[0076] 5、提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，用Pst I和EcoR I雙酶切，酶切產(chǎn)物大小約為4. 4化和 2. 6化的質(zhì)粒為陽(yáng)性質(zhì)粒，將此重組表達(dá)載體命名為P19-PCAB，如圖1所示。
[0077] 將得到的重組表達(dá)載體P19-PCAB進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明；在PMD19-T載體的Pst I和EcoR I酶切位點(diǎn)間插入了如序列表中序列1所示的核巧酸分子，表明載體正確。
[0078] 實(shí)施例2、重組表達(dá)載體pMCS-pctAAK的構(gòu)建
[0079] 1、人工合成序列表中序列2所示的DNA序列，其中第13-55位核巧酸為啟動(dòng)子 序列；第72-1625位核巧酸為pet基因序列；第1655-2593位核巧酸為曲rA基因序列；第 2623-3927位核巧酸為aceA基因序列；第4110-5826位核巧酸為aceK基因序列；
[0080] 2、用EcoR I和化0 I雙酶切步驟1中合成的DNA序列，回收大小約為5. 8化的基 因片段；
[0081] 3、用EcoR I和化〇 I雙酶切載體地BR1MCS-2 (公眾可根據(jù)NCBI GenBank號(hào)為 U23751的序列自己合成），回收大小約為5. 1化的載體片段；
[0082] 4、將步驟2得到的基因片段與步驟3得到的載體片段連接（Takara的solution I連接試劑盒），得到連接產(chǎn)物通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到E. coli JM109中，并涂布于 LB-Kan固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)16h，得到轉(zhuǎn)化子。
[0083] 5、提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，用Eco I和化0 I雙酶切，酶切產(chǎn)物大小約為5. 8化和5. 1化 的質(zhì)粒為陽(yáng)性質(zhì)粒，將此重組表達(dá)載體命名為pMCS-pctAAK，如圖2所示。
[0084] 將得到的重組表達(dá)載體pMCS-pctAAK進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明；在地BR1MCS-2載 體的EcoR I和化0 I酶切位點(diǎn)間插入了如序列表中序列2所示的核巧酸分子，表明載體正 確。
[00財(cái)實(shí)施例3、大腸桿菌JM1091dM的構(gòu)建
[0086] 1、合成 1 化A 基因敲除所用的引物 1 化AF ; 5 ' -CTCCCCTGGAATGCAGGGGAGCGGCAAGATT AAACCAGTTCGTTCGGGCAATTCCGGGGATCCGTCGACC-3 ' 和 1 化AR ; 5 ' -TATTTTTAGTAGCTTAAATGTGAT TCAACATCACTGGAGAAAGTCTTATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3'，W質(zhì)粒地D13 為模板，采用 1 化AF 和1化AR引物PCR擴(kuò)增得到1. 5化左右的DNA片段，該片段的序列如SEQ ID No. 3所示，瓊 脂糖凝膠電泳對(duì)得到的DNA片段進(jìn)行純化；
[0087] 2、用LB-Amp液體培養(yǎng)基中在3(TC的條件下培養(yǎng)含有PKD46的大腸桿菌，提取質(zhì)粒 PKD46,利用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化至受體菌株E. coli JM109中，并涂布于LB-Amp固體培養(yǎng)基， 3(TC培養(yǎng)2地，得到轉(zhuǎn)化子，獲得E. coli JM109(p邸46);
[0088] 3、將E. coli JM109(p邸46)接種到LB-Amp液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)地，加入阿拉 伯糖至終濃度20旨/1，繼續(xù)培養(yǎng)1.化，接下來(lái)制備E. coli JM109(pKD46)的感受態(tài)細(xì)胞，將 步驟1中獲得的DNA片段轉(zhuǎn)入E. coli JM109 (PKD46)的感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于LB-Kan固 體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h，得到轉(zhuǎn)化子；
[0089] 4、利用菌落PCR的方法，W 1化AF和1化AR為引物，將PCR產(chǎn)物純化之后測(cè)序，篩選 正確的1化A基因已經(jīng)被替換為Kan抗性基因的克隆，得到E. coli JM1091化A-K(p邸46);
[0090] 5、將E. coli JM1091化A-K(p邸46)接種于LB液體培養(yǎng)基中，42°C培養(yǎng)傳代Η次， 除去地D46質(zhì)粒，得到Ε. coli JM1091化Α-Κ ;
[0091] 所述E. coli JM1091化A-K是1化A基因被Kan基因替換了的E. coli JM109 ;
