.購得。例如，本文使用的形成微粒體的聚合物包括均聚物、共聚物和衍生自如下物質(zhì)的聚合物混合物多羥基丁酸、聚羥基戊酸、聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚二噁酮(polydioxanone)、聚己酸內(nèi)酯、聚原酸酯、和多酐。更佳的是聚(α-羥基酸)，如聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)(本文將這兩者都稱作“PLA”)，多(羥基丁酸)，D，L-丙交酯和乙交酯的共聚物，如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(本文稱作“PLG”或“PLGA”)或D，L-丙交酯和己酸內(nèi)酯的共聚物。本文使用的特別優(yōu)選的聚合物是PLA和PLG聚合物。這些聚合物以各種分子量存在，本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員很容易測定用于給定用途的適當(dāng)?shù)姆肿恿?。因此，如對于PLA，適合的分子量將在2000-5000數(shù)量級。對于PLG，合適的分子量通常在約10,000-200,000范圍內(nèi)，較佳的約15,000-150,000。
如果使用一種共聚物如PLG形成微粒體，則在本文中可使用各種丙交酯和乙交酯比值，該比值很達(dá)程度上是選擇的結(jié)果，部分依賴于共給予的大分子和所需降解的比例。例如，一個50∶50的PLG聚合物，含有50％的D，L-丙交酯和50％的乙交酯，將提供一個快速消融的共聚物，而由于增加了丙交酯成分，75∶25的PLG降解得比較慢，85∶15和90∶10的降解得更慢。很顯然，本領(lǐng)域熟練的工作人員可根據(jù)例如抗原的特性和懷疑的病癥，容易地測定適合的丙交酯和乙交酯的比例。另外，在本發(fā)明的抗原或佐劑捕獲于微粒體中的實(shí)施例中，為了獲得給定大分子期望的釋放動力學(xué)并提供初級和次級免疫反應(yīng)，本文使用具有各種丙交酯∶乙交酯比例的微粒體混合物。本發(fā)明的微粒體的降解速率還可通過聚合物分子量和聚合物結(jié)晶性等因子得到控制。具有各種丙交酯∶乙交酯比例和分子量的PLG共聚物可以容易地從包括BoehringerIngelheim、Germany and Birmingham Polymers，Inc.、Birmingham，AL.等的許多地方購得。這些聚合物也可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，簡單縮聚乳酸成分而合成，如Tabata等，J.Biomed.Mater.Res.(1988)22837-858中所描述的。
當(dāng)使用時，優(yōu)選的聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)聚合物的丙交酯/乙交酯的摩爾比為30∶70到70∶30，更佳為40∶60到60∶40，并且分子量為10,000到100,000道爾頓，更佳為30,000到70,000道爾頓。
使用本領(lǐng)域熟知的任何幾種方法制備聚合物微粒體，例如，在一些實(shí)施例中，可以使用雙重乳劑/溶劑蒸發(fā)技術(shù)，如美國專利3,523,907和Ogawa等，Chem.Pharm.Bull.(1988)361095-1103中所描述制備微粒體。這些技術(shù)涉及由聚合物溶液微滴組成的初級乳劑的形成，該乳劑隨后與含有微粒體穩(wěn)定劑/表面活性劑的連續(xù)水相混合。
或者，根據(jù)O′Hagan等，Vaccine(1993)11965-969，PCT/US99/17308(WO00/06123)，O′Hagan等和Jeffery等，Pharm.Res.(1993)10362.描述的方法，可使用一種水包油包水溶劑(w/o/w)蒸發(fā)系統(tǒng)形成微粒體。在此技術(shù)中，通常將具體的聚合物與有機(jī)溶劑混合，所述有機(jī)溶劑如乙酸乙酯、二甲基氯(也稱作亞甲基氯和二氯甲烷)、乙腈、丙酮、氯仿等。有機(jī)溶劑中提供的聚合物約占1-30％，較佳約占2-15％，更佳約占3-10％，最佳約占4-6％。然后將聚合物溶液與水溶液混合并乳化形成o/w乳劑。該水溶液可以是，例如，去離子水、生理鹽水，或緩沖溶液如磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、檸檬酸鈉/EDTA緩沖溶液。較佳的是，聚合物溶液與水溶液的體積比范圍約為5∶1到20∶1，更佳約為10∶1。使用任何適合的設(shè)備進(jìn)行乳化，典型的是一個高剪切裝置，如勻漿器。
然后較佳地使一體積的o/w乳劑與較大體積的水溶液混合，該水溶液較佳地含有陽離子、陰離子或非離子去污劑。水溶液與o/w乳劑的體積比典型的約為2∶1到10∶1，更典型的約為4∶1。適合用于實(shí)施本發(fā)明的陰離子、陽離子和非離子去污劑的例子在上文已列出，分別包括SDS、CTAB和PVA。一些大分子可更容易地吸附到具有穩(wěn)定劑和/或去污劑混合物的微粒體上，例如，PVA和DOTAP的混合物。另外，在一些例子中，可能需要將去污劑加入到上述有機(jī)溶劑中。在使用非離子去污劑如PVA時使用了乳劑穩(wěn)定劑，其在溶液中的濃度典型地約為2-15％，更典型的約為4-10％。使用陽離子或陰離子去污劑時，其在溶液中的濃度典型地約為0.05-5％，更典型地約為0.25-1％。通常，使用的去污劑與聚合物的重量比約為0.00001∶1到約0.5∶1，較佳約為0.0001∶1到0.5∶1，更佳約為0.001∶1到0.5∶1，更佳約為0.005∶1到0.5∶1。
然后勻漿復(fù)合物以生產(chǎn)穩(wěn)定的w/o/w雙重乳劑。然后蒸發(fā)有機(jī)溶劑。可以控制配方參數(shù)，使制備的小微粒體在0.05μm(50nm)到較大微粒體50μm或更大的范圍內(nèi)。見如，Jeffery等，Pharm.Res.(1993)10362-368；McGee等，J.Microencap.(1996)。例如，減少攪拌產(chǎn)生了較大的微粒體，增加了內(nèi)部相體積。使用具有高濃度的乳劑穩(wěn)定劑的低水相體積生產(chǎn)小微粒體。
其它的制劑可在2001年9月28日提交的題為《吸附了大分子的微粒體》的美國申請系列號＿＿＿、代理案卷號PP16502.002中獲得。
可以控制配方參數(shù)，使制備的小微粒體在0.05μm(50nm)到較大微粒體50μm或更大的范圍內(nèi)。見如，Jeffery等，Pharm.Res.(1993)10362-368；McGee等，J.Microencap.(1996)。例如，減少攪拌產(chǎn)生了較大的微粒體，增加了內(nèi)部相體積。使用具有高濃度的乳劑穩(wěn)定劑的低水相體積生產(chǎn)小微粒體。
在其它的實(shí)施例中，還可使用Thomasin等J.Controlled Release(1996)41131；美國專利2,800,457；Masters，K.(1976)Spray Drying第二版，Wiley，New York中描述的噴干和凝聚技術(shù)，以及Hall等，(1980)”Wurster Process”，Controlled Release TechnologiesMethods，Theory，and Applications(A.F.Kydonieus編)，第二卷，133-154頁，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)lorida和Deasy，P.B.，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.(1988)S(2)99-139)描述的空氣-懸浮涂層技術(shù)，如全涂層(pan coating)和Wurster涂層，以及離子凝膠化技術(shù)〔描述于如Lim等Science(1980)210908-910.〕來制備微粒體。
可通過如激光散射，使用例如氦-氖激光分光劑測定粒徑。通常，在室溫測定粒徑粒徑，測定涉及對該樣品進(jìn)行多次分析(如5-10次)，以獲得這些粒徑的平均值。還可使用掃描電鏡(SEM)容易地測定粒徑。
本發(fā)明的其它實(shí)施例利用含有亞微粒體乳劑的微粒體制品，該制品較佳包含離子型表面活性劑。例如，可使用MF59或其它作為基本的含油亞微粒體乳劑，而離子型表面活性劑可包括但不限于二油?；?3-三甲基銨-丙烷(DOTAP)、二油?；?sn-甘油-3-乙基磷酸膽堿(DEPC)和二油酰基-磷脂酸(DPA)，各表面活性劑都可溶解于角鯊烯中。通過將各去污劑溶解在角鯊烯/10％Span 85(角鯊烯的濃度為4-52mg/ml)中，可配制原型離子型乳劑?？墒褂?.5％Tween 80/H2O在5毫升角鯊烯/100毫升H2O中的溶液乳化該角鯊烯/表面活性劑混合物。使用Silverson均化器均化(5分鐘，5000RPM)，形成初步的乳劑，然后進(jìn)行微流化(～10000psi，5遍，Microfluidizer 110S)，得到最終的乳劑。下文描述了關(guān)于亞微粒體乳劑的其它討論。
制備后，微粒體可以原樣保存或凍干以備將來使用。通常，為了使大分子吸附到微粒體上，可使微粒體制備物簡單地與感興趣的大分子混合，得到的制劑在使用前可再凍干。通常，將大分子加到微粒體中，以獲得大分子與微粒體的重量比為0.0001∶1到0.25∶1、較佳是0.001∶1到0.1、更佳是0.01到0.05的吸附了大分子的微粒體。可采用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)測定微粒體中大分子的含量。
如上所述，用于本發(fā)明的大分子包括蛋白質(zhì)(較佳是抗原分子)和核酸(較佳是能表達(dá)核酸序列的載體構(gòu)建物，如CMV基的載體、ELVIS載體或RNA載體構(gòu)建物)。
本發(fā)明的聚合物微粒體可含有嵌于其中或包裹于其中的大分子，以及吸附于其上的大分子。因此，例如，本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員可以依據(jù)本發(fā)明制備具有ELVIS載體吸附于其上的包裹了佐劑的微粒體，或者具有RNA載體構(gòu)建物吸附于其上的包裹了抗原的微粒體。本發(fā)明設(shè)計(jì)吸附于微粒體上或嵌于微粒體中的核酸大分子以及其它核酸和其它抗原分子的各種組合物。在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的微粒體具有ELVIS載體或RNA載體構(gòu)建物吸附于其上。
此外，發(fā)明的微粒體的任何實(shí)施例都借助電穿孔而傳送。
如上所述，一旦生產(chǎn)出吸附了大分子的微粒體和/或微粒體乳劑微粒體，就將它們與所需的佐劑一起制成藥物組合物(包括疫苗)，用于治療、預(yù)防和/或診斷各種各樣的疾病。該組合物通常包括一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。例如，可使用的載體如水、鹽水、甘油、聚乙二醇、透明質(zhì)酸、乙醇等。其它賦形劑如濕潤劑或乳化劑、生物緩沖劑等也可存在于這種載體中。生物緩沖劑實(shí)際上可以是藥學(xué)上可接受的和使制劑具有所需的pH(即生理范圍內(nèi)的pH)的任何溶液。緩沖溶液的例子包括鹽、磷酸緩沖鹽溶液、Tris緩沖鹽溶液、Hank’s緩沖鹽溶液等。也可將本領(lǐng)域已知的其它的賦形劑引入最終的劑型中，包括粘合劑、崩解劑、填充物(稀釋劑)、潤滑劑、助流劑(流動增強(qiáng)劑)、壓縮輔助劑、顏料、甜味劑、防腐劑、懸浮/分散劑、膜形成劑/包衣、調(diào)味劑和印刷油墨。
本發(fā)明的組合物將含有治療有效量的一種或多種感興趣的大分子。即，組合物中大分子/微粒體的量將使對象產(chǎn)生足夠的反應(yīng)，以預(yù)防、減少、除去或診斷癥狀。所需的適當(dāng)?shù)牧渴亲兓模蕾囉诮邮苤委煹膶ο?；接受治療的對象的年齡和大體的條件；治療狀況的嚴(yán)重程度；在免疫反應(yīng)的情況下，對象免疫系統(tǒng)合成抗體的能力；希望保護(hù)的程度和選擇的具體抗原以及給予的方式；以及其它的因素。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員可以容易地測定適合的有效量。因此，治療有效量通常在一個較大的范圍內(nèi)，該范圍可由常規(guī)試驗(yàn)測定。例如，為了本發(fā)明的目的，大分子是多核苷酸，每劑傳送的大分子有效劑量典型地在1ng-10mg范圍內(nèi)，更佳的約在10ng-1mg，最佳的約100μg-1mg；大分子是抗原時，每劑傳送的大分子有效劑量典型地在約1μg-100mg范圍內(nèi)，更佳的約在10μg-1mg，最佳的約50μg-1mg。
一旦制得本發(fā)明的組合物，可將其腸胃外給予，如通過注射。組合物可皮下注射、腹膜內(nèi)注射、靜脈注射或肌肉注射。其它給藥方式包括鼻、粘膜、直腸、陰道、口和肺部給予，栓劑和經(jīng)真皮或表皮應(yīng)用。可以使用單劑量方案或多劑量方案進(jìn)行劑量治療。多劑量方案是指在初期療程中可以分1-10次劑量分期服藥，在隨后的時間間隔里，根據(jù)所選擇維持和/或加強(qiáng)治療效應(yīng)的目的，施以其它給藥劑量，例如，在1-4個月內(nèi)施以第二劑量，如果需要，幾個月后給予又一個劑量。
在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，在注射一系列的一次或多次載體構(gòu)建物(含有編碼抗原的異源核酸序列)后，接著注射一系列的一次或多次抗原(在本文中也稱為“強(qiáng)化”)。根據(jù)一個特殊的實(shí)施例，可以三次注射給予載體構(gòu)建物(a)在初次給予時給予；(b)在初次給予后1-8周的時間范圍內(nèi)給予；(c)在初次給予后4-32周的時間范圍內(nèi)給予；而抗原則可以在兩次注射中給予(a)在初次給予后8-50周的時間范圍內(nèi)給予；和(b)在初次給予后8-100周的時間范圍內(nèi)給予。
劑量方案將(至少部分)根據(jù)對象所需的程度和從事者的判斷而定。
如果希望預(yù)防疾病，通常在用感興趣的病原體初步感染前給予吸附了載體構(gòu)建物的微粒體。如果需要治療疾病(除了預(yù)防以外)，如癥狀還原或復(fù)發(fā)，通常初步感染后給予吸附了載體構(gòu)建物的微粒體。
2.油滴乳劑在本發(fā)明的其它實(shí)施例中，制備的油滴乳劑(具體而言，亞微粒體乳劑)含有可代謝的油和乳化劑?？墒谷绾兄辽僖粋€CpG基序的寡核苷酸的分子與油滴乳劑混合，形成佐劑。
油滴乳劑較佳含有可代謝的油和乳化劑，其中，該油和乳化劑形成基本上所有的油滴的直徑都小于1微米的水包油乳劑。具有此優(yōu)選的大小范圍的液滴的亞微粒體乳劑顯示出比其它含有油和乳化劑、但其油滴明顯大于本發(fā)明的乳劑的驚人的優(yōu)越性。在優(yōu)選的實(shí)施例中，由于使用陽離子去污劑作為乳化劑，或者除了乳化劑外還含有陽離子去污劑的緣故，所得的乳劑帶正電荷。這使得核苷酸抗原分子(如CpG寡核苷酸)或載體構(gòu)建物被吸附。或者，陰離子去污劑的使用使如蛋白質(zhì)之類的分子被吸附。
雖然本發(fā)明亞微粒體乳劑組合物的各種成分是通常所知的，但是這些組合物并未以相同的方式混合。因此，雖然下文作出了一般的描述，并在優(yōu)選的實(shí)施例中有詳細(xì)的描述，但是單獨(dú)的成分在本領(lǐng)域中是已知的，對于本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員來說，用于本文的術(shù)語，如可代謝的油、乳化劑、免疫刺激劑、胞壁酰肽和親脂性胞壁酰肽，都能足夠了解，而勿需進(jìn)一步的描述。
這些組合物的一種成分是可代謝的、無毒的油，較佳是一種約6-30個碳原子的油，包括但不限于鏈烷、鏈烯、炔，以及它們的相應(yīng)的酸和醇及其醚和酯，以及它們的混合物。油可以是任何植物油、魚油、動物油或合成制得的油，這些油可被給予佐劑的宿主動物代謝，它們對對象是無毒的。宿主動物通常是哺乳動物，較佳是人。在此明確表示，本發(fā)明不包括礦物油和類似的有毒的石油蒸餾油。
本發(fā)明的油成分還可以是任何長鏈鏈烷、鏈烯或炔，或者是它們的酸或醇衍生物，不論是游離的酸、其鹽還是酯，如單酯、二酯或三酯，如甘油三酯1，2-丙二醇的酯，或者類似的多羥基醇?？墒褂冒被蚨喙倌軋F(tuán)酸使醇?；缫宜?、丙酸、檸檬酸等。也可使用從長鏈醇衍生得到的、屬于油的并滿足本文所述的其它標(biāo)準(zhǔn)的醚。
通常，單獨(dú)的鏈烷、鏈烯或烷部分及其酸或醇衍生物具有約6-30個碳原子。該部分可具有直鏈或支鏈結(jié)構(gòu)。它可以是全飽和的，或者具有一個或多個雙鍵或三鍵。當(dāng)使用單或多酯或醚基的油時，約6-30個碳原子的限制也適用于單獨(dú)的脂肪酸或脂肪醇部分，并不是所有的碳原子都包括在內(nèi)。
