路德維希腸桿菌bg10-1及其在黃曲霉菌生物防治中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一株路德維希腸桿菌BG10-1及其在黃曲霉菌生物防治中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 由曲霉屬真菌（特別是黃曲霉）引起的毒素污染統(tǒng)稱曲霉菌毒素污染，寄主范圍 廣。曲霉特別是黃曲霉給花生、玉米、水稻及大豆等作物的安全生產(chǎn)帶來嚴(yán)重危害，每年導(dǎo) 致的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)百億美元。曲霉屬真菌特別是黃曲霉菌能產(chǎn)生毒性極強(qiáng)的真菌毒素。 黃曲霉毒素是廣泛污染農(nóng)產(chǎn)品的一類強(qiáng)致癌、劇毒性真菌毒素，包括B、G和Μ族，其中B1最普 遍且毒性最強(qiáng)。人或動物食用受毒素污染的食品或飼料后會導(dǎo)致機(jī)體病變甚至死亡，嚴(yán)重 威脅消費(fèi)者健康與生命安全，制約農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展與國際貿(mào)易。因此，加強(qiáng)我國花生、玉米及 水稻等農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉及毒素污染的防控刻不容緩。
[0003] 目前，在對黃曲霉菌的防治中，化學(xué)防治占據(jù)重要的地位?；瘜W(xué)防治不但成本高， 且易污染環(huán)境，在防控病原菌的同時(shí)病原菌也易對化學(xué)藥劑產(chǎn)生耐藥性甚至抗藥性。因此， 加強(qiáng)黃曲霉菌生物防控的研究對我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)及經(jīng)濟(jì)效益具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的發(fā)明目的之一是針對花生中黃曲霉菌污染的問題及現(xiàn)有技術(shù)的不足，提 供一株對黃曲霉菌有較好防效的路德維希腸桿菌菌株。
[000引本發(fā)明的另一發(fā)明目的是提供由該菌株制備的微生物有機(jī)肥制劑、制備方法及其 在黃曲霉菌生物防治中的應(yīng)用。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] 提供路德維希腸桿菌BG10-1，已于2016年1月7日保藏于中國武漢大學(xué)的中國典型 培養(yǎng)物保藏中屯、（CCTCC)，保藏號為CCTCC Ν0:Μ 2016014,分類命名：Enterobacter Ludwigii BG10-1。路德維希腸桿菌BG10-1是從廣西賀州八步鎮(zhèn)花生芙果中分離獲得。經(jīng)室 內(nèi)對時(shí)括抗實(shí)驗(yàn)、活體抑菌解毒實(shí)驗(yàn)和田間防治試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌株對黃曲霉菌抑菌能力較 強(qiáng)，容易培養(yǎng)，無污染，對環(huán)境安全。
[000引路德維希腸桿菌BG10-1菌株的分離及篩選方法如下：
[0009]選取罹病花生田中健康花生植株，連同花生植株及±壤一同帶回實(shí)驗(yàn)室分離。超 凈工作臺上將花生植株上部長有葉片的莖桿剪掉，輕輕抖掉芙果上附著且結(jié)合程度低的± 壤，將健康芙果及其上附著牢固的±壤一起放入無菌水中，震蕩30分鐘，獲得±壤懸浮液。 將芙果從上述±壤懸浮液中無菌操作取出，用吸水紙吸干后用綴子夾至無菌天平上稱重。 將稱重后的花生芙果用自來水及牙刷洗凈表面±壤至眼睛看不見為止，然后在無菌Ξ角 瓶中用3%次氯酸鋼溶液浸泡10分鐘，最后無菌水沖洗5次，漸干水分。用綴子夾出花生芙 果，無菌操作斑開芙果，將果殼用無菌剪刀平均分成5等份，分別放置在牛肉膏蛋白腺培養(yǎng) 基、PDA培養(yǎng)基平板中，于28Γ恒溫培養(yǎng)，每天觀察菌落生長狀況，并及時(shí)挑取特征差異明 顯、分離良好的單菌落，進(jìn)一步純化獲得純菌株，在牛肉膏蛋白腺斜面培養(yǎng)基上保藏備用。 進(jìn)行室內(nèi)對時(shí)括抗實(shí)驗(yàn)、活體抑菌解毒實(shí)驗(yàn)和田間防治試驗(yàn)，從中篩選獲得路德維希腸桿 菌BG10-1。
