，12,000 rpm離心1分鐘，棄濾液； (6) 請(qǐng)確認(rèn)Buffer WB中已經(jīng)加入了指定體積的100%乙醇，將700yL的Buffer WB加入至 Spin Column中，12,000 rpm離心1分鐘，棄濾液； (7) 重復(fù)操作步驟(4); (8) 將Spin Column安置于Collection Tube上，12,000 rpm離心2分鐘； (9) 將Spin Column安置于新的1.5 ml的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入50 ~200yL的滅菌水或Elution Buffer，室溫靜置5分鐘； (10) 12，000 rpm離心2分鐘洗脫DNA。
[0022] 第二步:特異性PCR擴(kuò)增： 本發(fā)明針對(duì)尖孢鐮刀菌18S特異序列F.Oxy及所產(chǎn)玉米赤霉烯酮毒素聚酮合成酶基因 PKS的序列設(shè)計(jì)特異性引物，鑒定鏡刀菌屬中的尖抱鏡刀菌及毒素基因（引物序列見(jiàn)表4)。
[0023] 特異性PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50yL，其中l(wèi)OXbuffer 5yL、dNTP 4yL、Mg2+ 4yL、引 物各2yL、Taq酶2yL、模板4yL，之后用雙蒸水補(bǔ)足到50yL; ITS序列片段、18S序列片段及28S序列片段PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min，94 。(:變性50s，50°C復(fù)性lmin，72°C延伸lmin30s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C終延伸10min，4°C保 溫； F. Oxy序列片段及PKS序列片段PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min，94 °C變性50s， 55°C復(fù)性45s，72°C延伸lmin30s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C終延伸10min，4°C保溫； 各引物序列見(jiàn)表5: 表5.各引物序列
第三步:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化： PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化采用OMEGA Cycle-Pure Kit(D64920-l)試劑盒進(jìn)行： (1) 先平衡柱子，將DNA結(jié)合柱置入提供的2ml收集管中，按操作說(shuō)明進(jìn)行； (2) 確定PCR的反應(yīng)體積，將樣品置于干凈的1.5ml微型離心管，再加上4-5倍體積結(jié)合 緩沖液，如PCR產(chǎn)物< 200bp加6倍體積結(jié)合緩沖液； (3) 渦旋徹底混合，簡(jiǎn)短的旋轉(zhuǎn)離心，收集在蓋上的東西； (4) 將第(3)步樣品置入DNA結(jié)合柱，室溫下lOOOOrpm離心lmin; (5) 拋棄液體并把DNA結(jié)合柱回到相同的收集管道； (6) 加入700yL用無(wú)水乙醇稀釋的DNA洗脫緩沖液(DNA wash buffer)洗脫DNA結(jié)合柱， 在室溫下1 OOOOrpm離心lmin; (7) 拋棄液體和重復(fù)步驟6、7; (8) 拋棄液體并離心空的DNA結(jié)合柱，13000rpm離心2min以干燥柱子； (9) 將DNA結(jié)合柱放入一個(gè)干凈的1.5ml離心管中，于柱子中加入15-30μ1的水，在室溫 下放置2min，13000rpm離心lmin以洗脫DNA。
[0024] 第四步:序列測(cè)定； 將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京華大基因測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序； 第五步:質(zhì)粒制備： 菌株來(lái)源于有資質(zhì)的菌種保藏中心，質(zhì)粒核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品均在經(jīng)CNAS認(rèn)可的分子實(shí)驗(yàn)室 內(nèi)完成，環(huán)境可控。采用的是PUC18質(zhì)粒載體，通過(guò)PCR擴(kuò)增尖孢鐮刀菌基因、F. Oxy基因及 PKS基因獲得目的片段，回收后分別連接至該載體。通過(guò)篩選鑒定獲得具有插入片段的克 隆。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品再經(jīng)2家以上有資質(zhì)的測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序比對(duì)確認(rèn)，具體步驟如下： (1) 將第二步中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物回收試劑盒(TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit，TaKaRa)純化，在T4 DNA連接酶作用下和T載體（TaKaRa的pMD18-T Vector，TaKaRa)16°C連接過(guò)夜，連接體系如下： T載體 2uL PCR片段 6仙 10XT4 buffer lpL T4 DNA連接酶 lyL; (2) 轉(zhuǎn)化 取上述連接液5tiL轉(zhuǎn)化到預(yù)先制備的DH5a化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，42°C熱激 2min，置冰上5min，加入lml