一種枯草芽孢桿菌、菌劑、菌劑的制備方法和菌劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種枯草芽抱桿菌、菌劑、菌劑的制備方法 和菌劑的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 稻攝病是水稻重要病害之一，在世界各稻區(qū)均有發(fā)生，其中W葉部、節(jié)部發(fā)生為 多，發(fā)生后可造成不同程度減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)40 % -50 %，造成慘重?fù)p失。該病由稻梨抱菌引 起，病菌W分生抱子和菌絲體在稻草和稻谷上越冬，翌年產(chǎn)生分生抱子借風(fēng)雨傳播到稻株 上，萌發(fā)侵入寄主向鄰近細(xì)胞擴(kuò)展發(fā)病，形成中屯、病株。病部形成的分生抱子，借風(fēng)雨傳播 進(jìn)行再侵染，播種帶菌種子可引起苗攝。在自然條件下，稻攝菌只侵染水稻，因此對水稻的 生產(chǎn)威脅極大。
[0003] 目前對于該病的防治主要是用70%甲基托布津可濕性粉劑500倍液、50%多菌靈 可濕性粉劑250倍液、25%使百克乳油2000倍液、強(qiáng)氯精可濕性粉劑500倍液、10%浸種靈乳 油2500倍液、25 %施?？巳橛?000-4000倍液藥劑浸種48-72小時(shí)處理或者是在發(fā)病時(shí)噴施 30 %克攝散乳油500倍液、50 %消菌靈水溶性粉劑500倍液、40 %克百菌懸浮劑500倍液、 25 %咪鮮胺乳油1500倍液、40 %稻攝靈可濕性粉400倍液、50 %四氯苯獻(xiàn)可濕性粉劑400倍 液、50 %多菌靈可濕性粉劑500-600倍液、70 %甲基托布津可濕性粉劑1000倍液、75 %Ξ環(huán) 挫可濕性粉劑2000倍液、20 %稻曲克敵可濕性粉劑1500倍液、20 %毒菌錫膠懸劑400倍液等 化學(xué)藥劑。長期使用化學(xué)殺菌劑，導(dǎo)致病菌抗藥性增強(qiáng)，只有加大用藥劑量W及縮短噴藥時(shí) 間間隔來控制病害，不僅增加了生產(chǎn)成本也導(dǎo)致農(nóng)藥殘留量越來越多大。大量使用化學(xué)藥 劑，容易造成±壤污染，酸堿失調(diào)，養(yǎng)分含量降低，±壤板結(jié)，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量。因此采 用生物防治來控制水稻稻攝病是農(nóng)業(yè)發(fā)展的必然趨勢。而采用括抗微生物防治病害是代替 化學(xué)藥劑的一種安全、無毒、有效的新方法。括抗微生物不僅可W抑制病原菌的生長，還能 增大±壤中微生物的數(shù)量，促進(jìn)植物生長，對改善生態(tài)系統(tǒng)，保持生物多樣性，維護(hù)生態(tài)平 衡有著重要的作用。
[0004] 瘡挪病被視為馬鈴馨生產(chǎn)中的世界性病害，在我國許多馬鈴馨主產(chǎn)區(qū)普遍存在， 連作地、偏堿地及栽培管理不當(dāng)?shù)那闆r下發(fā)生程度更為嚴(yán)重。近年來，瘡挪病在我國很多馬 鈴馨生產(chǎn)地區(qū)相繼發(fā)生，其中黑龍江、內(nèi)蒙古、河北、山東、山西、陜西、貴州、甘肅、四川、湖 南、湖北、云南等多個省區(qū)的馬鈴馨主產(chǎn)區(qū)均有關(guān)于該病的報(bào)道，基本覆蓋了東北、華北、西 北和西南。并且在氣候干旱、±壤偏堿性、連作重巷嚴(yán)重的地區(qū)發(fā)病率較高。
[000引馬鈴馨瘡挪病病菌主要為害塊莖，從皮孔侵入，發(fā)病初期在塊莖表皮產(chǎn)生褐色斑 點(diǎn)，W后逐漸擴(kuò)大，侵染點(diǎn)周圍的組織壞死，塊莖表面變粗糖，質(zhì)地木栓化。同時(shí)依據(jù)病原菌 種類的不同，在成熟的馨塊上常表現(xiàn)為凸起或凹陷的表面病斑，嚴(yán)重時(shí)病斑連片，馨塊的品 質(zhì)降低。同時(shí)，由于表皮組織被破壞后，易被其他病原菌侵染，造成塊莖腐爛，嚴(yán)重影響馬鈴 馨的外觀，降低其品質(zhì)和膽藏周期。