[0010] 路德維希腸桿菌BG10-1形態(tài)學(xué)特征：
[0011] 對BG10-1細(xì)胞形態(tài)和菌落特征進(jìn)行觀察，均為革蘭氏陰性短桿菌，無芽抱，好氧， 菌落圓形，較小，邊緣整齊，表明濕潤粘稠，菌落乳白色。
[001引生理生化特征；
[0013] 各項(xiàng)生理生化鑒定項(xiàng)目包括:革蘭氏染色、氧化酶反應(yīng)、過氧化氨酶反應(yīng)、葡萄糖 發(fā)酵、V.P檢巧U、MR檢巧Μ千維素分解、巧樣酸鹽利用、酪蛋白水解、硝酸鹽還原、亞硝酸鹽還 原、硝化反應(yīng)及硫化氨反應(yīng)等。路德維希腸桿菌的主要生物學(xué)特性為見表1。
[0014] 表1路德維希腸桿菌BG10-1生理生化特征
[0015]
[0016] 生防菌BG10-1分子鑒定為路德維希腸桿菌，其16srDNA基因序列見說明書核巧酸 和氨基酸序列表中的SEQ. ID.NO. 1。
[0017] 路德維希腸桿菌BGlO-1菌株的生物活性測定：
[0018] (1)路德維希腸桿菌BG10-1對黃曲霉菌的抑制作用:采用對時(shí)培養(yǎng)法對黃曲霉菌內(nèi) 生括抗細(xì)菌進(jìn)行篩選。將預(yù)先準(zhǔn)備好的黃曲霉菌菌碟置于PDA平板中央，然后用高溫滅菌的 牙簽薩取內(nèi)生細(xì)菌，等距離(距病原菌2cm處)對稱點(diǎn)接到PDA平板上，于28°C黑暗培養(yǎng)，3- 7d觀察抑菌帶的有無及大小，重復(fù)3次。選出抑菌帶較寬的內(nèi)生細(xì)菌菌株在花生顆粒上進(jìn)行 復(fù)篩。表巧旨出所應(yīng)用的效果較好的生防菌對黃曲霉菌的抑制率，所實(shí)驗(yàn)的325株菌株中， BG10-1菌株對黃曲霉菌的抑制作用最強(qiáng)，抑制率達(dá)到72.5% (圖1)。
[0019] 表2路德維希腸桿菌BG10-1等生防菌株對黃曲霉菌的抑制率（％ )
[0020]
[0021] 注:表中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為Ξ次重復(fù)的平均值。
[0022] 間菌株BG10-1等生防菌活體生防效果實(shí)驗(yàn)
[0023] ①括抗菌發(fā)酵液的準(zhǔn)備：用挑針挑取離體試驗(yàn)中具有抑菌活性的括抗細(xì)菌菌株 BG10-1等菌株的單菌落，轉(zhuǎn)移至裝有50mL ΝΒ培養(yǎng)液的Ξ角瓶中，于28°C、150r · min-i振蕩 培養(yǎng)Id。吸ImL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至裝有50mL NB培養(yǎng)液的Ξ角瓶中，28°C、150r · min-i振蕩培養(yǎng) 2d，獲得括抗菌株的發(fā)酵液。
[0024] ②括抗細(xì)菌的活體篩選:把上述發(fā)酵2天的括抗菌發(fā)酵液(抱子最終濃度為3.0X 106抱子?血-1)和培養(yǎng)7天生長旺盛的黃曲霉菌菌懸液(抱子最終濃度為3.0X 106抱子· mL 分別浸泡花生種30min，陰涼處被干后放入無菌平板，每板20?；ㄉ?，放入光照培養(yǎng)箱培 養(yǎng)1 Od。培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件為:溫度28 °C，濕度70-80 %，光照為12h黑暗/1化光照。W不浸黃曲 霉菌液為空白對照，每處理設(shè)3次重復(fù)。表3指出菌株BG10-1抑制率及抑毒率最高，分別達(dá)到 65.0%及90.5%，該菌株有進(jìn)一步研究的潛力(表3和圖2)。抑毒率（％ )=(對照毒素量一處 理毒素量)/對照毒素量X 100% ;抑制率（％ )=(對照發(fā)病數(shù)一處理發(fā)病數(shù))/對照發(fā)病數(shù)X 100%。
[0025] 表3 7株括抗菌對黃曲霉菌的防治效果及抑毒率
[0026]
[0027] 注:數(shù)據(jù)為Ξ次重復(fù)的平均值
[0028] 提供一種由上述路德維希腸桿菌BG10-1制成的防治花生黃曲霉菌的微生物有機(jī) 肥制劑，括抗菌含量在5X108c化/gW上，有機(jī)質(zhì)含量為35-40wt%。
[0029] 其生產(chǎn)方法包括：