LB培養(yǎng)液37°C搖床45min，離心5000rpm，2min，最后取100yL混 合液均勻涂布在含有l(wèi)〇〇ng/ml抗生素的LB平板上，將平板在37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜，挑取陽(yáng)性 克隆菌落轉(zhuǎn)劃到另一塊含有100 ng/ml抗生素的LB平板上，并對(duì)之進(jìn)行編號(hào)，37°C倒置培養(yǎng) 過(guò)夜； (3) 菌落原位PCR 挑取轉(zhuǎn)劃后長(zhǎng)出的陽(yáng)性克隆菌落，加入3此細(xì)菌DNA提取液破細(xì)胞，將細(xì)菌裂解液作為 PCR模板，其他PCR組分及PCR條件同第二步，后將PCR產(chǎn)物在2%凝膠上進(jìn)行電泳分析； (4) 采用抽提試劑盒(Plasmid Midi Preparation Kit，QIAGEN)抽提質(zhì)粒，收集質(zhì)粒， 測(cè)濃度，電泳檢測(cè)，即得尖孢鐮刀菌核酸序列定性標(biāo)準(zhǔn)樣品，抽提質(zhì)粒的步驟如下： a) 用1.5ml管離心收集細(xì)菌，兩次，共3ml左右； b) 加入250yL的預(yù)冷的P1，打勻后在震蕩儀上高速震蕩lmin; c) 加入250yL P2,溫和顛倒數(shù)次混勻； d) (在5min內(nèi)）加入冰上預(yù)冷的溶液N3 350yL，迅速溫和顛倒混勻，至出現(xiàn)分散的絮狀 沉淀； e) 冰上靜置2min后離心，13000rpm，lOmin; f) 小心吸取上清于藍(lán)色的核酸純化柱(spin柱）中（勿吸到沉淀）； g) 離心13000rpm，lmin，棄流出液； h) 加入750yL PE，離心 13000rpm，lmin，棄流出液； i) 再離心一次，離心13000rpm，lmin，棄流出液，以讓管內(nèi)徹底干燥； j) 將spin柱拿出，置于一干凈的1.5ml管中，小心的在spin柱中央加入30yL超純水（ Mi 11 iQ H20)，或者Elution Buffer，室溫靜置2min; k) 離心13000rpm，lmin，收集質(zhì)粒，測(cè)濃度，電泳檢測(cè)。
[0025]采用尖孢鐮刀菌溯源參照系的5個(gè)指標(biāo)，由2家測(cè)序公司（上海鉑尚生物公司和北 京六合華大基因公司）合作定值，序列BLAST比對(duì)定值，每個(gè)定值實(shí)驗(yàn)室測(cè)試5支標(biāo)準(zhǔn)樣品， 基因序列如下： 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因（ITS)序列： TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCACTTGTT GCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTATATGTAA CTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGC AAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTAT TCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGTTAATTCGCGT TCCCCAAATTGATTGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAGTAAAACCCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGC CACGCCGTTAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATAGGAG GCGAATAAC； 核糖體rRNA 18S基因（18S)序列： GTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCAATTATACAGCGAAACTGCGAA TGGCTCATTATATAAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACTTGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATAC ATGCTAAAAATCCCGACTTCGGAAGGGATGTATTTATTAGATTAAAAACCAATGCCCTTTCGGGGCTCACTGGTGAT TCATGATAACTCCTCGAATCGCATGGCCTTGTGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTTCCCTATCAACTTTCGATG TTTGGGTATTGGCCAAACATGGTTGCAACGGGTAACGGAGGGTTAGGGCTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAAC GGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACT GATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAA GTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGTGGTTAAAAAGCTCGTAGTT GAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGTGTACTGGTCCGGCCGGGCCTTTCCCTCTGTGGAACCCCA TGCCCTTCACTGGGTGTGGCGGGGGAAACAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGCTCCAGGCAGGCCTATGCT CGAATACATTAGCATGGA