[0006]利用生物防治±傳病害是一種行之有效的防治措施，是植物保護(hù)中必不可少的組 成部分。特別是利用自然界中原本存在的植物根際有益微生物對祀標(biāo)病原微生物的括抗作 用，來控制病原微生物的危害，具有較小的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，是一種環(huán)境友好的防治技術(shù)。隨著人 們對食品安全、生態(tài)安全重視，生物防治是實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要策略之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種新的枯草芽抱桿菌。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述枯草芽抱桿菌菌劑及制備方法，
[0009] 本發(fā)明還有一目的在于提供利用所述枯草芽抱桿菌菌劑在制備防治植物病害藥 物中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的目的是通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0011] 一種枯草芽抱桿菌，其特征在于:枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)JQ-001，保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號院，保藏時(shí)間：2015年11月9日，保藏登記號為CGMCC No.11632。
[0012] 本發(fā)明的枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)JQ-001從黑龍江建Ξ江農(nóng)場連作5 年W上水稻根基±壤中分離、純化W及篩選步驟獲得的，采用形態(tài)特征、生理生化實(shí)驗(yàn)、分 子生物學(xué)鑒定法W及l(fā)eSrDNA同源序列比對分析最終確定上述保藏編號的菌株為枯草芽抱 桿菌(Bacillus subtilis)。
[0013] -種枯草芽抱桿菌菌劑，是枯草芽抱桿菌JQ-001經(jīng)種子活化、種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng) 后制成的菌劑;該菌劑包括液體菌劑和固體菌劑。
[0014] W枯草芽抱桿菌為活性成分的菌劑的制作方法，具體步驟如下：
[001引a.菌種活化:將低溫保存的枯草芽抱桿菌JQ-001菌株接種于固體培養(yǎng)基上，于35- 38°C培養(yǎng)34-3化;挑取單菌落轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，于35-38Γ培養(yǎng)16-24h，用無菌水洗下 培養(yǎng)基表面菌體作為接種液；
[0016] b. -級種子液制備：按照5%-10%的接種量向種子培養(yǎng)基中接入步驟a制備的接 種液，轉(zhuǎn)速200-26化pm，溫度35-38°C，搖床培養(yǎng)16-24h，作為一級種子液；
[00Π ] C.二級種子液制備:按照0.5%-3%的接種量向種子培養(yǎng)基中接入步驟b制備的一 級種子液，通氣量為0.4-1.5vvm，攬拌速度為180-260rpm，培養(yǎng)時(shí)間為18-24h，作為二級種 子液；
[001引種子培養(yǎng)基的組成成分及其重量百分比為:葡萄糖蛋白腺酵 母粉0.6%-1%、牛肉膏0.5%-0.7%、氯化鋼0.5%、其余為水；
[0019] d.發(fā)酵培養(yǎng):按照5%-10%的接種量向發(fā)酵培養(yǎng)基中接入步驟C制備的二級種子 液，通氣量為0.4-1.5vvm，攬拌速度為180-260巧m，培養(yǎng)時(shí)間為24-30h，得到發(fā)酵液；
[0020] 發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分及其重量百分比為:葡萄糖3%-5%、蛋白腺0.5%-1.5%、 酵母粉0.03%-0.08%、蛋白腺0.1%-0.3%、豆巧粉0.5%-1.5%、硫酸儀0.01%-0.05%、 硫酸儘0.01 % -0.05 %，其余為水；
