一種長爪沙鼠的肝星狀細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及肝星狀細(xì)胞的分離培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種長爪沙鼠的肝星狀細(xì)胞的分禺和培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肝星狀細(xì)胞(hepaticstellate cel I，HSC)，又稱儲脂細(xì)胞(Fat-store cell，F(xiàn)SC)、間質(zhì)細(xì)胞，主要分布于肝細(xì)胞與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞之間的竇周隙內(nèi)(Disse間隙)ASC在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中具有核心作用，是促進肝纖維化發(fā)展的主要因素。靜息狀態(tài)的HSC主要參與維生素A的代謝調(diào)節(jié)，當(dāng)肝臟受到化學(xué)、物理及生物因素刺激而發(fā)生損傷后，HSC發(fā)生增殖并被活化，合成以膠原蛋白為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)及各類細(xì)胞因子如MMPs、TNF-a等，參與受損肝組織的修復(fù)。刺激持續(xù)發(fā)生時，HSC大量激活，引發(fā)ECM的合成與降解失衡，進而導(dǎo)致肝臟內(nèi)結(jié)締組織異常沉積，發(fā)生肝纖維化。
[0003]肝星狀細(xì)胞是肝纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，在肝竇內(nèi)，還有肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、kupffer細(xì)胞等。肝星狀細(xì)胞占整個肝臟細(xì)胞的8.00?13.00%左右，被認(rèn)為是肝臟中主要的貯存和代謝維生素A的細(xì)胞。肝星狀細(xì)胞激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，各種致纖維化因素均把HSC(肝星狀細(xì)胞)作為最終靶細(xì)胞，正常情況下肝星狀細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)肝臟受到炎癥或機械刺激等損傷時，肝星狀細(xì)胞被激活，其表型由靜止型轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ钚?。激活的肝星狀?xì)胞一方面通過增生和分泌細(xì)胞外基質(zhì)參與肝纖維化的形成和肝內(nèi)結(jié)構(gòu)的重建，另一方面通過細(xì)胞收縮使肝竇內(nèi)壓升高。
[0004]國內(nèi)一些作者采用原位灌流法分離HSC，因肝臟在體灌注，灌注液不易回收，酶的用量較大，且難以掌握酶灌流時的溫度，肝消化后摘取困難。目前針對大、小鼠分離培養(yǎng)HSC的方法已經(jīng)較為成熟，但是國內(nèi)尚無關(guān)于長爪沙鼠HSC的研究，而國外也尚未建立完善的培養(yǎng)體系，且長爪沙鼠HSC的研究不同于大、小鼠，彼此不能相互借鑒。
[0005]申請公布號為CN103805553A(申請?zhí)枮?01210455728.4)的中國發(fā)明專利申請公開了一種小鼠肝星狀細(xì)胞的分離方法，通過插管固定、灌注消化、細(xì)胞分散、小鼠肝星狀細(xì)胞分離等步驟完成對小鼠肝星狀細(xì)胞的分離。用上述方法得到了需要的小鼠肝星狀細(xì)胞，質(zhì)量很好，比傳統(tǒng)大鼠的分離質(zhì)量好很多，而且在整個過程比較便捷，在普通實驗室就能完成，很穩(wěn)定，由于采用了小鼠，不用一些特殊的設(shè)備，降低了這種分離方法的成本，在得到高質(zhì)量的小鼠肝星狀細(xì)胞，為進一步深入研究小鼠肝星狀細(xì)胞的生物學(xué)行為創(chuàng)造了條件。該技術(shù)方案采用原位灌流法分離HSC，因肝臟在體灌注，灌注液不易回收，酶的用量較大，且難以掌握酶灌流時的溫度，肝消化后摘取困難。同時該技術(shù)方案不適合用于長爪沙鼠HSC。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種長爪沙鼠的肝星狀細(xì)胞的分離方法，能夠提高肝星狀細(xì)胞的產(chǎn)量和活率，可以保證HSCs純度。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0008]一種長爪沙鼠的肝星狀細(xì)胞的分離方法，包括:
[0009]I)將長爪沙鼠的肝臟，先移入聯(lián)合酶液中灌注消化，然后去除肝包膜和Glisson鞘，粉碎肝臟呈糊狀，再移入混合酶液，攪拌消化，得到攪拌消化后的產(chǎn)物；
[0010]2)向攪拌消化后的產(chǎn)物中加入第一 Hank ’ s液，過濾，得肝組織;然后向肝組織中加第二Hank’ s液，初步離心，得沉淀；用第三Hank’ s液重懸沉淀，再向其加入Nycodenz液混勾，再次離心，得渾濁帶，渾濁帶即為分離得到的肝星狀細(xì)胞。
[0011]本發(fā)明的分離方法，成功地分離了長爪沙鼠的肝星狀細(xì)胞，簡便可行，并為進一步研究HSC與肝纖維化的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。同時，本發(fā)明方法能夠提高肝星狀細(xì)胞的產(chǎn)量和活率，可以保證HSCs純度，為進一步研究肝星狀細(xì)胞在肝損傷后細(xì)胞基質(zhì)的沉積及纖維化的形成奠定了基礎(chǔ)。
