一種能拆分(+/-)γ-內(nèi)酰胺得到(-)γ-內(nèi)酰胺的假單胞菌及其篩選和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種能拆分(+/-) γ-內(nèi)酷胺得到(-)γ-內(nèi) 酷胺的假單胞菌，該假單胞菌為格拉納達(dá)假單胞菌(Pseudomonas granadensis Β6)。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿己卡韋和帕拉米韋分別是治療艾滋病和禽流感及甲流感的特效藥物。目前的研 究結(jié)果表明，W光學(xué)純的（-)γ -內(nèi)酷胺為起始化合物的酶化學(xué)合成方法，是合成運(yùn)兩種特 效藥物的最簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的方法。在發(fā)現(xiàn)微生物能選擇性拆分(+/-) 丫-內(nèi)酷胺得到(-)丫-內(nèi) 酷胺之前，文獻(xiàn)報(bào)道的制備光學(xué)純的（-)丫-內(nèi)酷胺一般采用化學(xué)不對(duì)稱合成的方法。使用 運(yùn)種方法的缺點(diǎn)在于:原料昂貴，步驟煩瑣，成本較高，且會(huì)造成較嚴(yán)重的環(huán)境污染，同時(shí)產(chǎn) 物中通常含有金屬雜質(zhì)。與此形成鮮明對(duì)比的是，用微生物進(jìn)行催化合成光學(xué)純的（-)丫- 內(nèi)酷胺具有反應(yīng)條件溫和效率高，產(chǎn)物純度高及對(duì)環(huán)境友好的特點(diǎn)。
[0003] 有關(guān)該方法的研究主要集中在篩選高對(duì)映選擇性的拆分(+/-) 丫 -內(nèi)酷胺得到(-) 丫-內(nèi)酷胺的生產(chǎn)菌株。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究較少，李海泉等WN-乙酷苯丙氨酸為唯一碳源，篩選 出了一株選擇性拆分(+/-) Υ-內(nèi)酷胺得到(-)Υ-內(nèi)酷胺的菌株L29-9。[李海泉等:微生物 學(xué)報(bào)，46(4) :571-575,2006]此菌經(jīng)鑒定為氧化控微桿菌（Microbacterium hy化ocarbonoxydans)。陳紅干等WN-乙酷苯丙氨酸為唯一碳源，篩選出了一株選擇性拆分 (+/-) 丫 -內(nèi)酷胺得到(-)丫-內(nèi)酷胺的Delftia sp.菌株；[陳紅干等：中國(guó)生物工程雜志，32 (9) :41-47,2012]。目前沒(méi)有利用格拉納達(dá)假單胞菌篩選的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的之一在于提供一種能拆分(+/-) 丫 -內(nèi)酷胺得到 (-)丫-內(nèi)酷胺的假單胞菌。
[000引該假單胞菌為格拉納達(dá)假單胞菌(Pseudomonas granadensis B6)，于2015年10月 10日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏編號(hào)為:CCTCC Μ 2015596,保藏單位地址：中國(guó) 武漢武漢大學(xué)。
[0006] 本發(fā)明的目的之二是提供了所述能拆分(+/-) 丫-內(nèi)酷胺得到(-)丫-內(nèi)酷胺的假 單胞菌的培養(yǎng)方法。
[0007] 本發(fā)明的目的之Ξ是提供了所述假單胞菌拆分(+/-) 丫-內(nèi)酷胺得到(-)丫-內(nèi)酷 胺的方法。
[000引本發(fā)明是通過(guò)W下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：
[0009] -種能拆分(+/-) γ-內(nèi)酷胺得到(-)γ-內(nèi)酷胺的假單胞菌;其在中國(guó)典型培養(yǎng)物 保藏中屯、的保藏編號(hào)為:CCTCC Μ 2015596。
[0010] 所述假單胞菌的篩選，具體為：
[0011] (1)初培養(yǎng):從湖底取污泥，用無(wú)菌水稀釋后涂布于培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)，2天；
[0012] 所述初篩培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:NH4化2.0~10g，K此P〇4 0.01~lOg，化2冊(cè)化0.01~ 10g，MgS〇4 0.01 ~lg，Ca化2 0.01 ~0.5g，（+/-) 丫-內(nèi)酷胺 1 ~lOg，微量元素 lOOyL，瓊脂粉 10~30g;其中微量元素按照每升加入量計(jì)算包括：CaCL2 · 2出0 3.6g，Zn0 2.0g，Cu化· 2出0 0.85g，NaMo0 · 2出0 4.8g，MnCL2 · 4出0 2.0g，F(xiàn)eCL3 · 6出0 5.4g，CoCL2 · 6出0 2.4g;
[0013] (2)挑取單菌落再次在篩選培養(yǎng)基上劃線分離純化單菌落；
[0014] 挑取單菌落形態(tài)特征為:菌落圓形、邊緣整齊、隆起濕潤(rùn)，白色略帶黃色，菌落內(nèi)部 呈黏液狀，革蘭氏染色呈陰性；
[0015] (3)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng):先將步驟(2)中所述挑取出來(lái)的單菌落繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng) 1~3天，所述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成Wg/L計(jì)為:葡萄糖5.0g，NH4化2.0~10g，K此P〇4 0.01~ 10g，Na2HP〇4 0.01 ~10g，MgS〇4 0.01 ~lg，CaCL2 0.01 ~0.5g，（+/-) 丫-內(nèi)酷胺2g，F(xiàn)eS〇4 〇.〇8g；