本文可使用任何可代謝的油，尤其是從動物、魚或植物來源獲得的油。油需要能被所給予的宿主代謝，否則該油成分可導(dǎo)致膿腫、肉芽腫甚或腫瘤或者(當(dāng)用于醫(yī)獸時)可能使接種的鳥類和動物的肉由于該不可代謝的油可能對消費(fèi)者產(chǎn)生不利的影響的緣故而不能讓人消費(fèi)。
關(guān)于這類亞微粒體乳劑的詳細(xì)描述，可參見國際出版物WO 90/14837和共同擁有的國際專利申請PCT/US00/03331。
這些佐劑和免疫原性組合物的油成分將以約0.5-20體積％、但較佳不超過約15％、通常約為1-12％的量存在。最佳的是使用約1-4％的油。
這些亞微粒體乳劑組合物的水性部分較佳是緩沖鹽溶液，或者，更佳的是未摻雜的水。因?yàn)檫@些組合物用于腸胃外給藥，所以較佳的是，為了預(yù)防由于組合物和生理液體之間的離子濃度不同而導(dǎo)致的組合物的給藥后膨脹或快速吸收，需要補(bǔ)充用作免疫原性組合物的最終的緩沖溶液，以使其張力(即重量摩爾滲透壓濃度)基本上與正常的生理液體相同。還較佳的是，為了維持pH與正常生理?xiàng)l件向適配，應(yīng)使該鹽水緩釋。還有，在某些例子中，為了確保某種組合物成分如糖肽的穩(wěn)定性，需要將pH維持在特定的水平。
任何生理上可接受的緩沖液都可用于本文，優(yōu)選磷酸鹽緩沖液。其它可接受的緩沖液如乙酸酯、Tris、碳酸氫鹽、碳酸鹽等可用來代替磷酸鹽緩沖液。水性成分的pH優(yōu)選約為6.0-8.0。
但是，當(dāng)開始制備亞微粒體乳劑時，較佳使用未摻雜的水作為乳劑的水性成分。增加鹽濃度使得更加難以獲得所需小的液滴大小。當(dāng)由佐劑制備最終的免疫原性組合物時，可將抗原性物質(zhì)加到處于適當(dāng)?shù)闹亓磕枬B透壓濃度的緩沖液中，以提供所需的免疫原性組合物。
在這些組合物中使用的水性成分的量將是使該組合物的值統(tǒng)一所需的量。即，為了使該組合物產(chǎn)生所需的體積，使足以產(chǎn)生100％的量的水性成分與上述其它成分混合。
各種各樣的乳化劑和懸浮劑通常用于藥物科學(xué)中。這些包括天然的物質(zhì)，如從樹得到的樹膠、植物蛋白、糖基聚合物如藻酸鹽和纖維素等。某些氧代聚合物或者在其碳骨架上具有氫氧化物或其它親水取代基的聚合物具有表面活性劑的活性，如聚維酮、聚乙烯醇和乙二醇醚基的單或多官能團(tuán)化合物。由長鏈脂肪酸衍生的化合物形成大量的第三類乳化劑和懸浮劑，這些都可用于本發(fā)明。只要前述任一種表面活性劑是無毒的，它們都可使用。
可用于本發(fā)明的合適的乳化劑(也稱為表面活性劑或去污劑)的特殊例子公開在共同擁有的國際專利申請PCT/US00/0331中。通常將表面活性劑分成4個基本的類別陰離子、陽離子、兩性離子和非離子。陰離子去污劑的例子包括但不限于藻酸、辛酸、膽酸、1-癸烷磺酸、脫氧膽酸、1-十二烷磺酸、N-月桂?；“彼岷团；悄懰岬鹊取ｊ栯x子去污劑包括但不限于溴棕三甲銨(十六烷基三甲基溴化銨或“CTAB”)、氯化苯甲烷銨、二甲基2-十八烷基溴化銨(DDA)、DOTAP、十二烷基三甲基溴化銨、芐基二甲基十六烷基氯化銨、鯨蠟基氯化吡啶、甲基苯索氯銨和4-甲基吡啶十二烷基硫酸鹽等等。兩性離子去污劑的例子包括但不限于3-[(3-膽氨基丙基)-二甲基胺基]-1-丙烷磺酸鹽(?？s寫為CHAPS)、3-[(膽氨基丙基-二甲基胺基]-2-羥基-丙烷磺酸鹽(常縮寫為CHAPSO)、N-十二烷基-N，N-二甲基-3-胺基-1-丙烷磺酸鹽和溶血-α-磷脂酰膽堿等。非離子去污劑的例子包括但不限于癸?；?N-甲基葡糖酰胺、二乙二醇單戊酯、正十二烷基β-D-吡喃型葡糖苷、脂肪醇的環(huán)氧乙烷縮合物(如以商品名Lubrol銷售的)、脂肪酸(具體是C12-C20脂肪酸)的聚氧乙烯醚、聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯(如以商品名Tween銷售的)和脫水山梨糖醇脂肪酸醚(如以商品名Span出售的)等等。
特別有用的表面活性劑組是基于脫水山梨糖醇的非離子表面活性劑，如從市場上購得的SPAN或ARLACEL，通常有一個字母或數(shù)字符號起將各種單、二和三酯取代的脫水山梨糖醇區(qū)別開。相關(guān)的表面活性劑組包括以TWEEN出售的聚氧乙烯脫水山梨糖醇單酯和聚氧乙烯脫水山梨糖醇三酯。TWEEN表面活性劑可與相關(guān)的山梨糖醇單酯或三酯表面活性劑混合，以促進(jìn)乳劑穩(wěn)定性。
通過改變?nèi)ノ蹌┖陀偷谋戎?增加比值則油滴大小減小)、工作壓力(增加工作壓力則油滴變小)、溫度(增加溫度則油滴變小)以及加入兩性免疫刺激劑(加入這些制劑將減少油滴大小)可改變油滴的大小。實(shí)際的油滴大小將根據(jù)具體的去污劑、油和免疫刺激劑(如果有的話)以及所選擇的具體的工作條件而改變?？刹捎么笮y量儀器來確定液滴的大小，如Coulter公司制造的Sub-MicronParticle Analyzer(N4MD型)，并可根據(jù)前述原則改變它們的參數(shù)，直到基本上所有的液滴的直徑都小于1微米、較佳是小于0.8微米、最佳是小于0.5微米?！盎旧纤小笔侵钢辽偌s80％(數(shù)量)、較佳至少約90％、更佳至少約95％、最佳至少約98％。粒徑通常是高斯曲線分布，這樣其平均直徑小于所述的限度。
優(yōu)選的油滴乳劑是MF59?？筛鶕?jù)以下文獻(xiàn)所述的方法制備MF59，如Ott等，Vaccine DesignThe Subunit And Adjuvant Approach，1995，M.F.Powell和M.Newman編輯，Plenum出版社，紐約，第277-296頁；Singh等，Vaccine，1998，16，1822-1827；Ott等，Vaccine，1995，13，1557-1562；Valensi等，J.Immunal，1994，153，4029-39，本文將這些文獻(xiàn)的全部公開內(nèi)容納入作為參考。
其它油滴乳劑包括如SAF，含有10％的角鯊浠、0.4％Tween 80，5％的聚醚-阻斷聚合物L(fēng)121和thr-MDP，微流化成亞微型乳劑或渦旋產(chǎn)生較大粒徑的乳劑；和RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)(Ribi Immuochem，Hamilton，MT)含有2％的角鯊浠、0.2％Tween 80以及一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁成分，選自單磷酰基酯A(MPL)，海藻糖二聚月桂烯(TDM)，和細(xì)胞壁骨架(CWS)，較佳是MPL+CWS(Detox J)(關(guān)于本文使用的適合的亞微型水包油乳劑的進(jìn)一步討論見共同擁有的1998年1月29日提交的專利申請09/015,736)。
在制得本發(fā)明的微粒體后，不管是什么聚合物類型或亞微粒體乳劑類型，大分子如多肽和載體構(gòu)建物都可如先前所述吸附于其上。本發(fā)明的亞微粒體乳劑微粒體還可將大分子俘獲或包埋于其中，以及吸附于其上。因此，例如本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員可以依據(jù)本發(fā)明制備具有ELVIS載體吸附于其上的包裹了佐劑的微粒體，或者具有RNA載體構(gòu)建物吸附于其上的包裹了抗原的微粒體。本發(fā)明設(shè)計(jì)吸附于微粒體上或嵌于微粒體中的核酸大分子以及其它的核酸和其它抗原分子的各種組合物。此外，本發(fā)明的微粒體的任何實(shí)施例可通過電穿孔傳送。
3.ELVIS載體ELVIS載體是真核生物分層載體起始系統(tǒng)，在上述美國專利5814482和6015686以及國際專利申請WO 97/38087和WO 99/18226中有總的描述。在一個實(shí)施例中，ELVIS載體從α病毒的基因組得到，更佳從新德比斯病毒(SIN)、塞姆利基森林病毒(SFV)、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒(VEE)或羅斯河病毒(RRV)的基因組得到。α病毒是長度大約為11-12kb的RNA病毒，它含有5′帽和3′多腺苷酸化尾。成熟的感染病毒由被核殼和包膜蛋白包膜的基因組RNA組成。宿主細(xì)胞通過受體特異性事件被α病毒感染，并在基因組RNA釋放到胞質(zhì)中時達(dá)到高峰。在病毒復(fù)制過程中，合成了病毒編碼的包膜糖蛋白E1和E2，這兩種蛋白被包埋在宿主細(xì)胞膜中，其后代病毒粒子通過此而萌發(fā)，并釋放到該宿主細(xì)胞的外部。
病毒基因組的復(fù)制以基因組RNA鏈作為合成互補(bǔ)的負(fù)RNA鏈的模板開始。然后負(fù)RNA鏈作為全長基因組RNA的模板，以及內(nèi)部啟動的正鏈亞基因組RNA的模板。非結(jié)構(gòu)蛋白由基因組鏈翻譯，而結(jié)構(gòu)蛋白由亞基因組鏈翻譯。所有的病毒基因都首先表達(dá)為多蛋白，然后在翻譯后通過蛋白酶剪切被加工成單個蛋白質(zhì)。
通過使用選擇的異源核酸序列替換病毒基因組的某些部分(如結(jié)構(gòu)蛋白基因)，可以構(gòu)建α病毒載體復(fù)制子。因此，在某些實(shí)施例中，α病毒復(fù)制子載體可含有能啟動α病毒轉(zhuǎn)錄的5′序列、編碼α病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列、α病毒連接區(qū)域啟動子、α病毒RNA聚合酶識別位點(diǎn)，以及3′多腺苷酸化序列。此外，在α病毒載體構(gòu)建物中可含有用于cDNA復(fù)制的α病毒載體復(fù)制子。這類載體構(gòu)建物通常含有能啟動cDNA合成RNA的位于上游并操作性連接于該載體cDNA的5′啟動子，這樣轉(zhuǎn)錄將產(chǎn)生載體復(fù)制子RNA。載體構(gòu)建物還可含有控制轉(zhuǎn)錄終止的3′序列。在病毒連接區(qū)域的上游或下游可存在異源核酸序列。
ELVIS載體利用RNA病毒復(fù)制的機(jī)制，通過雙層方法(如，以上述α病毒載體構(gòu)建物為基礎(chǔ))實(shí)現(xiàn)感興趣的異源核苷酸序列的傳送。總而言之，由于第一層啟動了第二層的轉(zhuǎn)錄的緣故，ELVIS載體提供一個能使編碼感興趣的基因產(chǎn)物的RNA的量擴(kuò)增的層狀表達(dá)系統(tǒng)。因此，典型的ELVIS載體含有能啟動cDNA轉(zhuǎn)錄為RNA的合成的5′啟動子、能在細(xì)胞中自我復(fù)制并能表達(dá)異源核酸序列的構(gòu)建物的cDNA補(bǔ)體，以及控制轉(zhuǎn)錄終止的3′序列。能使選擇的核酸序列自我復(fù)制和表達(dá)的構(gòu)建物可以是α病毒載體構(gòu)建物。因此，DNA ELVIS載體的第一層轉(zhuǎn)錄RNAα病毒載體構(gòu)建物，由此使選擇的異源核酸序列表達(dá)。
可首先制備與α病毒基因組互補(bǔ)的cDNA，從而構(gòu)建α病毒基的ELVIS載體。然后刪掉對應(yīng)于基因組RNA的cDNA中編碼一個或多個病毒結(jié)構(gòu)蛋白的序列，然后在缺失的位置上插入編碼感興趣的基因產(chǎn)物的異源DNA，從而阻止成熟的病毒包裝，并使該異源序列擴(kuò)增。然后將含有異源序列的修飾的cDNA插入ELVIS載體的第一層中。在ELVIS載體進(jìn)入細(xì)胞和核中后，它將被轉(zhuǎn)錄，所產(chǎn)生的mRNA分子(是一種能自我復(fù)制的RNA載體)將開始復(fù)制，并翻譯出多肽，包括感興趣的異源基因。
雖然典型的新德比斯衍生的α病毒載體構(gòu)建物是優(yōu)選的，但是根據(jù)本文所述，也可使用其它α病毒種類?；蛘?，可使用從任何RNA病毒衍生得到的載體，尤其是從正鏈病毒衍生得到的。
總的來說，關(guān)于ELVIS載體的構(gòu)建的內(nèi)容在美國專利5814482和6015686中有描述。簡言之，從RNA病毒獲得RNA，然后使用針對具體的基因或RNA病毒的某部分的適當(dāng)?shù)囊?，通過PCR擴(kuò)增合成cDNA，根據(jù)需要，這些引物也可含有額外的限制性位點(diǎn)。然后將所得cDNA片段克隆到質(zhì)粒中，然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗髦校绱竽c桿菌。將陽性菌落用于質(zhì)粒純化，然后將質(zhì)粒裝配到所需的ELVIS載體中，該載體存在具有異源DNA如報(bào)道基因(如GFP)或編碼抗原的所需基因的部分。下面的實(shí)施例3描述了用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的ELVIS載體(pSINCP)。
4.RNA和pCMV載體構(gòu)建物在本發(fā)明的其它實(shí)施例中，RNA載體構(gòu)建物或RNA復(fù)制子載體被直接使用，而不需要將DNA導(dǎo)入細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)錄可能發(fā)生的核中。通過將該RNA載體用于直接傳送到宿主細(xì)胞的胞質(zhì)中，可有效地使異源核酸序列自動進(jìn)行復(fù)制和翻譯。在此實(shí)施例中，通過在體外由DNA基的載體構(gòu)建物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，獲得RNA載體構(gòu)建物或RNA復(fù)制子載體。較佳的是，從α病毒的基因組衍生得到該RNA載體構(gòu)建物或RNA復(fù)制子載體，更佳的是從新德比斯病毒(SIN)、塞姆利基森林病毒(SFV)、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒(VEE)或羅斯河病毒(RRV)的基因組得到。在其它實(shí)施例中，RNA載體構(gòu)建物從α病毒以外的其它病毒獲得。較佳的是，用于衍生RNA載體構(gòu)建物的這些其它病毒是正鏈RNA病毒，更佳的是，它們是小RNA病毒、黃病毒、風(fēng)疹病毒或冠形病毒。用于體外轉(zhuǎn)錄α病毒基的RNA載體的組合物和方法在其它地方有詳細(xì)描述(參見美國專利5842723，和Polo等，1999，964598-603)。然后將RNA載體吸附到本文所述的用于傳送的本發(fā)明微粒體上。雖然從SIN、SFV、VEE或RRV獲得的典型α病毒RNA載體是優(yōu)選的，但是可容易地使用從其它α病毒種類獲得的類似載體替代。
在本發(fā)明的其它實(shí)施例中使用pCMV載體構(gòu)建物。這類載體構(gòu)建物在本領(lǐng)域中是周知的。特別優(yōu)選的pCMV載體含有CMV立即早期增強(qiáng)子/啟動子和牛生長激素終止子。在Chapman，B.S.等，1991，《從人巨細(xì)胞病毒(Towne)立即早期基因獲得的內(nèi)含子A對哺乳動物細(xì)胞中的異源表達(dá)的作用》，Nucleic Acids Res.，193979-86中有關(guān)于此的詳細(xì)描述。
5.佐劑可任選地使用佐劑來增強(qiáng)藥物組合物的效果，特別優(yōu)選的是Th1刺激佐劑。佐劑可以與本發(fā)明的微粒體同時給予，如佐劑在同一組合物中或分離的組合物中。另外，佐劑也可在給予本發(fā)明的微粒體組合物前或后給予。在另一個實(shí)施例中，佐劑，如免疫學(xué)佐劑，可包裹于微粒體內(nèi)?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何幾種方法使佐劑與任何一種大分子一樣包裹在微粒體內(nèi)。見如美國專利3,523,907；Ogawa等Chem Pharm.Bull.(1988)361095-1103；O’Hagan等Vaccine(1993)11965-969和Jefferey等Pharm.Res(1993)10362。另外，如上述任何大分子一樣，佐劑可以吸附于微粒體?；蛘?，佐劑可含有本發(fā)明的油滴乳劑。