[0030] 將路德維希腸桿菌BG10-1發(fā)酵液和木馨渣與畜禽糞便混合物高溫腐熟料進(jìn)行固 體發(fā)酵，發(fā)酵兩天后進(jìn)行翻料，W后每天進(jìn)行翻堆，5-7天即可發(fā)酵結(jié)束，低溫干燥（< 60 °C)，使其含水量含18%即可得到包裝成品固體發(fā)酵微生物有機(jī)肥，固體發(fā)酵微生物有機(jī)肥 中括抗菌含量達(dá)5 X 108c化/gW上，有機(jī)質(zhì)含量為35-40wt%。
[0031] 按上述方案，木馨渣與畜禽糞便混合物高溫腐熟料:發(fā)芽指數(shù)^ 98%，有機(jī)質(zhì)含量 35-40wt%，含水量 15-20wt%。
[0032] 按上述方案，將路德維希腸桿菌BG10-1接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵 生產(chǎn)的條件為:培養(yǎng)溫度32-35°C，pH 7.0-7.2，攬拌速度180-220rpm，發(fā)酵后使發(fā)酵液中菌 體量達(dá)到 Μ X l〇iDcfu/ml。
[0033] 按上述方案，每噸木馨渣與畜禽糞便混合物高溫腐熟料中加入路德維希腸桿菌發(fā) 酵液15-3化。
[0034] 按上述方案，所用的液體培養(yǎng)基配制方法為：玉米粉3.0-3.5**%、蛋白腺1.5- 2. Owt %、K2HPO4+KH2PO4(1:1)0.4-0.5wt %，水 1000ml，pH 7.0-7.2，12rC 滅菌20min。
[0035] 路德維希腸桿菌BGlO-1生物菌肥田間防效、抑毒率及促生作用
[0036] 田間試驗(yàn)小區(qū)隨機(jī)設(shè)計(jì)，3個(gè)重復(fù)，每個(gè)小區(qū)的面積為15m X 3m。將生防制劑W每畝 50公斤，于花生播種時(shí)隨肥料施入，設(shè)置化學(xué)防治方法(70%甲基托布津可濕性粉劑0.5g/ 棵)及對照，農(nóng)藥的施用方法同生防制劑?；ㄉ斋@后每處理隨機(jī)調(diào)查4個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)10株。表4 指出菌株BG10-1促生率及抑毒率最高，分別達(dá)到6.5%及70.5%，該菌株有進(jìn)一步研究的潛 力，其次是肌9-5，分別達(dá)到3.1 %及64.5% (表4和圖3)。抑毒率（％ )=(對照毒素量一處理 毒素量)/對照毒素量X 100% ;促生率（％)=(對照株高一處理株高)/對照株高X 100%。 [0037]表4括抗菌對黃曲霉菌產(chǎn)毒抑制率及對花生促生效果 [003引
[0039] 提供一種上述防治花生黃曲霉菌的微生物有機(jī)肥在田間防治花生上黃曲霉菌中 的應(yīng)用，應(yīng)用方法為:將防治花生上黃曲霉菌的微生物有機(jī)肥制劑W每畝40-60公斤，于花 生播種時(shí)隨肥料施入。
[0040] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明所提供的路德維希腸桿菌BG10-1對黃曲霉菌具有明顯 的抑菌活性，該菌株制備的菌肥能有效防治黃曲霉菌對花生的污染。
【附圖說明】
[0041] 圖1為路德維希腸桿菌BG10-1對黃曲霉菌的平板括抗；
[0042] 圖2為路德維希腸桿菌BG10-1在花生粒上對黃曲霉括抗作用；
[0043] 圖3為雙抗菌株BG10-1的存活周期。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 實(shí)施例1:路德維希腸桿菌BG10-1微生物菌肥的制備
[004引本發(fā)明中設(shè)及到的路德維希腸桿菌BG10-1，已于2016年1月7日被保藏于中國典型 培養(yǎng)物保藏中屯、（CCTCC)，保藏號為CCTCC N0:M 2016014,分類命名：Enterobacter Ludwigii BG10-1。其是從廣西賀州八步鎮(zhèn)花生芙果中分離篩選到.經(jīng)室內(nèi)對時(shí)括抗實(shí)驗(yàn)、 活體抑毒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌株抑菌較強(qiáng)，抑菌解毒效果好且穩(wěn)定，容易培養(yǎng)，無污染，對環(huán)境安 全。
[0046] 路德維希腸桿菌BG10-1菌株的生物菌肥制備方法如下：
[0047] 1)將路德維希腸桿菌BG10-1接種到液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵生產(chǎn)的條 件為:培養(yǎng)溫度32-35°C，pH 7.0-7.2，攬拌速度180-220rpm，發(fā)酵