[0092] 6、將E. coli JM1091化A-K接種到LB-Kan液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2地，轉(zhuǎn)接到 LB-Kan液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)化，制備E. coli JM1091化A-K感受態(tài)細(xì)胞；
[0093] 7、LB-Amp液體培養(yǎng)基中3(TC培養(yǎng)含有PCP20的大腸桿菌，提取質(zhì)粒PCP20,利用 電轉(zhuǎn)化的方法將PCP20轉(zhuǎn)化到E. coli JM1091dM-K感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于LB-Amp固體 培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h，得到轉(zhuǎn)化子；
[0094] 8、利用菌落PCR的方法，W 1化AF和1化AR為引物，將PCR產(chǎn)物純化之后測(cè)序，篩 選Kan基因缺失的克隆，最終獲得IdM基因缺失的突變體E. coli JM1091dM。
[0095] 實(shí)施例 4、重組菌 E. coli JM109 (pl9-PCAB+pMCS-pctAAK)和重組菌 E. coli JM1091 化A(pl9-PCAB+pMCS-pctAAK)的構(gòu)建
[0096] 1、將實(shí)施例1得到的重組質(zhì)粒P19-PCAB和實(shí)施例2得到的重組質(zhì)粒pMCS-pctAAK 通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化到E. coli JM109中，并涂布于LB-Amp-Kan固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng) 2地，得到為重組菌 E. coli JM109 (pl9-PCAB+pMCS-pctAAK)。
[0097] 2、將實(shí)施例1得到的重組質(zhì)粒P19-PCAB和實(shí)施例2得到的重組質(zhì)粒pMCS-pctAAK 通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化到E. coli JM1091dM中，并涂布于LB-Amp-Kan固體培養(yǎng)基，37°C培 養(yǎng)24h，得到重組菌E.coliJM1091化A(pl9-PCAB+pMCS-pctAAK)。
[009引 實(shí)施例5、重組菌E. coli JM109(pl9-PCAB+pMCS-pctAAK)在生產(chǎn)己醇酸基聚合物 中的應(yīng)用
[009引 1、發(fā)酵培養(yǎng)
[0100] (1)種子液的獲得：將重組菌 E. coli JM109(pl9-PCAB+pMCS-pctAAK)在 LB-Amp-Kan液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h(37°C搖床，200巧m)作為種子液；
[0101] (2)發(fā)酵；按體積比4 %的接種量將種子液接種到MSG-Amp-Kan液體培養(yǎng)基、 LBG-Amp-Kan液體培養(yǎng)基、MSM-Amp-Kan液體培養(yǎng)基、LBM-Amp-Kan液體培養(yǎng)基中，37°C搖 床，200rpm，發(fā)酵培養(yǎng)72h，收集發(fā)酵產(chǎn)物。
[0102] 2、檢測(cè)細(xì)菌胞內(nèi)積累的聚合物含量
[0103] 通過(guò)氣相色譜法（Gas C虹omatography，GC)對(duì)細(xì)菌胞內(nèi)的聚合物進(jìn)行定量檢測(cè)， 測(cè)定細(xì)胞的生物量、胞內(nèi)聚合物含量和聚合物中各單體的比例。
[0104] 具體檢測(cè)方法如下；氣相色譜分析使用HP 6890型氣相色譜儀，色譜柱為HP-5毛 細(xì)管柱，柱長(zhǎng)30m，內(nèi)徑320 μ m，固定相為25nm厚的苯基甲基聚娃氧焼；檢測(cè)器為火焰離子 化檢測(cè)器（Flame ionization detector, FID);用高純氮?dú)庾鳛檩d氣，氨氣作為燃?xì)猓諝?為助燃?xì)狻?br>[0105] 氣相色譜分析的條件如下：
[0106] (1)柱溫；8(TC開(kāi)始，停留1. 5min ;30°C /min的速率升溫到140。停留Omin ; 40°C /min的速率升溫到220。停留Imin?？傆?jì)時(shí)間為6. 5min。
[0107] 似柱壓；10psi開(kāi)始，停留1. 5min ;2. 5psi/min的速率升壓到20psi，停留 0. 5min。（psi為壓力單位，即磅/平方英寸，Ipsi = 6. 89476kPa)
[0108] (3)進(jìn)樣口；溫度為20(TC，使用分流模式，分流比為30。
[010引 （4)檢測(cè)器；溫度為22(TC，氨氣流量30血/min,空氣流量400血/min。
[0110] (5)檢測(cè)步驟如下：
[0111] 1)將上述步驟1中得到的發(fā)酵產(chǎn)物，離必（10000g，10min)收集菌體，然后用蒸傭 水洗涂?jī)纱魏笤俅坞x必；將細(xì)胞冰凍干燥，測(cè)定細(xì)胞干重（Cell化y wei曲t，CDW);
[011引。取50mg干細(xì)胞于醋化管中，加入2血醋化液（按體積百分含量為3 %將濃硫酸 溶于甲醇中，得到硫酸-甲醇溶液，再按照終濃度為Ig/L將苯甲酸作為內(nèi)標(biāo)加入硫酸-甲 醇溶液中，得到醋化液）、2mL氯仿，加蓋密閉，10(TC烘箱中反應(yīng)4h ;冷卻至室溫后，加入ImL 去離