免疫學(xué)佐劑包括但不僅限于(1)鋁鹽(alum)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)其它水包油乳劑制劑〔含有或不含有其它特異性免疫刺激劑如胞壁酰肽(見下文)或細(xì)菌細(xì)胞壁成分〕，例如(a)使用微流化劑如110Y型微流化劑(Microfluidics，Newton，MA)制備成亞微型顆粒的MF59，含有5％的角鯊浠、0.5％Tween 80，和0.5％的Span85〔盡管不需要，但可任選地含有各個量的MTP-PE(見下文)〕(國際出版物WO90/14837，Vaccine design中第10章the subunit an adjuvant approach，Powell和Newman編，Plenum Press1995)；(b)SAF，含有10％的角鯊浠、0.4％Tween 80，5％的聚醚-阻斷聚合物L(fēng)121和thr-MDP(見下文)，也微流化成亞微型乳劑或渦旋產(chǎn)生較大粒徑的乳劑；和(c)RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)(Ribi Immuochem，Hamilton，MT)含有2％的角鯊浠、0.2％Tween 80以及一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁成分，選自單磷?；(MPL)，海藻糖二聚月桂烯(TDM)，和細(xì)胞壁骨架(CWS)，較佳是MPL+CWS(DetoxTM)(關(guān)于本文使用的適合的亞微型水包油乳劑的討論見共同擁有的1 998年1月29日提交的專利申請09/015,736)；(3)可使用皂角苷佐劑，如Quil A或QS21〔(如StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)〕，或由其產(chǎn)生的微粒體如ISCOM(免疫刺激復(fù)合物)，該ICOMS可不具有另外的去污劑，如WO00/07621；(4)弗氏完全佐劑(CFA)以及弗氏不完全佐劑(IFA)；(5)細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素〔如IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-12(WO99/44636)等〕、干擾素(如γ干擾素)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(6)單磷?；(MPL)或3-O-去酰基化MPL(3dMPL)，如GB-2220221、EP-A-0689454，當(dāng)使用肺炎球菌糖類時，基本上沒有alum，如WO00/56358；(7)3dMPL與例如QS21和/或水包油乳劑的組合，如EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231；(8)含有CpG基序的寡聚核苷酸(Roman等，Nat.Med.，1997，3，849-854；Weiner等，PNAS USA，1997，94，10833-10837；Davis等，J.Immunol.1988，160，870-876；Chu等，J.Exp.Med.，1997，186，1623-1631；Lipford等，Eur.J.Immunol.1997，27，2340-2344；Moldoveanu等，Vaccine，1988，16，1216-1224，Krieg等，Nature，1995，374，546-549；Klinman等，PNAS USA，1996，93，2879-2883Ballas等，J.Immunol.，1996，157，1840-1845；Cowdery等J.Immunol.，1996，156，4570-4575；Halpern等，CellImmunol.，1996，167，72-78；Yamamoto等，Jpn.J.Cancer Res.，1988，79，866-873；Stacey等，J.Immunol，1996，157，2116-2122；Messina等，J.Immunol.，1991，147，1759-1764；Yi等，J.Immunol.，1996，157，4918-4925；Yi等J.Immunol.，1996，157，5394-5402；Yi等J.Immunol.，1998，160，4755-4761；和Yi等J.Immunol.，1998，160，5898-5906；國際專利申請WO/96/02555，WO 98/16247，WO98/18810，WO 98/40100，WO 98/55495，WO 98/37919和WO 98/52581)，即含有至少一個CG二核苷酸，可任選地用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶；(9)聚氧乙烯乙醚或聚氧乙烯酯如WO 99/52549；(10)結(jié)合了辛苯聚糖(octoxynol)的聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性劑(WO 01/21207)，或與至少一種另外的非離子表面活性劑如辛苯聚糖結(jié)合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑(WO01/21152)；(11)皂角苷和免疫刺激寡聚核苷酸(如CpG寡核苷酸)(WO00/62800)；(12)免疫刺激物和金屬鹽顆粒，如WO 00/23105；(13)皂角苷和水包油乳劑如WO 99/11241；(14)皂角苷(如QS21)+3dMPL +IL-12(任意地加上固醇)如WO 98/57659；(15)細(xì)菌ADP-核糖基化毒素的脫毒突變體，如霍亂毒素(CT)、百日咳毒素(PT)或大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素(LT)，特別是LT-K63(在63位賴氨酸代替野生型氨基酸)，LT-R72(在72位精氨酸代替野生型氨基酸)，CT-S109(在109位絲氨酸代替野生型氨基酸)，和PT-K9/G129(在9位賴氨酸代替野生型氨基酸和在129位甘氨酸代替野生型氨基酸)(見如國際出版物WO 93/13202和WO 92/19265)；和(16)其它作為增強(qiáng)組合物效果的免疫刺激劑的物質(zhì)。較佳的是alum(特別是磷酸鋁和/或氫氧化鋁)和MF59。
胞壁酰肽包括但不僅限于N-乙酰基-胞壁?；?L-蘇氨?；?D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙?；?去甲胞壁?；?normuranmyl)-L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙?；邗；?L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-羥基磷?；?-乙胺(MTP-PE)等。
佐劑的其它例子見Vaccine Design，The Subunit and the AdjuvantApproach，Powell，M.F和Newman，M.J.編，Plenum Press，(1995)。
因此，本發(fā)明組合物的任選的額外組分較佳是佐劑(如鋁鹽)或含有至少一個CpG基序的寡核苷酸。在本文中，短語“CpG基序”指寡核苷酸的二核苷酸部分，該部分含有胞嘧啶核苷酸，與其連接的是鳥嘌呤核苷酸。可采用本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員已知的常規(guī)的寡核苷酸合成制備這些寡核苷酸。較佳的是，本發(fā)明的寡核苷酸含有修飾的骨架，如硫代磷酸酯或肽核酸，以賦予該寡核苷酸以核酶抗性。修飾的骨架在本領(lǐng)域中是已知的。優(yōu)選的肽核酸如下列文獻(xiàn)中所述美國專利5821060、5789573、5736392和5721102、日本專利10231290、歐洲專利839828和PCT出版物WO 98/42735、WO 98/42876、WO 98/36098、WO 98/27105、WO98/20162、WO 98/16550、WO 98/15648、WO 98/04571、WO 97/41150、WO 97/39024和WO 97/38013，本文將這些文獻(xiàn)的全部公開內(nèi)容納入作為參考。
寡核苷酸較佳含有約6-100個核苷酸，更佳是約8-50個核苷酸，最佳是約10-40個核苷酸。此外，本發(fā)明的寡核苷酸在糖部分和含氮堿基部分可含有取代基。優(yōu)選的寡核苷酸在以下文獻(xiàn)中公開，例如Krieg等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，12631-12636；Klinman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93，2879-2883；Weiner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94，10833-10837；Chu等，J.Exp.Med.，1997，186，1623-1631；Brazolot-Millan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，15553-15558；Ballas等，J.Immunol.，1996，157，1840-1845，Cowdery等，J.Immunol.，1996，156，4570-4575；Halpern等，Cell.Immunol.，1996，167，72-78；Yamamoto等，Jpn.J.Cancer Res.，1988，79，866-873；Stacey等，J.Immunol.，1996，157，2116-2122；Messina等，J.Immunol，1991，147，1759-1764，Yi等，J.Immunol.，1996，157，4918-4925，Yi等，J.Immunol.，1996，157，5394-5402；Yi等，J.Immunol.，1998，160，4755-4761；Roman等，Nat.Med.，1997，3，849-854；Davis等，J.Immunol.，1998，160，870-876；Lipford等，Eur.J.Immunol.，1997，27，2340-2344；Moldoveanu等，Vaccine，1988，16，1216-1224；Yi等，J.Immunol.，1998，160，5898-5906；PCT出版物WO 96/02555；PCT出版物WO98/16247；PCT出版物WO98/18810；PCT出版物WO98/40100；PCT出版物WO98/55495；PCT出版物WO98/37919；PCT出版物WO98/52581；本文將這些文獻(xiàn)的全部公開內(nèi)容納入作為參考。應(yīng)理解，本發(fā)明的寡核苷酸含有至少一個CpG基序，但可含有多個CpG基序。
優(yōu)選的寡核苷酸含有核苷酸序列，如tccatgacgttcctgacgtt(SEQ ID NO1)，ataatcgacgttcaagcaag(SEQ ID NO2)，ggggtcaacgttgagggggg(SEQ ID NO3)，tctcccagcgtgcgccat(SEQ ID NO4)，gagaacgctcgaccttcgat(SEQ ID NO5)，tccatgtcgttcctgatgct(SEQ ID NO6)，tccatgacgttcctgatgct(SEQ ID NO7)，gctagacgttagcgt(SEQ ID NO8)，atcgactctcgagcgttctc(SEQ ID NO9)，gaaccttccatgctgttccg(SEQ ID NO10)，gctagatgttagcgt(SEQ ID NO11)，tcaacgtt(SEQ IDNO12)，gcaacgtt(SEQ ID NO13)，tcgacgtc(SEQ ID NO14)，tcagcgct(SEQ ID NO15)，tcaacgct(SEQ ID NO16)，tcatcgat(SEQ ID NO17)，tcttcgaa(SEQ ID NO18)，tgactgtgaacgttcgagatga(SEQ ID NO19)，tgactgtgaacgttagcgatga(SEQ ID NO20)，tgactgtgaacgttagagcgga(SEQ ID NO21)，gtttgcgcaacgttgttgccat(SEQ ID NO22)，atggcaacaacgttgcgcaaac(SEQ ID NO23)，cattggaaaacgttcttcgggg(SEQ ID NO24)，ccccgaagaacgttttccaatg(SEQ ID NO25)，attgacgtcaat(SEQ ID NO26)，ctttccattgacgtcaatgggt(SEQ ID NO27)， and tccatacgttcctgacgtt(SEQ ID NO28)在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，寡核苷酸含有其5′端連接兩個嘌呤、3′端連接兩個嘧啶的CpG基序。但應(yīng)理解，含有CpG基序的任何寡核苷酸都可用于本發(fā)明，只要該寡核苷酸在與本文所述的微粒體組合物混合時能誘導(dǎo)Th1淋巴細(xì)胞刺激的增加。
6.抗原本發(fā)明還涉及含有吸附了大分子(較佳是編碼抗原的載體構(gòu)建物和/或抗原本身)的微粒體的免疫原性組合物。通常，抗原與其受體刺激T淋巴細(xì)胞(較佳是Th1淋巴細(xì)胞)的增殖，并可與淋巴細(xì)胞反應(yīng)，引起一系列的稱為細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的反應(yīng)。因此抗原可誘導(dǎo)CTL反應(yīng)和/或體液反應(yīng)，并可誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子。
表位也在本發(fā)明的抗原的定義之內(nèi)。表位是決定免疫特異性的抗原分子或抗原復(fù)合物的部分。通常，表位是天然抗原的肽或多糖。在人工抗原中，它可以是低分子量物質(zhì)，如阿散酸衍生物。表位將在體內(nèi)或體外特異性地與T淋巴細(xì)胞的同源抗體反應(yīng)。其它的描述是抗原決定子、抗原結(jié)構(gòu)基團(tuán)和半抗原基團(tuán)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，抗原性物質(zhì)從病毒衍生得到，所述病毒如人免疫缺陷病毒(HIV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、單純皰疹病毒(HSV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、流感病毒(flu)和狂犬病毒。較佳的是，抗原性物質(zhì)選擇HSV糖蛋白gD、HIV糖蛋白gp120、HIV p55gag和從pol與tat區(qū)域得到的多肽。在部分的優(yōu)選實(shí)施例中，抗原性物質(zhì)從細(xì)菌如幽門螺旋菌、流感嗜血桿菌、霍亂、白喉、破傷風(fēng)、腦膜炎奈瑟氏球菌和百日咳獲得。在本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施例中，抗原性物質(zhì)從寄生蟲獲得，如瘧疾寄生蟲。在本發(fā)明其它優(yōu)選的實(shí)施例中，抗原吸附在本發(fā)明的微粒體的表面上。
可采用本領(lǐng)域已知的方法生產(chǎn)抗原，或者可從市場上購得。本發(fā)明范圍內(nèi)的抗原包括全滅活的病毒粒子、分離的病毒蛋白和蛋白亞單元、全細(xì)胞和細(xì)菌、細(xì)胞膜和細(xì)胞壁蛋白等等。下面描述了一些優(yōu)選的抗原。
單純皰疹病毒(HSV)rgD2是一種在遺傳工程用的中國倉鼠卵巢細(xì)胞中產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)的正常的錨定區(qū)域被截短，導(dǎo)致糖基化蛋白質(zhì)被分泌到組織培養(yǎng)基中。可在CHO培養(yǎng)基中純化得到大于90％純度的gD2。人免疫缺陷病毒(HIV)env-2-3是由遺傳工程用的釀酒酵母(Saccharomyces cereisae)產(chǎn)生的重組形式的HIV包膜蛋白。這種蛋白質(zhì)代表HIV gp120的整個蛋白質(zhì)區(qū)域，但是并未糖基化，并且從酵母純化時變性。HIV gp 120是一種完全糖基化的gp120的分泌形式，它以與上述gD2相似的方式在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生。適用于免疫原性組合物中的其它HSV抗原在PCT出版物WO85/04587和WO88/02634中有描述，本文將這兩篇文獻(xiàn)的全部內(nèi)容納入作為參考。特別優(yōu)選gB和gD抗原的混合物，這兩種抗原是缺少錨定區(qū)域的截短的表面抗原。
適用于免疫原性組合物的其它HIV抗原在以下文獻(xiàn)中描述1990年3月9日提交的美國申請系列號490858、已出版的歐洲申請?zhí)?81150(1986年5月14日)，以及美國申請系列號60/168471、09/475515、09/475504和09/610313，本文將這些公開的全部內(nèi)容納入作為參考。
適用于免疫原性組合物的巨細(xì)胞病毒抗原在以下文獻(xiàn)中描述美國專利4,689,225，美國申請系列號367363(1989年6月16日提交)，和PCT出版物WO89/07143。本文將這些公開的全部內(nèi)容納入作為參考。