[0021 ] e.將上述發(fā)酵液通過水洗和分子篩濃縮，得到枯草芽抱桿菌液體菌劑。
[0022] f.將上述發(fā)酵液噴霧干燥:進(jìn)口溫度150-200°C，出口溫度50-90°C，加入噴霧載體 可溶性淀粉，得到枯草芽抱桿菌粉劑菌劑。
[0023] g.將W下原料按重量百分比混合均勻：枯草芽抱桿菌粉劑20-30%;白炭黑10- 15% ;娃藻±: 10-20% ;十二烷基橫酸鋼1-10 % ;糞橫酸鹽D-1002 2-10% ;膨潤±10-20 %， 潤濕劑W-2001 2-10%。然后利用氣流粉碎機(jī)粉碎至400目W上，控制水分含量^ 5%。得到 枯草芽抱桿菌可濕性粉劑菌劑。
[0024] 進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供W上枯草芽抱桿菌菌劑在制備防治水稻稻攝病和馬鈴馨 瘡挪病藥物中的應(yīng)用。
[0025] 本發(fā)明具有W下有益效果：
[0026] 由本發(fā)明枯草芽抱桿菌制得的菌劑噴灑到作物葉面上，能夠定植在作物表面，占 領(lǐng)病原菌生態(tài)位，抑制病原菌生長，對水稻稻攝病病原菌抑制率達(dá)到91.3% W上;噴施到地 面上通過滲透，同樣可W抑制病原菌生長，其對馬鈴馨瘡挪病病原菌抑制率達(dá)到89% W上； 并能促進(jìn)作物生長，增加作物產(chǎn)量，維護(hù)生態(tài)平衡。并且其液體菌劑的生產(chǎn)具有周期短，活 性高、成本低的特點(diǎn)，利于工業(yè)化生產(chǎn)，而制備成固體菌劑，特別是制備成可濕性粉劑后可 W延長保藏周期，方便使用。
[0027] 菌種保藏
[0028] 枯草芽抱桿菌JQ-001，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、， 保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院，保藏時(shí)間：2015年11月9日，保藏登記號為 CGMCC No.11632。
【附圖說明】
[0029] 圖1是本發(fā)明的枯草芽抱桿菌的leSrDNA同源序列比對分析樹狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] W下結(jié)合具體實(shí)施列進(jìn)一步說明：
[0031] 實(shí)施例一:枯草芽抱桿菌JQ-001菌株的分離與篩選：
[0032] 1、分離
[0033] (1)上壤采集:從黑龍江建Ξ江農(nóng)場連作5年W上水稻田里±壤表層到10cm處采集 ±樣100肖，一個地點(diǎn)平行采集5個樣本，混合過40目分級篩。取lOOg篩下±壤用做分離。
[0034] (2)培養(yǎng)基配制:分別配制
[00；3引 NA培養(yǎng)基:蛋白腺1 Og/L、牛肉膏3. Og/L、氯化鋼5g/L、瓊脂18g/L抑=7.0-7.2;
[0036] 和PDA培養(yǎng)基:馬鈴馨200g，葡萄糖20g，瓊脂粉20g，蒸饋水ΙΟΟΟιΛ;
[0037] 制作培養(yǎng)基平板。
[003引（3)準(zhǔn)確稱取lg±壤置于250mlS角瓶中，加入99ml無菌水，搖床200rpm、30-37°C 震蕩30min。制成±壤懸浮液，按10倍梯度稀釋至10-8。分別在ΝΑ培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基中分離 單菌落，分離到的單菌落分別在NA培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基中活化4個周期。
[0039] 2、篩選
[0040] 將分離活化的JQ-001單菌落及其它菌種單菌落與水稻稻攝病病原菌進(jìn)行平板對 時(shí)實(shí)驗(yàn)，W下是篩選過程對時(shí)實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果：
[0041] 在PDA培養(yǎng)基平板中央接入預(yù)先培養(yǎng)的病原菌(水稻稻攝病），待生長大小合適時(shí) 用直徑9mm的打孔器打出菌斑，移至新的PDA培養(yǎng)基平板中央，在距離病原菌菌斑2cm處接種 公司現(xiàn)有不同菌種，每個處理重復(fù)3次，置于25°C生化