[0012]以下作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案:
[0013]步驟I)中，所述的長爪沙鼠的肝臟的獲得包括:對長爪沙鼠進行開腹，游離腹主動脈，向游離腹主動脈中灌注預(yù)灌注液，取下肝臟，即得到長爪沙鼠的肝臟。
[0014]所述的長爪沙鼠為生前體重400g左右(400g±50g)、營養(yǎng)狀況良好的長爪沙鼠；體重較輕者，可預(yù)先用維生素A處理，即通過維生素A灌胃，確保肝星狀細(xì)胞具有一定的浮力。
[0015]所述的預(yù)灌注液為4°C、含肝素25U/ml的Hank’s液。
[0016]所述預(yù)灌注液的用量為50ml/只。
[0017]所述的聯(lián)合酶液，由以下體積百分?jǐn)?shù)的組分組成:0.02%?0.08%的鏈酶蛋白酶和0.05%?0.2%的膠原酶以及余量的Hank’s液，進一步優(yōu)選，由以下體積百分?jǐn)?shù)的組分組成:0.05 %的鏈酶蛋白酶、0.1 %的膠原酶以及余量的Hank’ s液。
[0018]所述的灌注消化的條件為:35°C?39°C灌注消化5?20min;進一步優(yōu)選，所述的灌注消化的條件為:37°C灌注消化lOmin。
[0019]所述的混合酶液，由以下體積百分?jǐn)?shù)的組分組成:0.02%?0.08%的鏈酶蛋白酶、
0.05%?0.2%的膠原酶、0.0005%?0.003%的DNaseI以及余量的Hank’s液。進一步優(yōu)選為，由以下體積百分?jǐn)?shù)的組分組成:0.05%的鏈酶蛋白酶、0.1 %的膠原酶、0.001 %的DNaseI以及余量的Hank’s液。
[0020]所述的攪拌消化的條件為:35 °C?3 9 °C攪拌消化1?2 O m i η;進一步優(yōu)選，所述的攪拌消化的條件為:3 7 °C攪拌消化1?15m i η。
[0021 ] 步驟2)中，第一Hank’s液、第二Hank’s液和第三Hank’s液均為Hank’s液，可采用現(xiàn)有技術(shù)。
[0022]所述的過濾采用80目?120目的鋼絲篩，進一步優(yōu)選，所述的過濾采用100目鋼絲篩。
[0023]所述的初步離心的條件為:300g?400g、5min?20min，進一步優(yōu)選，所述的初步離心的條件為:350g、10min。
[0024]所述的再次離心的條件為:2°C?6°C、1200g?1600g、13min?23min。進一步優(yōu)選，所述的再次離心的條件為:4°C、1400g、18min。
[0025]所述的Nycodenz液可選用20%Nycodenz液，由體積百分比20%的Nycodenz分離液和體積百分比80%的Hank’s液，即20%Nycodenz液由體積比20%:80%的Nycodenz分離液和Hank’s液制成。
[0026]本發(fā)明還提供了一種長爪沙鼠的肝星狀細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。
[0027]—種長爪沙鼠的肝星狀細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，包括:所述的長爪沙鼠的肝星狀細(xì)胞的分尚方法以及培養(yǎng)；
[0028]所述的培養(yǎng)包括:取分離得到的肝星狀細(xì)胞，以IX 15-1 X 16個/ml接種密度進行原代培養(yǎng);當(dāng)細(xì)胞融合度為80 %?90 %時，進行傳代培養(yǎng)。
[0029]優(yōu)選地，所述的原代培養(yǎng)的培養(yǎng)基由體積百分?jǐn)?shù)5%?15 %的胎牛血清和85 %?95 %的DMEM培養(yǎng)液組成;所述的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的條件為:在35 °C?39 °C、由體積百分?jǐn)?shù)2 %?8 % 0)2和92 %?98 %空氣組成的氣氛中培養(yǎng)。進一步優(yōu)選，所述的原代培養(yǎng)的培養(yǎng)基由體積百分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清和90%的DMEM培養(yǎng)液組成;所述的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的條件為:在37 0C、由體積百分?jǐn)?shù)5 % 0)2和95 %空氣組成的氣氛中培養(yǎng)。空氣可優(yōu)選為潮濕空氣，濕度50%?90 %。
[0030]本法采用離體膠原酶、鏈霉蛋白酶灌注法，每只雄性長爪沙鼠肝臟約獲得星狀細(xì)胞 1.5X107 個。
[0031]為提高細(xì)胞得率主要從以下方面進行改進:
[0032]1、一般選用體重400g左右、營養(yǎng)狀況良好的雄性長爪沙鼠較為合適。體重較輕者，可預(yù)先用維生素A處理雄性長爪沙鼠，確保肝星狀細(xì)胞具有一定的浮力，在密度梯度離心時較好地與其它細(xì)胞分離。
[0033]2、用4°C的預(yù)灌注液腹主動脈灌注，灌注液可以通過門靜脈與肝動脈進入肝臟，肝內(nèi)血細(xì)胞沖冼得相對較為干凈，低溫灌注可以減少肝熱缺血對肝臟的損傷，取下肝臟后行門靜脈插管固定再行灌注與肝表面清洗，盡可能的減少血細(xì)胞對消化酶的活性產(chǎn)生的不良影響。
[0034]3、肝臟消化是否適度，是影響細(xì)胞得