適合用于免疫原性組合物的C型肝炎抗原在下列文獻(xiàn)中描述PCT/US88/04125、已出版的歐洲專利申請?zhí)?18216(1989年5月31日)、1988年11月18日提交的已出版的日本申請?zhí)?-500565、加拿大申請583561和EPO388232，本文將公開的全部內(nèi)容納入作為參考。在以下文獻(xiàn)中描述了不同組的HCV抗原歐洲專利申請90/302866.0(1990年3月16日提交)和美國申請系列號456637(1989年12月21日提交)和PCT/US90/01348，本文將公開的全部內(nèi)容納入作為參考。
本發(fā)明的免疫原性組合物可用于使鳥類和哺乳動物針對疾病和感染產(chǎn)生免疫，所述疾病和感染包括但不限于霍亂、白喉、破傷風(fēng)、百日咳、流感、麻疹、腦膜炎、腮腺炎、瘟疫、小兒麻痹、狂犬病、洛基山斑疹熱(Rocky Mountain spottedfever)、風(fēng)疹、天花、傷寒、斑疹傷寒、貓白血病毒、黃熱病。
本發(fā)明某些免疫原性組合物將使用有效量的抗原。例如，組合物中將含有有效量的抗原和佐劑，該組合物將引起對象產(chǎn)生特異的和足夠的免疫反應(yīng)，從而使該對象在隨后暴露于病毒、細(xì)菌、真菌、支原體或寄生蟲時具有保護(hù)作用。
在其它實(shí)施例中，將使用含有抗原的組合物強(qiáng)化先前給予載體構(gòu)建物產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，該組合物較佳含有編碼該抗原的異源核酸序列。更佳的是，該抗原與本文所述的微粒體結(jié)合(或吸附于其上)，和/或該抗原與佐劑一同給予。
對于可用于本發(fā)明的各種或每一種抗原，本文并未為它們提供特殊的準(zhǔn)則以指定簡單的劑量規(guī)定。抗原的有效量將是其天生的活性和純度的函數(shù)，并可由本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員進(jìn)行常規(guī)試驗(yàn)，憑經(jīng)驗(yàn)而定。應(yīng)理解，本發(fā)明的佐劑組合物可與全細(xì)胞或病毒免疫組合物以及純化的抗原或蛋白質(zhì)亞單元或者由重組DNA技術(shù)或合成制備的肽免疫原性組合物一起使用。
當(dāng)抗原與乳劑一起提供時，由于本發(fā)明的佐劑組合物穩(wěn)定的緣故，通常簡單地?fù)u動該抗原和乳劑即可使它們混合。其它技術(shù)，如使佐劑和抗原的溶液或懸浮液的混合物快速通過小的出口(如皮下注射用針頭)很容易提供一種有用的免疫原性組合物。
本發(fā)明的免疫原性組合物含有約1納克到約1000微克的核酸，較佳是DNA，如CpG寡核苷酸。在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，該免疫原性組合物含有約10納克到約800微克的核酸。在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，該免疫原性組合物含有約0.1-500微克的核酸。在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，該免疫原性組合物含有約1微克到10毫克的核酸。在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，該免疫原性組合物含有約250微克到約1毫克的核酸。在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，該免疫原性組合物含有約500微克到1毫克的核酸。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員可容易地配制含有所需量的核酸的免疫原性組合物。本發(fā)明的免疫原性組合物是無菌和無致熱原的?？煞奖愕匾詥挝粍┝康男问浇o予免疫原性組合物，可采用藥學(xué)領(lǐng)域中已知的任何方法制備該免疫原性組合物，如Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，Easton，PA，1980)，本文將其全部內(nèi)容納入作為參考。
本發(fā)明還涉及刺激宿主動物中的免疫反應(yīng)的方法，該方法包括向該動物給予有效引起免疫反應(yīng)的量的上述一種或多種免疫原性組合物。該宿主動物較佳是哺乳動物，更佳是人。優(yōu)選的給藥途徑包括但不限于肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、眼眶內(nèi)和口腔以及經(jīng)真皮，或者吸入或栓劑給藥。最佳的給藥途徑并可肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下和經(jīng)皮注射。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，使用無針注射裝置向宿主動物給予免疫原性組合物，這是周知的并廣泛使用。根據(jù)本文的講義，本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員可使用無針注射裝置將免疫原性組合物傳送給個體的細(xì)胞。此外，本發(fā)明的實(shí)施例還可與電穿孔一起傳送。
本發(fā)明還涉及使宿主動物針對病毒、細(xì)菌或寄生蟲感染產(chǎn)生免疫的方法，該方法包括向所述動物給予其量能有效引起保護(hù)反應(yīng)的上述一種或多種免疫原性組合物。該宿主動物較佳是哺乳動物，更佳是人。優(yōu)選的給予途徑如上述。雖然針對宿主動物的預(yù)防性的或治療性的治療可針對任何病原體，但是優(yōu)選的病原體包括但不限于上述病毒、細(xì)菌和寄生蟲病原體。
本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)宿主動物的免疫反應(yīng)的方法，該方法包括向上述動物給予其量能有效引起免疫反應(yīng)的上述一種或多種免疫原性組合物。該宿主動物較佳是哺乳動物，更佳是人。優(yōu)選的給藥途徑如上述。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員將很容易熟悉免疫反應(yīng)及其測量。
本發(fā)明考慮使用具有吸附的大分子的聚合物微粒體或亞微粒體乳劑微粒體單獨(dú)或者與其它大分子一起引起免疫反應(yīng)。即本發(fā)明包括吸附了核酸的微粒體、吸附了核酸或免疫刺激分子的亞微粒體乳劑，和吸附了核酸的微粒體與吸附了核酸或免疫刺激分子的亞微粒體乳劑的混合物、還采用電穿孔來提高核酸的傳送。
由下面的實(shí)施例可以證明，本發(fā)明的吸附了大分子的聚合物微粒體可引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。此外，本發(fā)明的亞微粒體乳劑微粒體也引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明的吸附了大分子的微粒體的混合物是一種引起免疫反應(yīng)的強(qiáng)有力的工具。
本文將所引用的所有參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容都納入作為參考。
C.試驗(yàn)下面是實(shí)施本發(fā)明的具體實(shí)施例。這些實(shí)施例僅僅是闡述性的，無論如何都不能認(rèn)為它們限制了本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員將認(rèn)識到在本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)的變動。
已作出努力，以確保所使用的數(shù)值(如數(shù)量、溫度等)的準(zhǔn)確，但是當(dāng)然應(yīng)當(dāng)考慮到一些試驗(yàn)誤差和偏差。實(shí)施例1吸附有核酸的微粒體的制備采用經(jīng)改動的溶劑蒸發(fā)法制備PLG-CTAB。簡言之，通過使用IKA勻漿器以高速用1毫升T.E.緩沖液乳化10毫升5％w/v的聚合物在二氯甲烷中的溶液，從而制得這些微粒體。然后將原始的乳劑加到50毫升的蒸餾水中，該蒸餾水中含有十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)(0.5％w/v)。由此得到水/油/水乳劑，在室溫以6000rpm攪拌該乳劑12小時，使二氯甲烷蒸發(fā)。將所得微粒體放到在蒸餾水，通過以10000g離心洗滌2次，然后凍干。
對于100毫克吸附了DNA的微粒體的典型批次，稱量100毫克的PLG-CTAB陽離子微粒體，將其放到玻璃瓶中，用5毫升、200微克/毫升的DNA溶液(即，含有g(shù)p140或者p55gag的質(zhì)粒pCMV或pSINCP)在T.E.緩沖液中再懸浮。使所得懸浮液渦旋1分鐘，以使這些微粒體均勻地分散在該DNA溶液中。然后將該瓶放到搖動器上，在4℃(低速)搖動，使其過夜吸附。第二天，在Beckman離心機(jī)上以8000rpm離心該溶液10分鐘，使所述微粒體沉淀，收集上清液，用于DNA定量。將所得沉積物再懸浮在1X TE緩沖液中，用刮勺將該沉積物弄散開，然后以8000rpm離心10分鐘，從而對其進(jìn)行1次洗滌。通過用刮勺將最終所得的沉積物打散，從而使其再懸浮在最少量的去離子水(約2毫升)中，然后在臺式凍干機(jī)(Labconco)上將其凍干24小時。
在260納米讀取吸光度，從而檢測上清液中的DNA含量。將DNA加入總量(1毫克/100毫克微粒體)減去上清液中的量，從而計(jì)算得吸附在微粒體上的DNA的量。通過將5毫克最終制劑溶解在0.5M NaOH/1％SDS溶液中，然后在260納米讀取水解后的清晰溶液的吸光度，從而評估總負(fù)荷。實(shí)施例2吸附了核酸的亞微粒體乳劑微粒體的制備將DOTAP(在氯仿中)加到燒杯中，然后使其蒸發(fā)到體積為200微升，從而制得由MF59和DOTAP形成的亞微粒體乳劑。加入Tween(0.Sw/w)、角鯊烯(5.0％w/w)和山梨糖醇酯類(0.5％w/w)，為了獲得用于最終乳化作用的均質(zhì)原液，用具有10毫米探頭的Omni勻漿器以10K轉(zhuǎn)速/分鐘將所得溶液均化1分鐘。使所得乳劑通過～800psi下的顯微流化器M11OS勻漿器(Microfluidics Co.，Newton，MA)5次、在Coulter的DELSA 440 SX Zetasizer上測得該乳劑的ζ勢能(凈表面電荷的測量值)大約為+55毫伏。
通過使DNA(1毫克HIV-1 gp140 DNA或0.5毫克p55gag DNA，存在于pCMV或pSINCP中)在4℃過夜與所述亞微粒體乳劑一起培育，從而將這些DNA吸附到亞微粒體上。實(shí)施例3用于吸附到微粒體上的ELVIS載體和其它載體構(gòu)建物的制備使用辛德比斯病毒作為代表性例子，構(gòu)建基于α病毒的ELVIS載體和復(fù)制子載體。較佳的是，本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員可容易地采用以下步驟由任何α病毒衍生得到載體。用新德比斯病毒的SINDCchiron株(ATCC保藏號VR-2643，1999年4月13號)感染大約107個BHK-21細(xì)胞，MOI為1PFU/細(xì)胞。感染24小時后，在CPE發(fā)展后，根據(jù)制造商的建議，使用TRIzo1試劑(GIBCO/BRL)從這些細(xì)胞中分離出總RNA。純化后，將病毒RNA溶解在沒有核酶的水中，將所得溶液分成等分，然后在-80℃保存，以在接下來的cDNA克隆中使用。
采用PCR擴(kuò)增進(jìn)行cDNA合成，使用以下引物(表示各引物的新德比斯核苷酸編號)1CCACAAGCTTGATCTAATGTACCAGCCTGATGC 11472-11450(SEQ ID NO29)1.1 CCACGAATTCAGCCAGATGAGTGAGGC 10364-10381(SEQ ID NO30)2CCACAAGCTTCAATTCGACGTACGCCTCAC10394-10375(SEQ ID NO31)2.1 CCACGAATTCATATGGGGAAATCATGAGCC9614-9634(SEQ ID NO32)3CCACAAGCTTCATAGACCCTCACTGGCTC 9648-9630(SEQ ID NO33)3.1 CCACGAATTCAAGATTAGCACCTCAGGACC8878-8899(SEQ ID NO34)4CCACAAGCTTCTACACGGTCCTGAGGTGC 8908-8887(SEQ ID NO35)4.1 CCACGAATTCCGTCCGATCATGGTAACTCC8294-8315(SEQ ID NO36)5CCACAAGCTTGCGCCACCGAGGAC 8347-8334(SEQ ID NO37)5.1 CCACGAATTCACTGCCATGTGGAGGCC 7797-7814(SEQ ID NO38)6CCACCTCGAGTTTACCCAACTTAAACACGC7368-7348(SEQ ID NO39)6.1 CCACGAGCTCGCGACATTCAATGTCGAATGC 6426-6446(SEQ ID NO40)7CCACCTCGAGGAACTCCTCCCAATACTCGTC 6488-6468(SEQ ID NO41)7.1 CCACGAGCTCGACCTTGGAGCGCAATGTCC5843-5862(SEQ ID NO42)8CCACCTCGAGTTTCGACGTGTCGAGCACC 5900-5882(SEQ ID NO43)8.1 CCACGAGCTCGACCATGGAAGCAATCCGC 4814-4832(SEQ ID NO44)9CCACCTCGAGACGACGGGTTATGGTCGAC 4864-4845(SEQ ID NO45)9.1 CCACGAGCTCCACGGAGACAGGCACCGC 4246-4264(SEQ ID NO46)10 CCACCTCGAGGATCACTTTCTTTCCTAGGCAC 4299-4277(SEQ ID NO47)10.1 CCACGAGCTCGAACTCTCCCGTAGATTTCC3407-3427(SEQ ID NO48)11 CCACCTCGAGATCAAGTTGTGTGCCCTTCC3464-3445(SEQ ID NO49)11.1 CCACGAGCTCCCAGGGGATATCATCCTGAC2742-2761(SEQ ID NO50)12 CCACCTCGAGGCTGTCATTACTTCATGTCCG 2825-2804(SEQ ID NO51)12.1 CCACGAGCTCGAACCGCAAACTATACCACATTGC 1976-1999(SEQ ID NO52)13 CCACCTCGAGCTTGTACTGCTCCTCTTCTG 2042-2023(SEQ ID NO53)13.1 CCACGAGCTCGGAGAACGGGTATCGTTCC 1029-1047(SEQ ID NO54)14 CCACCTCGAGCCGGGATGTACGTGCAC1069-1052(SEQ ID NO55)14.1 CCACGAGCTCATTGACGGCGTAGTACACAC 1-20(SEQ ID NO56)使用引物對1-5來克隆病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因，而將引物對6-14用于病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因。引物對1-5中的寡核苷酸含有代表EcoRI和HindIII的限制酶切位點(diǎn)的額外序列，這些序列在新德比斯病毒的亞基因組RNA中并不存在。寡核苷酸6-14含有SacI和XhoI的位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在新德比斯病毒目前的已測序的鏈的整個基因組中也不存在(這些位點(diǎn)用下滑線標(biāo)出)。
根據(jù)制造商的建議，使用SuperscriptII酶(GIBCO/BRL)進(jìn)行各反轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)，體積為50微升。反應(yīng)混合物含有等價于106個細(xì)胞的RNA的量和50pmol的下述各引物。
混合物1引物1、3和5混合物2引物2和4混合物3引物6、9和12混合物4引物8、11和14將所得RT反應(yīng)物冷卻，然后用于PCT擴(kuò)增。根據(jù)制造商的建議，使用VentDNA聚合酶(NEB)進(jìn)行PCR反應(yīng)。每50微升PCR反應(yīng)物含有3微升的上述RT混合物和50pmol的引物。總共進(jìn)行14個反應(yīng)(表1)。
表1