[0016] (4)將上述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)的菌液進(jìn)行離屯、獲得所述能拆分(+/-) 丫-內(nèi)酷胺得到 (-)丫-內(nèi)酷胺的假單胞菌，備用。
[0017] 較佳地，步驟(1)中所述污泥取自艾溪湖。
[0018] 較佳地，所述步驟(1)中其中初培養(yǎng)的溫度20~40°C，P冊(cè)~10。
[0019] 能拆分(+/-) 丫-內(nèi)酷胺得到(-)γ-內(nèi)酷胺的方法，采用能拆分(+/-) 丫-內(nèi)酷胺得 到(-)Υ-內(nèi)酷胺的微生物菌株，在水相體系中，W(+/-) Υ-內(nèi)酷胺為底物，進(jìn)行不對(duì)稱水解 拆分制備得到所述(-)T-內(nèi)酷胺。
[0020] 具體步驟如下：
[0021] (1)微生物菌株:所述能拆分(+/-) Y-內(nèi)酷胺得到(-)丫-內(nèi)酷胺的假單胞菌；
[0022] (2)先將步驟(1)中所述的假單胞菌進(jìn)行離屯、獲得濕菌體備用；
[0023] (3)拆分體系的配制：用憐酸鹽緩沖液配制2g/L~600g/L的(+/-) 丫-內(nèi)酷胺；
[0024] (4)拆分(+/-) 丫-內(nèi)酷胺得到(-)丫-內(nèi)酷胺:將步驟(3)的配制好的(+/-) 丫-內(nèi)酷 胺加入到在步驟(2)的濕菌體中進(jìn)行反應(yīng)。
[0025] (5)拆分液的處理和分析:將步驟(4)中所得微生物拆分反應(yīng)之后的液體，離屯、除 去菌體，取上清液采用乙酸乙醋萃取，萃取液稀釋后進(jìn)行手性HPLC檢測(cè)；色譜柱型號(hào)為 Daicel公司CHIRALPAK AS-肥50 X 4.6mm;流動(dòng)相為異丙醇/乙臘(v/v) =80/20;流速0.5血/ min;檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。
[0026] (6)產(chǎn)物的分離提取:采用二氯甲燒萃取步驟巧）中所得菌體，并依次經(jīng)過(guò)干燥、蒸 發(fā)濃縮、冷卻結(jié)晶，最后得到所述的(-)丫-內(nèi)酷胺；
[0027] 較佳地，所述步驟(3)中憐酸鹽緩沖液的抑3~10，濃度為0.01~0.5mol/L。
[0028] 較佳地，所述步驟(4)中菌體終濃度為0.5g/L~lOOg/L濕菌體，反應(yīng)溫度為20~60 。(：，反應(yīng)時(shí)間為1~2地，搖床轉(zhuǎn)速為100~30化pm。
[0029] 較佳地，所述步驟(5)中在20~80°C下蒸發(fā)濃縮、1~4°C下冷卻結(jié)晶。
[0030] 較佳地，所述步驟(6)中所述(-)丫-內(nèi)酷胺的光學(xué)純度化e值)95.0 %~100 %，化 學(xué)純度為95 %~99 %。
[0031] 本發(fā)明利用篩選獲得的具有高對(duì)映選擇性的拆分(+/-) 丫-內(nèi)酷胺得到（-)丫-內(nèi) 酷胺的菌株格拉納達(dá)假單胞菌(Pseudomonas granadensis B6)，在水相體系中選擇性水 解外消旋丫-內(nèi)酷胺得到(-)丫-內(nèi)酷胺，在300g/L底物濃度條件下，產(chǎn)物(-)丫-內(nèi)酷胺的光 學(xué)純度化e值)達(dá)到100%，產(chǎn)物經(jīng)萃取、蒸發(fā)濃縮、冷卻結(jié)晶得到光學(xué)純的(-)丫-內(nèi)酷胺，產(chǎn) 物光學(xué)純度化e值)為95.0 %~99.9 %，化學(xué)純度為95 %~99 %。該微生物催化不對(duì)稱水解 制備(-)丫-內(nèi)酷胺的方法具有高立體選擇性、高反應(yīng)產(chǎn)率、高產(chǎn)物濃度的特點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖1為本發(fā)明中假單胞菌的顯微鏡(1000X)觀察照片，
[0033] 圖2為本發(fā)明假單胞菌的平板菌落形態(tài)。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】做一個(gè)詳細(xì)的說(shuō)明。
[003引實(shí)施例1
[0036] 1.能拆分(+/-) 丫-內(nèi)酷胺得到(-)γ-內(nèi)酷胺的假單胞菌的篩選：
[0037] (1)初培養(yǎng):從艾溪湖底取污泥，用無(wú)菌水稀釋后涂布于培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)，2天 后；
[003引所述初篩培養(yǎng)基為：畑4化 2.0g，K此P04 1.5g，化2冊(cè)04 1.5g，MgS04 0.2g，CaCL2 0.1 g，（+/-) 丫-內(nèi)酷胺2g，微量元素 lOOyL，瓊脂粉20g;其中微量元素按照每升加入量計(jì)算 包括：CaCL2 · 2此0 3.6g，Zn0 2.0g，Cu化· 2此0 0.85g，NaMo0 · 2此0 4.8g，Mn化2 · 4此0 2.0g，F(xiàn)eCL3 · 6也0 5.4g，Co(X2 · 6也0 2.4g;
[0039] (2)挑取單菌落再次在篩選培養(yǎng)基上劃線分離純化單菌落；
[0040] 挑取單菌落形態(tài)特征為:菌落圓形、邊緣整齊、隆起濕潤(rùn)，白色略帶黃色，菌落內(nèi)部 呈黏液狀，革蘭氏染色呈