一種金納米粒子負載銥配合物電致化學發(fā)光放大體系的伏馬菌素新型檢測方法
【技術領域】
[0001]一種膠體金負載銥配合物電致化學發(fā)光放大體系的伏馬毒素新型檢測方法，屬于材料化學應用領域。
【背景技術】
[0002]伏馬菌素(Fumonisin)是由串珠鐮刀菌代謝產生的一種真菌毒素，而伏馬菌素FBl是其主要種類，在世界范圍內普遍存在，尤其是玉米及玉米制品。食用伏馬菌素FBl污染的食物不僅會損害人類和動物的肝腎功能，還會引起馬腦白質軟化癥和豬肺水腫等。而我國和南非部分地區(qū)高發(fā)的食道癌也和伏馬菌素的污染有關。因此如何實現(xiàn)針對食品中伏馬菌素FBl的快速、靈敏檢測現(xiàn)已引起世界范圍的廣泛注意。
[0003]目前國內外針對伏馬菌素FBl的檢測研宄主要集中于酶聯(lián)免疫分析方法和傳統(tǒng)的儀器分析方法。酶聯(lián)免疫分析方法不僅需要復雜繁瑣的多步操作，所消耗的檢測時間較長，還需要依靠高純度的抗原抗體識別，常伴有假陽性和檢測靈敏度低的結果，因此在實現(xiàn)快速靈敏付馬毒素FBl的檢測上限制了其應用。此外儀器分析方法大多數都依靠價格昂貴的精密儀器，造成測試成本高，檢測周期長，對實現(xiàn)快速化、在線伏馬菌素FBl的檢測還有一段很長的距離。因此急需一種簡便、快捷、靈敏的檢測技術滿足樣品檢測海量化、實時檢測需求。
[0004]電致化學發(fā)光-核酸適配體傳感器近年來吸引了科學研宄的關注，該技術不僅結合的電致化學發(fā)光技術高的電致化學發(fā)光效率、低的背景信號和高的靈敏相應信號，還發(fā)揮了核酸適配體針對目標物強的親和性和特異性。同時和抗體相比，核酸適配體具有熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性，可以更容易修飾電致化學發(fā)光化合物。然而電致化學發(fā)光-核酸適配體傳感器還沒有應用于伏馬菌素FBl的檢測研宄中。納米技術和納米材料近年來的持續(xù)發(fā)展，推動了納米組裝及性質研宄及應用的不斷進步和創(chuàng)新，電致化學發(fā)光-核酸適配體傳感器結合新型納米材料可以大大提高檢測的靈敏度，減低檢測限。金納米粒子由于其良好的生物兼容性、大的比表面積，一方面可以負載更多的電致化學發(fā)光化合物，放大體系信號；另一方面其優(yōu)異的導電性可以加速電致化學發(fā)光化合物和電極之間的電子傳遞，提高電致化學發(fā)光效率。
[0005]獲得電致化學發(fā)光效率高且穩(wěn)定的發(fā)光試劑是電致化學發(fā)光-核酸適配體進行伏馬菌素檢測的關鍵。和傳統(tǒng)的聯(lián)吡啶釕配合物相比，金屬銥配合物具有更好的電致化學發(fā)光效率、長的激發(fā)壽命，但是缺乏官能團用于生物標記，其差的水溶性限制了其傳感應用。因此本發(fā)明合成了一種水溶性的羧基化金屬銥配合物，并通過巰基乙胺負載在金納米粒子表面?；诮鸺{米粒子負載銥配合物復合體的電致化學發(fā)光放大體系，首次建立伏馬菌素的快速靈敏檢測的新方法。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種金納米粒子負載銥配合物電致化學發(fā)光放大體系的伏馬菌素新型檢測方法。
[0007]本發(fā)明的技術方案:金納米粒子負載銥配合物電致化學發(fā)光放大體系的伏馬菌素新型檢測方法，包括電致化學發(fā)光-核酸適配體傳感器的構建和表征，伏馬菌素FBl的特異性和靈敏性檢測。
[0008]具體步驟:
[0009](I)金電極表面修飾