片段1-5的PCR反應(yīng)條件如下以95℃30秒、56℃30秒、74℃90秒為一輪，共12輪。對于片段6-14，循環(huán)由12輪增加到15輪。通過瓊脂糖凝膠電泳分析各反應(yīng)混合物的小等分試樣，其證實(shí)所需大小的片段的存在。用苯酚-氯仿抽提余下的反應(yīng)混合物，用乙醇沉淀出DNA片段。
對于克隆，使用HindIII和EcoRI消化片段1-5，然后使它們與經(jīng)相同的酶處理的質(zhì)粒pRS2(在多接頭上具有額外的限制位點(diǎn)的pUC19)連接。用SacI和XhoI消化片段6-14，然后使它們與經(jīng)SacI和XhoI處理的相同的pRS2質(zhì)粒連接。將所有的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-1 Blue株(Stratagene，La Jolla，CA)中。
此外，還使用以下引物對產(chǎn)生代表亞基因組啟動子區(qū)域和3′端非翻譯區(qū)的cDNA克隆
YSIN1F5’-GATTCGGTTACTTCCACAGC(SEQ ID NO57)YSIN1R5’-ACTGACGGCTGTGGTCAGTT(SEQ ID NO58)YSIN2F5’-GATGTACTTCCGAGGAACTG(SEQ ID NO59)YSIN2R5’-CCACAAGCTTGAATGTTAAAAACAAAATTTTGT(SEQ ID NO60)使各轉(zhuǎn)化物的陽性菌落生長，根據(jù)制造商的建議，使用QIAGEN試劑金純化質(zhì)粒。然后，分別將標(biāo)記為p1-p14的片段裝配成適當(dāng)?shù)妮d體構(gòu)型。
使用新德比斯病毒cDNA克隆p1-p14加上下面的亞基因組和3′端區(qū)域片段，構(gòu)建用于體外轉(zhuǎn)錄復(fù)制子載體RNA的真核生物分層載體起始系統(tǒng)(EukaryoticLayered Vector Initiatien System，ELVIS)和α病毒載體構(gòu)建物。使含有SP6 RNA聚合酶的啟動子和新德比斯病毒基因組RNA起點(diǎn)的ApaI-MscI片段與克隆的片段14的MscI-XhoI片段在ApaI-XhoI消化的質(zhì)粒pRS2中連接。所得質(zhì)粒稱為p15。接著，將p8的SacI-EcoRI片段、p7的EcoRI-NsiI片段以及p6的NsiI-XhoI片段連接到SacI-XhoI消化的pRS2中。所得的質(zhì)粒稱為p16。接著，將p12的SacI-MunI片段、p11的MunI-NheI片段和p10的NheI-XhoI片段連接到SacI-XhoI消化的pRS2質(zhì)粒中。所得的質(zhì)粒稱為p17。將p15的ApaI-ApaLI片段和p13的ApaLI-XhoI片段連接到ApaI-XhoI處理的pRS2中，所得的質(zhì)粒稱為p18。接著，將p18的ApaI-NsiI片段和p17的NsiI-XhoI片段一起連接到ApaI-XhoI處理的pRS2中。所得的質(zhì)粒稱為p19。最后，將p19的ApaI-AvrII片段、p9的AvrII-SalGI片段和p16的SalGI-BamHI片段一起連接到先前構(gòu)建的表達(dá)GFP報(bào)道基因的新德比斯復(fù)制子載體中(參見Dubensky等，J.Virol.，70508-519，1996；Polo等，1999，同前；和美國專利5843723)，該載體已經(jīng)被ApaI-BamHI消化，除去了先前存在的非結(jié)構(gòu)蛋白基因。所得的新德比斯載體構(gòu)建物含有從SINDCchrion病毒株獲得的序列，還編碼GFP報(bào)道基因，稱為SINCR-GFP(也已知為DCSP6SINgfp)。使用PmeI使該DNA直線化，接著如先前所述(Polo等，同前；Dubensky等)，使用噬菌體SP6聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，從而從上述報(bào)道基因構(gòu)建物制備復(fù)制子RNA，以及表達(dá)各種其它異源序列(如抗原，詳見本說明書中的描述)的新德比斯載體構(gòu)建物。
類似地，將新德比斯序列裝配到基于α病毒的真核生物分層載體起始系統(tǒng)(參見美國專利5814482和6015686)中，在該系統(tǒng)中，自增大的載體RNA在ELVIS質(zhì)粒DNA-轉(zhuǎn)染的真核生物細(xì)胞中經(jīng)由真核生物啟動子(如RNA聚合酶II啟動子)直接進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。通過用上面獲得的相應(yīng)的SINCR-GFP序列取代已存在的ELVIS載體中的新德比斯衍生序列，可以構(gòu)建一種也表達(dá)GFP報(bào)道基因的ELVIS質(zhì)粒DNA。以之前描述的ELVIS載體pSINI1.5(Hariharan等，J.Virol.，72950-958，1998)開始，使用各質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)的兩個SacI位點(diǎn)，用從pCMVLink得到的骨架(zurMegede等，J.Virol.，742628-2635，2000)取代原質(zhì)粒骨架，從而對其進(jìn)行修飾，以產(chǎn)生中間構(gòu)建物，即ELVIS1.5CB。接著，用SacI部分消化ELVIS1.5CB，用T4DNA聚合酶產(chǎn)生粘性末端，然后使其連接到修飾位點(diǎn)PmeI接頭5′-GTTTAAAC-3′上，從而將ELVIS1.5CB的兩個SacI位點(diǎn)中的一個消除(接近SIN 3′端的位點(diǎn))。將沒有靶定的SacI位點(diǎn)的正確的質(zhì)粒稱為ELVIS1.5CbdlSac。然后用SacI和XhoI進(jìn)行消化，將這種中間質(zhì)粒制備成新的SIN非結(jié)構(gòu)蛋白基因的插入子。采用PCR擴(kuò)增，由SINCR-GFP獲得相應(yīng)的非結(jié)構(gòu)基因，使用到以下寡核苷酸引物5′CCTATGAGCTCGTTTAGTGAACGTATTGACGGCGTAGTACACAC(SEQ IDNO61)和5′CCTATCTCGAGGGTGGTGTTGTAGTATTAGTC(SEQ ID NO62)，接著用SacI和XhoI消化，連接，得到中間構(gòu)建物SINCP-Not。最后，通過部分消化此構(gòu)建物，然后加入Klenow片段，將此構(gòu)建物兩個NotI位點(diǎn)中的一個除去，僅留下位于多接頭中的NotI位點(diǎn)。將這種新構(gòu)建的ELVIS載體稱為SINCP(或pSINCP)。
首先用XhoI/NotI或XhoI/XbaI消化SINCR或SINCP α病毒載體，接著將其與所需的仍具有XhoI/NotI或XhoI/XbaI末端的DNA片段連接，從而可將異源序列(如編碼抗原的基因)插入其中?；蛘?，可將這些位點(diǎn)變?yōu)檎承阅┒?，或者可使用其它多接頭位點(diǎn)(或者可取代其它異源序列)，以使大量插入子的克隆得以進(jìn)行。例如，將HIV-1 p55gag(SF2株)和gp140 env(SF162株)編碼基因插入這些載體中。具體而言，通過用XhoI/XbaI消化該載體，然后在由SalI/XbaI消化獲得的p55gagmod片段中進(jìn)行連接，從而可將密碼子優(yōu)化的HIV p55gagmod序列(參見共同擁有的美國專利申請09/475515；zur Megede等，同前)插入。所得的載體稱為SINCR-p55gag和SINCP-p55gag。類似地，將密碼子優(yōu)化的HIV gp140序列(在實(shí)施例10中描述，以及Banett等，2001，J.Virol.，755526-40)插入SINCR和SINCP質(zhì)粒中，產(chǎn)生構(gòu)建物SINCR-gp140和SINCP-gp140。如實(shí)施例中所述，制備由SINCR質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄得到的ELVIS質(zhì)粒DNA(pSINCP)和RNA載體復(fù)制子。實(shí)施例4使用微粒體或亞微粒體乳劑用具有pCMV或pSINCP質(zhì)粒的抗原免疫獼猴如前面實(shí)施例1和2所述，制備PLG聚合物微粒體和MF59亞微粒體乳劑。為了分析具有存在于微粒體上或亞微粒體乳劑中的質(zhì)粒載體構(gòu)建物、pCMV-gp140或pCMV-p55gag(參見共同擁有的美國專利申請09/475515)的免疫獼猴的不同效果，以及比較使用上面構(gòu)建的ELVIS質(zhì)粒、pSINCP-gp140或pSINCP-p55gag的效果，制備了多組微粒體和亞微粒體乳劑。使用下述不同的制劑免疫6組動物第1組使用了pCMV-gp140和pCMV-p55gag，沒有微粒體或亞微粒體乳劑；第2組使用了吸附在PLG/CTAB微粒體上的pCMV-gp140和pCMV-p55gag；第3組使用了吸附在MF59-DOTAP亞微粒體乳劑中的pCMV-gp140和pCMV-p55gag；第4組使用了沒有微粒體或亞微粒體乳劑的pSINCP-gp140和pSINCP-p55gag；第5組使用了吸附在PLG/CTAB微粒體上的pSINCP-gp140和pSINCP-p55gag；第6組為對照，沒有使用抗原，也沒有使用微粒體和亞微粒體乳劑。
對于各組動物，用足量的物質(zhì)免疫5只獼猴(第6組僅有4只)，這樣使具有g(shù)p140 DNA的載體的劑量達(dá)到每只1.0毫克，使含有p55gag DNA的載體的劑量達(dá)到每只0.5毫克，但是對照組除外。第一次免疫后4周進(jìn)行第二次免疫，第一次免疫后14周進(jìn)行第三次免疫。分析第2周(2wp1)、第6周(2wp2)、11-12周(7wp2)和第16周(2wp3)的血清。免疫途徑是IM TA。免疫后，測量血漿抗-p55gag和抗-gp140 IgG滴度，結(jié)果列在表2和3中，這些結(jié)果為幾何平均滴度。
表2

表3

使用與前述相同的動物組分析CTL反應(yīng)的誘導(dǎo)。效應(yīng)器∶靶標(biāo)比(E∶T)的范圍為大約4∶1到100∶1。CTL試驗(yàn)的結(jié)果顯示在表4和5中?！皯?yīng)答者”是其靶標(biāo)在兩個或更多個連續(xù)的E∶T比中顯示出10％或更多的特異性裂解的獼猴。
表4

表5

還使用相同的動物進(jìn)行淋巴增殖分析。這種試驗(yàn)測量T細(xì)胞在體外對抗原的再刺激作出響應(yīng)而產(chǎn)生的特異性增殖。通過在Ficoll-Hypaque梯度上離心，從肝素化的全血中純化出獼猴外周血單核細(xì)胞(PBMC)。在平底微滴定板上在存在和缺乏3微克/毫升的純化的重組p55gag蛋白的情況下，以2×105個細(xì)胞/孔的數(shù)量培育PBMC。每種條件進(jìn)行6組相同培育。培育4天后，加入氚化的胸苷{(diào)[3H]TdR}(每孔1微居里)。繼續(xù)過夜培育，第二天收集。將細(xì)胞沉積到玻璃微纖維濾片上。使濾片暴露在閃爍液體中，在液體閃爍計(jì)數(shù)器下計(jì)數(shù)。對于加入[3H]TdR的各條件，計(jì)算6組中以每分鐘的平均計(jì)數(shù)(cpm)測得的數(shù)值。所得的結(jié)果列在表6中。用p55gag刺激的細(xì)胞的每分鐘計(jì)數(shù)(cpm)除以未刺激細(xì)胞的cpm，計(jì)算幾何平均刺激指數(shù)(Geometric Mean Stimulation Index，GMSI)，因此，GMSI越大，其結(jié)果越顯示為陽性。
表6

還使用相同的動物來分析胞內(nèi)細(xì)胞因子生產(chǎn)的誘導(dǎo)。這種試驗(yàn)測量T細(xì)胞體外針對抗原的短暫再刺激作出響應(yīng)而產(chǎn)生的細(xì)胞因子的特異性生產(chǎn)。通過在Ficoll-Hypaque梯度上離心，從肝素化的全血中純化出獼猴外周血單核細(xì)胞(PBMC)。在共刺激性抗-CD28單克隆抗體的存在下，用橫跨gag(或env)蛋白序列的合成性重疊肽刺激1×106PBMC的等分試樣。加入布雷菲德菌素A，以使新合成的細(xì)胞因子在細(xì)胞中積聚。過夜培育PBMC后，用市售獲得的用于檢測胞內(nèi)干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(THF-α)以及細(xì)胞表面CD4和CD8標(biāo)記物的熒光標(biāo)記的單克隆抗體進(jìn)行染色。在流式細(xì)胞器上分析染色的細(xì)胞樣品，獲得大約50000-100000PBMC的數(shù)據(jù)。使用市售獲得的軟件測定各樣品中細(xì)胞因子陽性細(xì)胞的頻率。gp140和p55gag的結(jié)果分別列在表7和8中。這兩個表顯示了響應(yīng)動物的數(shù)量，其中應(yīng)答者被定義為具有以下動物分值的動物采用細(xì)胞內(nèi)染色的方法，每100000個CD4細(xì)胞中有100個以上表達(dá)THF-α和IFN-γ。
表7

表8

實(shí)施例5RNA載體構(gòu)建物可將RNA載體構(gòu)建物(如復(fù)制子)吸附到微粒體上，以用于將異源核酸序列傳送到動物的細(xì)胞中。RNA載體構(gòu)建物通常含有病毒RNA，該病毒RNA中的基因組RNA區(qū)域(如結(jié)構(gòu)蛋白基因)被選擇的異源序列取代，該異源序列衍生自用于感興趣的基因產(chǎn)物的DNA編碼序列。RNA載體構(gòu)建物的代表性例子包括但不限于α病毒RNA載體(例如，可參見美國專利5843723，PCT出版物WO 99/18226，和Polo等，1999，PNAS，964598-4603)、小RNA病毒RNA載體(例如，可參見美國專利6156538，和Vignuzzi等，2001，J Gen Virol.，821737-47)、黃病毒RNA載體(例如，可參見Vamavski等，1999，Virology，255366-75)、和風(fēng)疹病毒RNA載體(例如，可參見Pugachev等，2000，J.Virol.，7410811-5)。用于本發(fā)明的RNA載體構(gòu)建物通常可采用標(biāo)準(zhǔn)的體外轉(zhuǎn)錄，由作為原料的質(zhì)粒cDNA構(gòu)建物獲得(參見上面的文獻(xiàn))。與質(zhì)粒DNA類似，可將這些RNA載體構(gòu)建物吸附到本發(fā)明的微粒體上，如實(shí)施例中所述。例如，通過在1毫克/毫升的DNA溶液中，在4℃培育100毫克的陽離子微粒體6小時，從而可將這些RNA載體構(gòu)建物吸附到所述微粒體上。然后離心分離這些微粒體，用TE緩沖液洗滌所得沉淀，然后凍干微粒體。PLG-配制的RNA載體構(gòu)建物的重新配制和傳送與DNA的相似，使用例如至少1微克、10微克、100微克或1000微克的配制的RNA載體構(gòu)建物用于傳送。實(shí)施例6小鼠中的佐劑使用小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，分析佐劑磷酸鋁(alum)在小鼠中的作用。如上述制得聚合物微粒體，其上吸附或沒有吸附pCMV-p55gag。在第0周和第6周，將10微克DNA(不管是裸的還是吸附在PLG微粒體上的)注射給6 CB6 F1組的小鼠，其中存在或不存在磷酸鋁。結(jié)果顯示在表9中，以幾何平均滴度計(jì)。
表9

實(shí)施例7用微粒體和ELVIS載體和RNA載體構(gòu)建物進(jìn)行電穿孔電穿孔可以與與上述任何核酸(如質(zhì)粒DNA、ELVIS載體和RNA載體構(gòu)建物)一起制得的聚合物微粒體或亞微粒體乳劑微粒體一起使用。實(shí)施例8用初次和強(qiáng)化免疫誘導(dǎo)獼猴的免疫應(yīng)答進(jìn)行試驗(yàn)，以測定初次用DNA免疫，接著用吸附在PLG微粒體上的蛋白質(zhì)強(qiáng)化的效果。具體而言，如上文以及共同擁有的國際專利申請PCT/US99/17308所述制得PLG-SDS微粒體，然后使純化的重組p55gag蛋白吸附到這些微粒體的上面。用1毫克pCMV-p55gag免疫一組動物。在第4周再次免疫這些動物，然后在第8周再免疫一次。在第41周，用吸附在PLG微粒體上的p55gag蛋白強(qiáng)化免疫這些動物。結(jié)果顯示在表-10中，其中顯示了應(yīng)答者的抗體滴度、輔助T細(xì)胞淋巴增殖的誘導(dǎo)(應(yīng)答者的平均刺激指數(shù))以及CTL的誘導(dǎo)(應(yīng)答者的數(shù)量，以在兩個或多個連續(xù)的E∶T比中大于10％的裂解計(jì))。結(jié)果是在第3次初次刺激后14周測得的初次體積，以及在強(qiáng)化刺激后2周測得的強(qiáng)化體積。圓括號中的數(shù)值是總的4只動物中應(yīng)答動物的數(shù)量。
表10

實(shí)施例9中和抗體的誘導(dǎo)用上面實(shí)施例5的獼猴的血清測試對兩種不同的HIV-1株(SF2和SF162)的抑制作用，使用到PMBC-生長的病毒原液和基于CCR5+/CXCR4+/CD4+T細(xì)胞系的試驗(yàn)。將血清以1∶20稀釋。測量抑制活性，并以抑制百分?jǐn)?shù)表達(dá)。將各動物所得的結(jié)果減去各動物免疫前的血清的抑制活性。各組5只動物中每只動物的結(jié)果列在表11中。
表11

實(shí)施例10質(zhì)粒的制備使由人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子驅(qū)動、編碼HIV-1 p55gag和gp140env的質(zhì)粒在大腸桿菌DH5α株中生長，用Qiagen Endofee Plasmid Giga試劑盒(Qiagen，Inc.)進(jìn)行純化，然后再懸浮在0.9％氯化鈉中(Abbott Laboratories，North Chicago，Ill.)。所使用的pCMV載體含有CMV的立即早期增強(qiáng)子/啟動子和牛生長激素終止子，這在別處有詳細(xì)的描述〔Chapman，B.S.等，1999，《從人巨細(xì)胞病毒(Towne)立即早期基因獲得的內(nèi)含子A在哺乳動物細(xì)胞中對異源表達(dá)的影響》(Effeet of intronA from human cytomegalovirus(Towne)immediate-early gene on heterologousexpression in mammalian cells)，《核酸參考》(Nucleic Acids Res.)，193979-86〕。HIV gag質(zhì)粒DNA疫苗(pCMVgag)含有合成構(gòu)建的p55gag基因，和反映哺乳動物用途的密碼子，該密碼子如先前所述從HIV-1 SF2株衍生得到〔zur Megede，J.等，2000，《序列修飾的人免疫缺陷病毒1型gag基因的增加表達(dá)和免疫原性》(Increased expression and immunogenicity of sequence-modified humanimmunodeficiedcy virus type 1 gag gene)，J.Virol.，742628-35〕。HIV env質(zhì)粒DNA疫苗(pCMVgp140)由人組織纖溶酶原激活物(tPA)信號序列和從HIV-1 SF162株獲得的gp140組成，其密碼子被優(yōu)化，以在哺乳動物細(xì)胞中獲得高水平的表達(dá)〔Barnett，S.W.等，2001，《寡聚人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)包膜抗原引起針對初次HIV-1分離物的中和抗體的能力通過部分刪除第二高度可變區(qū)而得到提高》(The ability of an oligomeric human immunodeficiecy virus type 1(HIV-1)envelopeantigen to elicit neutralizing antibodies against primary HIV-1 isolates is improvedfollowing partial deletion of the second hypervariable region)，J.Virol.，7552526-40〕。在實(shí)施例3中已經(jīng)描述了具有HIV-1 p55gag或gp140env的SINCP質(zhì)粒載體。實(shí)施例11蛋白質(zhì)的制備gp160envSF162的蛋白質(zhì)和cDNA序列已由Cheng Mayer、C.M.Quiroga、J.W.Tung、D.Dina和J.A.Levy在1990年在《人免疫缺陷病毒1型T細(xì)胞的病毒決定子或巨噬細(xì)胞向性，致細(xì)胞病性，以及CD4抗原調(diào)節(jié)》(Viral determinants of humanimmuodeficiency virus type 1 T-cell or macrophage tropism cytopathogenicity，andCD4 antigen modulation)(J.Virol.，644390-8)中公開。這些序列可在Genbank中找到，保藏號為M65024。使重組HIV-1g140.SF162(dV2)蛋白在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中表達(dá)，然后如先前所述進(jìn)行純化(Barnett，S.W.，ET.，2001，J.Virol.，755526-40)。
使重組HIV-1.SF2 p55gag蛋白在酵母中表達(dá)，然后采用陽離子交換色譜法進(jìn)行純化(希龍公司，Emeryville，CA)。將從HIV-1的SF2株獲得的p55gag cDNA序列(Genbank保藏號K02007)克隆到遍在蛋白質(zhì)表達(dá)載體中，得到在野生型序列的N末端上加入了甘氨酸和精氨酸的序列。使用50mM磷酸鹽、6M尿素(pH7.9)從酵母細(xì)胞沉淀物中抽提出重組的p55gag蛋白，接著進(jìn)行S-fractogel(陽離子性)離子交換色譜法純化。使用線性NaCl梯度得到p55gag的洗脫液(峰值出現(xiàn)在0.4m的NaCl)。采用SDS-PAGE評估純度為90％。實(shí)施例12吸附了DNA的聚(丙交酯-共-乙交酯)PLG微粒體從Boehringer Ingelheim獲得PLG聚合物(RG505)。采用改動的溶劑蒸發(fā)法制備陽離子型微粒體。簡言之，通過使用IKA勻漿器以高速用1毫升磷酸鹽緩沖液(PBS)乳化10毫升5％w/v的聚合物在二氯甲烷中的溶液，從而制得這些微粒體。然后將原始的乳劑加到50毫升的蒸餾水中，該蒸餾水中含有十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)(0.5％w/v)。由此得到水包油包水乳劑，在室溫以6000rpm攪拌該乳劑12小時，使二氯甲烷蒸發(fā)。將所得微粒體放入蒸餾水，通過以10000g離心洗滌2次，然后凍干。通過在4℃使100毫克的陽離子型微粒體在5毫升200微克/毫升的實(shí)施例11的質(zhì)粒DNA溶液中培育6小時，從而使該質(zhì)粒DNA吸附到所述微粒體上。然后離心分離這些微粒體，用TE(Tris-EDTA)緩沖液洗滌所得沉淀物，凍干這些微粒體。實(shí)施例13吸附了蛋白質(zhì)的PLG微粒體采用溶劑蒸發(fā)技術(shù)制備空白微粒體。簡言之，使用10毫米探針，以高速使10毫升6％w/v的聚合物在二氯甲烷中的溶液與40毫升含有SDS(1％w/v)的蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，從而制得所述微粒體。所得溶液為水包油乳劑，然后在室溫以1000rpm攪拌所得乳劑12小時，使二氯甲烷蒸發(fā)。用38um目的篩過濾所得的微粒體，用蒸餾水洗滌3次，然后凍干。使用粒徑分析器(Master sizer，Malvern Instruments，UK)測得所得微粒體的大小分布。
使50毫克凍干的SDS空白微粒體與0.5毫克實(shí)施例12的p55gag蛋白在10毫升pH為9的25mM硼酸鹽緩沖液(加了6M的尿素)中培育。在室溫將顆粒放在實(shí)驗(yàn)用振蕩器(Aliquot mixer，Miles labs)上5小時。離心使所得微粒體從培育培養(yǎng)基中分離，用含有6M尿素的硼酸鹽緩沖液洗滌SDS沉淀物1次，然后用蒸餾水洗滌3次，凍干。
通過在室溫將10毫克所得微粒體溶解在2毫升5％SDS-0.2M氫氧化鈉溶液中，從而測定蛋白質(zhì)吸附到微粒體上的負(fù)荷水平。采用BCA蛋白質(zhì)檢測(Pierce，Rockford，Illinois)測量蛋白質(zhì)的濃度。使用Malvemζ分析器(Malvern Instruments，UK)測量空白的微粒體和吸附了蛋白質(zhì)的微粒體的ζ勢能。實(shí)施例14具有MF59佐劑的蛋白質(zhì)的制備如先前所述(Barnett，S.W.等，2001，J.Virol.，755526-40)，將實(shí)施例12的重組HIV-1 g140.SF162(dV2)蛋白與MF59佐劑混合。實(shí)施例15免疫在Southern Research Institute(Frederick，MD)飼養(yǎng)雄性和雌性獼猴。
在第0、4和14周進(jìn)行質(zhì)粒DNA免疫。給獼猴肌肉內(nèi)注射0.5毫克實(shí)施例11的pCMV gag(在鹽水中，或者如實(shí)施例13與PLG/CTAB微粒體一起配制，或者如實(shí)施例2所述與MF59/DOTAP一起配制)和1.0毫克實(shí)施例11的pCMV env(在鹽水中，或者如實(shí)施例13所述與PLG/CTAB微粒體一起配制)，每只動物在4個分離位置上進(jìn)行注射(在右上臂和右上腿分別注射0.25毫克的pCMV gag；在左上臂和左上腿分別注射0.5毫克的pCMV env)?；蛘撸o獼猴肌肉內(nèi)注射0.5毫克實(shí)施例11的pSINCPgag(在鹽水中，或者如實(shí)施例13所述與PLG/CTAB微粒體一起配制)和1.0毫克實(shí)施例11的pSINCP env(在鹽水中，或者如實(shí)施例13所述與PLG/CTAB微粒體一起配制)，也在每只動物的4個不同位置上進(jìn)行注射。
在第29周給獼猴肌肉內(nèi)注射0.2毫克實(shí)施例14的重組p55gag蛋白/PLG微粒體，在第38周給它們肌肉內(nèi)注射0.1毫克實(shí)施例15的重組gp140env(dV2)蛋白/MF59佐劑，以進(jìn)行強(qiáng)化。實(shí)施例16抗體反應(yīng)在免疫后各任何時間，從麻醉的動物收集肝素化的血液，離心回收血漿。采用酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)測量抗-HIV Gag和Env抗體，具體如下。用5微克/毫升的重組HIV-1.SF2 p55gag蛋白或重組HIV-1.SF162 gp140env蛋白在PBS中的溶液包涂微滴定板的孔，每孔50微升，然后在4℃過夜培育。用洗滌緩沖液(PBS，0.3％Tween 20)洗滌平板6次，然后在37℃每孔用200微升阻斷緩沖液(PBS，0.3％Tween 20，5％山羊血清)阻斷1小時。以1∶25稀釋測試樣品，然后逐次在阻斷緩沖液中稀釋3倍。吸出該阻斷溶液，然后在室溫培育這些平板1小時，該平板每孔具有70微升的上述血漿稀釋液。洗滌6次后，將平板在37℃與偶聯(lián)了辣根過氧化物酶的抗-IgG(1∶8000稀釋度)培育1小時。洗滌6次后，用TMB底物發(fā)展這些平板15分鐘。用2N HCl中止反應(yīng)，在450納米波長測量光密度(OD)。以獲得0.5的OD450nm時的稀釋液的倒數(shù)計(jì)為滴度。
表12獼猴抗-gag血漿抗體滴度