[0010]金電極表面用鋁粉仔細研磨，用乙醇和超純水分別清洗三次，備用。將與伏馬菌素FBl適配體部分互補的巰基化核酸序列滴在金電極表面，過夜反應，通過金巰共價鍵作用將部分互補的巰基化核酸序列修飾在金電極表面。用超純水進行清洗去除未修飾上的核酸序列，并用氮氣吹干。
[0011](2)電致化學發(fā)光-核酸適配體傳感器的構建
[0012]將羧基化銥配合物首先和巰基乙胺中的氨基進行反應，獲得銥配合物-巰基乙胺復合物，隨后加入的金納米粒子通過金巰共價鍵和銥配合物-巰基乙胺復合體中的巰基結合，從而制備修飾不同比例羧基化銥配合物的金納米粒子復合物(50:1、100:1、200: 1、500:1) ο在金納米粒子-銥配合物復合體的表面修飾巰基化的伏馬菌素FBl適配體，將核酸適配體-金納米粒子-銥配合物三者復合體溶液滴入在已修飾好的金電極表面，此時，伏馬菌素FBl核酸適配體會與金電極表面的部分互補核酸序列發(fā)生雜交互補配對，通過水洗去除多余的核酸適配體-金納米粒子-銥配合物復合體。在電致化學發(fā)光體系中加入共反應物二丁基乙醇胺，對電致化學發(fā)光-核酸適配體傳感體系的電致化學發(fā)光性能進行表征測試。
[0013](3)伏馬菌素FBl的特異性和靈敏性檢測
[0014]在已構建好的上述電致化學發(fā)光-核酸適配體傳感體系中加入不同濃度待測伏馬菌素 FBl 溶液(0,0.1,0.5、1.0,2.0,5.0、10、20、50 和 100ng/mL)，此時，伏馬菌素 FBl 分子會和部分互補核酸序列進行競爭反應結合伏馬菌素FBl適配體，建立伏馬菌素FBl溶液濃度和電致化學發(fā)光相應信號之間的標準曲線，達到對伏馬菌素FBl的靈敏檢測。同時，實驗設計了不同非目標物(赭曲霉毒素、黃曲霉毒素、L-半胱氨酸、牛血清蛋白)存在的條件下，電致化學發(fā)光-核酸適配體傳感器對伏馬菌素FBl的特異性檢測實驗。
[0015]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明通過金納米粒子-銥配合物復合體的制備構建了新型電致化學發(fā)光-核酸適配體傳感放大體系，首次實現(xiàn)了針對伏馬菌素FBl的特異、靈敏檢測，探討了金納米粒子-銥配合物復合體電化學放大體系和核酸適配體特異性傳感體系兩者的相互結合作用對于提高目標物檢測靈敏度和特異性的影響作用。
【附圖說明】
[0016]圖1實驗原理示意圖
[0017]圖2不同修飾比例的金納米粒子-銥配合物復合體的電致化學發(fā)光圖譜及發(fā)光照片
[0018]圖3電致化學發(fā)光-核酸適配體傳感器在伏馬菌素FBl檢測中的電致化學發(fā)光變化曲線及標準曲線的建立
[0019]圖4電致化學發(fā)光-核酸適配體傳感器的特異性實驗電致化學發(fā)光相應信號
[0020]表I DNA的編號、序列及長度
【具體實施方式】
[0021]實施例1
[0022](I)金電極表面修飾核酸片段
[0023]首先，其次將金電極表面分別用粒徑為0.5 ym和0.25 μ m的鋁粉仔細研磨，用乙醇和超純水分別清洗三次，備用。其次，將5 yL濃度為10 μ M的部分互補于伏馬菌素FBl適配體的核酸序列滴在金電極表面，見圖1，過夜反應，通過金巰共價鍵作用將部分互補的巰基化核酸序列修飾在金電極表面。最后，用超純水清洗去除未修飾上的核酸序列，重復三次，并用氮氣吹干。
[0024](2)電致化學發(fā)光-核酸適配體傳感器的構建
[0025]a)根據ZL 2011 I 0272661.6的權利要求書步驟進行15±2nm金納米粒子的合成。將合成好的2mL金納米粒子在5400g的轉速下離心lOmin，去除上清液，將沉淀重懸在10yL的超純水中。
[0026]b)將ImL 500nM羧基化銥配合物和ImL 500nM巰基乙胺中的氨基進行反應，獲得銥配合物-巰基乙胺復合物，隨后加入上述已濃縮好