(1) 相對于在第0、4和14周進(jìn)行的質(zhì)粒免疫(2) 各組的幾何平均值(3) 由對數(shù)轉(zhuǎn)化滴度計(jì)算得到的組算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，LL＝算術(shù)平均值-標(biāo)準(zhǔn)誤差的反對數(shù)；UL＝算術(shù)平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤差的反對數(shù)(4) 在第29周給予吸附到陰離子性PLG微粒體上的重組p55gag蛋白表13獼猴抗-env血漿抗體滴度

(1) 相對于在第0、4和14周進(jìn)行的質(zhì)粒免疫(2) 各組的幾何平均值(3) 由對數(shù)轉(zhuǎn)化滴度計(jì)算得到的組算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，LL＝算術(shù)平均值-標(biāo)準(zhǔn)誤差的反對數(shù)；UL＝算術(shù)平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤差的反對數(shù)(4)在第38周給予重組寡聚gp140env(ΔV2)蛋白/MF59佐劑實(shí)施例17溶細(xì)胞性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)制備51條長各20個氨基酸(aa)、有10個氨基酸重疊并橫跨p55gag的合成肽的混合物，和66條長各20個氨基酸、有10個氨基酸重疊、并橫跨gp140的合成肽的混合物。在Ficoll-Paque(Pharmacia Biotech，Piscataway，N.J.)梯度上離心，從肝素化的血液中分離出獼猴外周血單核細(xì)胞(PBMC)。將PBMC放到24孔平板中培育8天，每孔3×106個細(xì)胞、1.5毫升AIMV/RPMI 1640(50∶50)培養(yǎng)基(Gibco-BRL，Grand Island，N.Y.)，該培養(yǎng)基補(bǔ)充了10％的胎牛血清。加入上述gag肽混合物刺激gag特異性CTL，加入上述env肽混合物刺激env特異性CTL。用重組的人白介素-7(IL-7，15納克/毫升；R & D Systems，Minneapolis，Minn.)補(bǔ)充該培養(yǎng)基。在第1、3和6天加入人重組IL-2(20IU/毫升，Proleukin，希龍)。將PBMC暴露于含有狒狒皰疹病毒培養(yǎng)基上清液中，在0.5微克/毫升的環(huán)菌素A(Sigma，St.Louis，MO)的存在下，從S594細(xì)胞系〔Falk，L.等，1976，《涉及EB病毒的狒狒嗜淋巴細(xì)胞性皰疹病毒的特性》(Properties of a baboon lymphotropic herpesvirusrelated to Epstein-Barr virus)，Int J Cancer.，18798-807；Rabin，H.等，1976，《狒狒(Papio hamadryas)淋巴瘤的病毒學(xué)研究泡沫病毒的分離和表征》，(Virologicalstudies of baboon(Papio hamadryas)lymphomaisolation and characterization offoamyviruses)，J Med Primatol，513-22〕衍生得到穩(wěn)定的獼猴B-類淋巴母細(xì)胞系(B-LCL)。使自體B-LCL感染上編碼HIV-1/SF2 gag-pol(rVVgag-pol)或HIV-1.SF162 gp160env(rVVgp160env)重組牛痘病毒(rVV)(PFU細(xì)胞比為10)，該病毒同時還標(biāo)記了Na[51Cr]2O4(NEN，Boston，MA)，每1×106B-LCL為25微居里。在37℃過夜培育后，洗出rVV-感染的51Cr標(biāo)記的B-LCL，然后加到含有3倍逐次稀釋的培育的PBMC的孔中(每個圓底孔2500個)，做2組平行實(shí)驗(yàn)。然后將105未標(biāo)記、未感染的B-LCL加到各孔中，以抑制非特異性細(xì)胞裂解。在37℃培育4小時后，收集50微升的培養(yǎng)物上清液，然后將其加到LumaPlates(Packard，Meriden，CT)中，使用Microbeta 1450液體閃爍計(jì)數(shù)器(Wallac，Gaithersburg，MD)計(jì)算其放射性。采用下式將從裂解靶標(biāo)中釋放出來的51Cr歸一化特異性51Cr釋放％＝100％×(平均試驗(yàn)cpm-SR)/(MR-SR)，其中SR＝從單獨(dú)的靶標(biāo)得到的平均cpm，MR＝從暴露于Triton X-100的靶標(biāo)得到的平均cpm。如果在gag肽混合物刺激的PBMC的兩個連續(xù)的稀釋度中，rVVgag-pol感染的B-LCL的裂解超過rVVgp160env感染的B-LCL的裂解至少10％，并且如果在培育的PBMC的兩個連續(xù)稀釋度中，由gag肽混合物刺激的PBMC引起的rVVgag-pol感染的B-LCL的裂解超過由env肽混合物刺激的B-LCL引起的rVVgag-pol感染的B-LCL的裂解至少10％，則可以確定該動物具有陽性的p55gag特異性應(yīng)答。如果在env肽混合物刺激的PBMC的兩個連續(xù)的稀釋度中，rVVgp160env感染的B-LCL的裂解超過rVVgag-pol感染的B-LCL的裂解至少10％，以及如果在培育的PBMC的兩個連續(xù)的稀釋度中，由env肽混合物刺激的PBMC引起的rVVgp160env感染的B-LCL的裂解超過gag肽混合物刺激的B-LCL引起的rVVgp160env感染的B-LCL的裂解至少10％，則可以確定該動物具有陽性的gp160特異性應(yīng)答。
表14gag-特異性CTL疫苗引起的p55gag特異性CTL的誘導(dǎo)每組(n＝5)陽性動物的數(shù)量

表15env-特異性CTL疫苗引起的gp140env特異性CTL的誘導(dǎo)每組(n＝5)陽性動物的數(shù)量

實(shí)施例18淋巴增殖檢測(LPA)在重組p55gag蛋白或合成的env肽的混合物的存在或缺乏的條件下以每孔2×105個細(xì)胞的數(shù)量培育獼猴的PBMC。每種培育條件進(jìn)行6組平行試驗(yàn)。培育4天后，以1微居里/孔的[3H]TdR過夜向培養(yǎng)物施加脈沖。采用液體閃爍計(jì)數(shù)(Betaplate，Wallac，Gaithersburg，MD)測定摻入細(xì)胞中的[3H]TdR。以SI＝平均cpm(gag或env刺激)/平均cpm(未刺激)計(jì)算刺激指數(shù)(SI)。
表16獼猴抗gag淋巴增殖刺激指數(shù)

(1) 相對于在第0、4和14周進(jìn)行的質(zhì)粒免疫(2) 各組的幾何平均值(3) 由對數(shù)轉(zhuǎn)化滴度計(jì)算得到的組算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，LL＝算術(shù)平均值-標(biāo)準(zhǔn)誤差的反對數(shù)；UL＝算術(shù)平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤差的反對數(shù)
(4) 在第29周給予吸附到陰離子性PLG微粒體上的重組p55gag蛋白表17獼猴抗env淋巴增殖刺激指數(shù)

(1)相對于在第0、4和14周進(jìn)行的質(zhì)粒免疫
(2) 各組的幾何平均值(3) 由對數(shù)轉(zhuǎn)化滴度計(jì)算得到的組算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，LL＝算術(shù)平均值-標(biāo)準(zhǔn)誤差的反對數(shù)；UL＝算術(shù)平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤差的反對數(shù)(4) 在第38周給予重組寡聚gp140env(ΔV2)蛋白/MF59佐劑(5) 空白值非檢測實(shí)施例19胞內(nèi)細(xì)胞因子免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)在布雷菲德菌素A(Pharmingen，San Diego，CA)和抗-CD28單克隆抗體(mAb)(Pharmingen)的存在下，以及在gag肽或env肽混合物的存在或缺乏的情況下，過夜培育獼猴PBMC(1×106個細(xì)胞/孔)。每種刺激條件下進(jìn)行兩組平行試驗(yàn)。第二天，用偶聯(lián)了多甲藻素葉綠素蛋白(PerCP)的抗-CD8 mAb和偶聯(lián)了別藻藍(lán)蛋白(APC)的抗-CD4 mAb(Becton Dickinson，San Jose，CA)給這些細(xì)胞染色，然后進(jìn)行固定和透化處理(Cytofix/Cytoperm，Pharmingen)，再用偶聯(lián)了異硫氰酸熒光素(FITC)的抗腫瘤壞死因子-α(TNF-α)mAb和偶聯(lián)了藻紅蛋白(PE)的抗-干擾素-γ(IFN-γ)mAb(Pharmingen)染色。使用FACSCaliburTM流式細(xì)胞器和CellQuestTM軟件(Becton Dickinson)分析染色了的細(xì)胞樣品。將對IFN-γ和TNF-α染色成陽性的細(xì)胞分?jǐn)?shù)計(jì)為CD4+8-和CD8+4-T細(xì)胞亞類。用gag刺激的細(xì)胞或env刺激的細(xì)胞中得到的平均IFN-γ和TNF-α分?jǐn)?shù)減去未刺激細(xì)胞中得到的平均IFN-γ/TNF-α分?jǐn)?shù)，計(jì)算得到gag特異性細(xì)胞或env特異性細(xì)胞的數(shù)量。
對于給定的T細(xì)胞亞類(CD4+8-或CD8+4-)以及抗原(gag或env)，當(dāng)抗原特異性細(xì)胞的分?jǐn)?shù)至少為0.1％時，可認(rèn)為所發(fā)生的響應(yīng)為陽性的。
表18gag特異性IFNγ+/TNFα+CD4+T細(xì)胞疫苗引起的p55gag特異性IFNγ+/TNFα+CD4+T細(xì)胞的誘導(dǎo)每組陽性動物(n＝5)的數(shù)量*

*陽性頻率≥0.1％表19env特異性IFNγ+/TNFα+CD4+T細(xì)胞疫苗引起的gp140env特異性IFNγ+/TNFα+CD4+T細(xì)胞的誘導(dǎo)每組陽性動物(n＝5)的數(shù)量*

*陽性頻率≥0.1％
表20gag特異性IFNγ+/TNFα+CD8+T細(xì)胞疫苗引起的p55gag特異性IFNγ+/TNFα+CD8+T細(xì)胞的誘導(dǎo)每組陽性動物(n＝5)的數(shù)量*

*陽性頻率≥0.1％表21env特異性IFNγ+/TNFα+CD8+T細(xì)胞疫苗引起的gp140env特異性IFNγ+/TNFα+CD8+T細(xì)胞的誘導(dǎo)每組陽性動物(n＝5)的數(shù)量*

*陽性頻率≥0.1％雖然已詳細(xì)地描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但是應(yīng)理解，在不偏離由附帶的權(quán)利要求限定的本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可對本發(fā)明作出顯而易見的改動。
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權(quán)利要求
1.一種在宿主動物中引起免疫反應(yīng)的方法，其特征在于，該方法包括向所述動物給予其量有效引起免疫學(xué)反應(yīng)的載體構(gòu)建物，該構(gòu)建物含有編碼第一抗原的異源核酸序列，其中所述載體構(gòu)建物吸附在微粒體上，所述微粒體含有(i)選自聚(α-羥基酸)、聚羥基丁酸、聚己內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酐和聚氰基丙烯酸酯的聚合物，和(ii)去污劑；和接著向所述動物給予第二抗原，強(qiáng)化免疫學(xué)反應(yīng)，其中所述第一抗原和第二抗原可以相同或不同。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一抗原和第二抗原相同。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述載體構(gòu)建物選自質(zhì)粒DNA和RNA載體構(gòu)建物。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)粒DNA是ELVIS載體。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述ELVIS載體含有一補(bǔ)充RNA載體構(gòu)建物的cDNA，該RNA載體構(gòu)建物由選自α病毒、小RNA病毒、披膜病毒、黃病毒、冠狀病毒、副粘病毒和黃熱病毒的病毒衍生得到。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述α病毒選自新德比斯病毒、塞姆利基森林病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒或羅斯河病毒。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)粒DNA含有CMV啟動子/增強(qiáng)子。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一抗原和第二抗原選自HIV抗原、C型肝炎病毒抗原和A型流感病毒抗原。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一抗原和第二抗原選自HIV抗原gp120、gp140、gp160、p24gag和p55gag。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一抗原和第二抗原是HIVp55gag。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一抗原和第二抗原是HIVgp140。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二抗原吸附在含有以下物質(zhì)的微粒體上(i)選自聚(α-羥基酸)、聚羥基丁酸、聚己內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酐和聚氰基丙烯酸酯的聚合物，和(ii)去污劑。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二抗原與佐劑一同給予。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述佐劑是MF59。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚合物是選自聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)和聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)的聚(α-羥基酸)，其中所述去污劑含有選自CTAB、氯化苯甲烷銨、DDA和DOTAP的陽離子去污劑。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在給予所述第二抗原之前，給予所述載體構(gòu)建物兩次或多次。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，也給予所述第二抗原兩次或多次。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述載體構(gòu)建物在以下時間給予(a)在初始給藥時；(b)在初始給藥后1-8周的時間范圍內(nèi)給予；(c)在初始給藥后4-32周的時間范圍內(nèi)給予；所述第二抗原在以下時間給予(a)在初始給予后8-50周的時間范圍內(nèi)給予；(b)在初始給藥后8-100周的時間范圍內(nèi)給予。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述動物是選自獼猴和人的哺乳動物。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述載體構(gòu)建物和第二抗原以皮下、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)的方式給予。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述載體構(gòu)建物和第二抗原以肌肉內(nèi)的方式給予。
22.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述載體構(gòu)建物與佐劑一同給予。
23.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫反應(yīng)是Th1免疫反應(yīng)。
24.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫反應(yīng)是CTL免疫反應(yīng)。
25.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫反應(yīng)是針對病毒、細(xì)菌或寄生蟲感染而引起。
26.一種微粒體，該微粒體具有吸附表面，在該表面上已經(jīng)吸附了第二生物學(xué)活性大分子，其特征在于，該微粒體包括選自(a)聚合物微粒體和(b)亞微粒體乳劑的微粒體，其中，該聚合物微粒體含有(i)選自聚(α-羥基酸)、聚羥基丁酸、聚己內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酐和聚氰基丙烯酸酯的聚合物，和去污劑；所述亞微粒體乳劑含有(i)可代謝的油，和(ii)一種或多種乳化劑；和第一生物學(xué)活性大分子，其中所述第一生物學(xué)活性大分子是一種核酸分子，該核酸分子含有至少一種選自ELIVS載體和RNA載體構(gòu)建物的載體構(gòu)建物。
27.如權(quán)利要求26所述的微粒體，其特征在于，所述微粒體為所述亞微粒體乳劑。
28.如權(quán)利要求26所述的微粒體，其特征在于，所述微粒體為所述聚合物微粒體。
29.如權(quán)利要求28所述的微粒體，其特征在于，所述聚合物微粒體是選自聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)和聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)的聚(α-羥基酸)。
30.如權(quán)利要求28所述的微粒體，其特征在于，所述聚合物是聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)。
31.如權(quán)利要求28所述的微粒體，其特征在于，所述微粒體還含有第二生物學(xué)活性大分子，這種大分子被捕獲在所述微粒體中，其中該大分子選自多核苷酸、多核苷、藥物、多肽、激素、酶、轉(zhuǎn)錄介體或翻譯介體、代謝途徑中間物、免疫調(diào)節(jié)子、抗原以及佐劑。
32.如權(quán)利要求28所述的微粒體，其特征在于，所述載體構(gòu)建物是ELVIS載體。
33.如權(quán)利要求28所述的微粒體，其特征在于，所述載體構(gòu)建物是ELVIS載體，它含有一補(bǔ)充RNA載體構(gòu)建物的cDNA，該RNA載體構(gòu)建物由選自α病毒、小RNA病毒、披膜病毒、黃病毒、冠狀病毒、副粘病毒和黃熱病毒的病毒衍生得到，且所述RNA載體構(gòu)建物還含有選擇的異源核苷酸序列。
34.如權(quán)利要求33所述的微粒體，其特征在于，所述ELVIS載體由選自新德比斯病毒、塞姆利基森林病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒或羅斯河病毒的α病毒衍生獲得。
35.如權(quán)利要求28所述的微粒體，其特征在于，所述載體構(gòu)建物是RNA載體構(gòu)建物，它由選自α病毒、小RNA病毒、披膜病毒、黃病毒、冠狀病毒、副粘病毒和黃熱病毒的病毒衍生得到。
36.如權(quán)利要求35所述的微粒體，其特征在于，所述RNA載體構(gòu)建物由選自新德比斯病毒、塞姆利基森林病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒或羅斯河病毒的α病毒衍生獲得。
37.如權(quán)利要求32所述的微粒體，其特征在于，所述載體構(gòu)建物含有異源核酸序列，該序列編碼選自以下的成員藥物、多肽、激素、酶、轉(zhuǎn)錄介體或翻譯介體、代謝途徑的中間物、免疫調(diào)節(jié)子、抗原和佐劑。
38.如權(quán)利要求37所述的微粒體，其特征在于，所述異源核酸序列編碼抗原。
39.如權(quán)利要求38所述的微粒體，其特征在于，所述抗原選自HIV gp120、gp140、HIV p24gag和HIV p55gag和A型流感血凝素抗原。
40.如權(quán)利要求32所述的微粒體，其特征在于，所述載體構(gòu)建物選自ELVIS載體pSINCP-gp 140和pSINCP-p55gag。
41.如權(quán)利要求28所述的微粒體，其特征在于，所述微粒體還含有至少一種吸附于其表面上的第二生物學(xué)活性大分子，其中所述第二生物學(xué)活性大分子是選自多肽、多核苷酸、多核苷、抗原、藥物、激素、酶、轉(zhuǎn)錄介體或翻譯介體、代謝途徑的中間物、免疫調(diào)節(jié)子和佐劑的至少一種。
42.如權(quán)利要求41所述的微粒體，其特征在于，所述第二生物學(xué)活性大分子是抗原。
43.如權(quán)利要求42所述的微粒體，其特征在于，所述第二生物學(xué)活性大分子是選自HIV gp120、gp140、HIV p24gag和HIV p55gag和A型流感血凝素抗原的抗原。
44.如權(quán)利要求41所述的微粒體，其特征在于，所述第二生物學(xué)活性大分子是編碼HIV gp140的多核苷酸。
45.如權(quán)利要求41所述的微粒體，其特征在于，所述第二生物學(xué)活性大分子是佐劑。
46.如權(quán)利要求45所述的微粒體，其特征在于，所述佐劑是鋁鹽。
47.一種微粒體組合物，其特征在于，該組合物含有權(quán)利要求26所述的微粒體和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
48.如權(quán)利要求47所述的微粒體組合物，其特征在于，所述組合物還含有佐劑。
49.如權(quán)利要求48所述的微粒體組合物，其特征在于，所述佐劑選自由CpG寡核苷酸組成的成員。
50.如權(quán)利要求48所述的微粒體組合物，其特征在于，所述佐劑是鋁鹽，該鋁鹽為磷酸鋁。
51.一種生產(chǎn)具有吸附表面的微粒體的方法，該微粒體的表面上已經(jīng)吸附了能表達(dá)選擇的核酸序列的載體構(gòu)建物，其特征在于，所述方法包括(a)將聚合物溶液和去污劑的混合物乳化，形成乳劑；其中，所述聚合物溶液含有選自聚(α-羥基酸)、聚羥基丁酸、聚己內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酐和聚氰基丙烯酸酯的聚合物，有機(jī)溶劑中該聚合物的濃度約為1-30％；混合物中所述去污劑與所述聚合物的重量比約為0.00001∶1到0.5∶1；(b)從所述乳劑中除去有機(jī)溶劑，形成所述微粒體；(c)將所述載體構(gòu)建物吸附到所述微粒體的表面，其中所述載體構(gòu)建物選自ELVIS載體和RNA載體構(gòu)建物。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述載體構(gòu)建物是ELVIS載體或RNA載體構(gòu)建物，含有編碼藥物、多肽、激素、酶、轉(zhuǎn)錄介體或翻譯介體、代謝途徑的中間物、免疫調(diào)節(jié)子、抗原和佐劑的異源核酸序列。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述異源核酸序列編碼選自HIV gp120、HIV gp140、HIV p24gag和HIV p55gag和A型流感血凝素抗原的抗原。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，所述抗原是HIV gp140。
55.一種微粒體，其特征在于，該微粒體采用權(quán)利要求51所述的方法制得。
56.一種微粒體組合物，其特征在于，所述組合物含有權(quán)利要求55所述的微粒體和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
57.一種誘導(dǎo)宿主動物中的免疫反應(yīng)的方法，其特征在于，所述方法包括向所述動物給予權(quán)利要求47所述的微粒體組合物。
58.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物是人。
59.一種使宿主動物針對病毒、細(xì)菌或寄生蟲感染產(chǎn)生免疫的方法，其特征在于，所述方法可向所述動物給予權(quán)利要求47中所述的微粒體組合物。
60.如權(quán)利要求59所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物是人。
61.一種在宿主動物中誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1免疫反應(yīng)的方法，其特征在于，所述方法包括向所述動物給予權(quán)利要求47所述的微粒體組合物。
62.如權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物是人。
63.一種在宿主動物中誘導(dǎo)產(chǎn)生CTL免疫反應(yīng)的方法，其特征在于，所述方法包括向所述動物給予權(quán)利要求47所述的微粒體組合物。
64.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物是人。
65.一種向宿主動物傳送治療有效量的大分子的方法，其特征在于，所述方法包括向脊椎動物對象給予權(quán)利要求47所述的微粒體組合物。
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物是人。
67.一種治療受到病毒、細(xì)菌或寄生蟲感染的宿主動物的方法，其特征在于，所述方法包括向所述動物給予其量有效減少該動物感染水平的權(quán)利要求47所述的微粒體組合物。
68.如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物是人。
69.權(quán)利要求47所述的微粒體組合物的用途，其特征在于，用于治療一種疾病。
70.權(quán)利要求47所述的微粒體組合物的用途，其特征在于，用作疫苗。
71.權(quán)利要求47所述的微粒體組合物的用途，其特征在于，用于引起免疫反應(yīng)。
72.如權(quán)利要求39所述的微粒體，其特征在于，所述異源核酸序列編碼HIVgag多肽，它含有與選自下列序列至少有90％同一性的序列SEQ ID NO63的第844-903個核苷酸、SEQ ID NO64的第841-900個核苷酸、SEQ ID NO65的第1513-2547個核苷酸、SEQ ID NO66的第1210-1353個核苷酸、SEQ ID NO67的第1213-1353個核苷酸以及SEQ ID NO68的第82-1512個核苷酸。
73.如權(quán)利要求39所述的微粒體，其特征在于，所述異源核酸序列編碼HIV包膜多肽，它含有與選自下列序列至少有90％同一性的序列SEQ ID NO63的第844-903個核苷酸、SEQ ID NO64的第841-900個核苷酸、SEQ ID NO65的第1513-2547個核苷酸、SEQ ID NO66的第1210-1353個核苷酸、SEQ ID NO67的第1213-1353個核苷酸以及SEQ ID NO68的第82-1512個核苷酸。
74.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，所述異源核酸序列編碼HIV gag多肽，它含有與選自下列序列至少有90％同一性的序列SEQ ID NO63的第844-903個核苷酸、SEQ ID NO64的第841-900個核苷酸、SEQ ID NO65的第1513-2547個核苷酸、SEQ ID NO66的第1210-1353個核苷酸、SEQ ID NO67的第1213-1353個核苷酸以及SEQ ID NO68的第82-1512個核苷酸。
75.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，所述異源核酸序列編碼HIV包膜多肽，它含有與選自下列序列至少有90％同一性的序列SEQ ID NO63的第844-903個核苷酸、SEQ ID NO64的第841-900個核苷酸、SEQ ID NO65的第1513-2547個核苷酸、SEQ ID NO66的第1210-1353個核苷酸、SEQ ID NO67的第1213-1353個核苷酸以及SEQ ID NO68的第82-1512個核苷酸。
76.如權(quán)利要求27所述的微粒體，其特征在于，(a)所述油是萜類化合物，(b)所述一種或多種乳化劑含有一種或多種非離子型去污劑和一種或多種陽離子型去污劑。
77.如權(quán)利要求76所述的微粒體，其特征在于，所述油是角鯊烯，所述一種或多種乳化劑含有聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯、脫水山梨糖醇脂肪酸酯和DOTAP。
全文摘要
公開了具有吸附表面的微粒體、制備這種微粒體的方法以及它們的用途。所述微粒體含有一種聚合物，如聚(α－羥基酸)、聚羥基丁酸、聚己內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酐等等，是使用陽離子、陰離子或非離子型去污劑形成。還提供了成油滴乳劑的亞微粒體乳劑形式的微粒體，這種微粒體含有可代謝的油和乳化劑。所述微粒體的表面有效地吸附多肽(如抗原)和核酸(如ELVIS載體和其它載體構(gòu)建物)，含有編碼生物學(xué)活性大分子(如多肽、抗原)的異源核苷酸序列和佐劑。還提供了刺激免疫反應(yīng)的方法、使宿主動物針對病毒、細(xì)菌或寄生蟲感染產(chǎn)生免疫的方法，以及這些微粒體組合物在疫苗中的用途。
文檔編號A61P31/04GK1468089SQ01816459
公開日2004年1月14日 申請日期2001年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月28日
發(fā)明者D·奧黑根, G·奧滕, J·J·唐納利, J·M·保羅, S·巴尼特, M·辛格, J·厄爾默, T·W·小迪班斯基, D 奧黑根, 保羅, 唐納利, 小迪班斯基, 崽 申請人:希龍公司