金花納米顆粒免疫層析試紙條的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及真菌毒素的快速檢測試紙條的制備。
【背景技術(shù)】
[0002]脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是鐮刀菌產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物一單端孢霉烯族化合物中的一種，屬于B型單端孢霉烯族化合物。伏馬菌素B1(Fumonisin FB1)是另外一種霉菌毒素，是由串珠鐮刀菌產(chǎn)生的水溶性代謝產(chǎn)物。上述兩種真菌毒素廣泛存在于谷物糧食及其制品中，具有致畸、致癌、免疫抑制毒性、神經(jīng)毒性等作用，它們不僅造成農(nóng)作物減產(chǎn)、質(zhì)量下降等巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且對人、畜的健康構(gòu)成潛在的威脅。
[0003]目前有關(guān)DON和FB1的檢測方法主要有:薄層層析法、氣相色譜法、氣相色譜法-質(zhì)譜法和液相色譜法、液相色譜法-質(zhì)譜或液相色譜法-質(zhì)譜-質(zhì)譜法等；而有關(guān)FB1的檢測方法主要有:薄層層析法、液相色譜法、液相色譜法-質(zhì)譜等。上述方法一般只適合實(shí)驗(yàn)室檢測，耗時，費(fèi)用昂貴，需要復(fù)雜的儀器和復(fù)雜的樣品前處理，且需要專業(yè)人員操作，難于在基層普及和推廣，更不適合現(xiàn)場和野外大規(guī)模的快速檢測。
[0004]雖然目前國內(nèi)有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)的DON和ELISA試劑盒出售，可檢測多個樣品，可定性也可定量檢測，但ELISA也需要專業(yè)人員完成，其操作過程比較復(fù)雜，檢測時間比較長，不同的人員操作可能會出現(xiàn)不同的結(jié)果，且還必須配套酶標(biāo)儀讀數(shù)，也無法實(shí)施現(xiàn)場檢測。
[0005]基于在NC膜上的抗原與抗體反應(yīng)的膠體金免疫快速檢測法具有操作簡單、適合現(xiàn)場檢測、快速、不需復(fù)雜儀器而只需眼睛觀測和檢測成本低等特點(diǎn)。該法已經(jīng)成功用于醫(yī)學(xué)和食品安全等領(lǐng)域的快速檢測，例如早早孕檢測試紙、乙肝表面抗原檢測試
紙、瘦肉精檢測試紙等?，F(xiàn)已有利用膠體金免疫層析試制條分別檢測DON的報道:公開專利CN101158685A—種嘔吐毒素半定量試紙條的制備與使用方法；公開專利CN101482566快速檢測糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇試紙條制備及其應(yīng)用；公開號CN101650368A用膠體金免疫層析試紙檢測玉米赤霉烯酮毒素的方法。
[0006]目前，商品化的膠體金免疫層析試紙條檢測絕大多數(shù)為單一檢測(即每次只能檢測一種目標(biāo)物)，而采用金花狀納米顆粒作為標(biāo)記探針制備同時檢測谷物及其制品中DON和
膠體金免疫層析試紙條尚未見報道。此外，我國尚未建立用免疫層析試紙條測定谷物及其制品中DON和FB1的標(biāo)準(zhǔn)方法。因此從食品安全的要求出發(fā)，鑒于目前我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展?fàn)顩r，在國內(nèi)建立切實(shí)可推廣快速、準(zhǔn)確、可靠的適用于糧食收購現(xiàn)場同時檢測谷物及其制品中DON和FB1的膠體金免疫層析試紙條越來越顯得日益重要和迫切。
[0007]到目前為止，尚未見采用金花納米顆粒作為抗體標(biāo)記物用于同時檢測DON和FB1的報道，而采用金花作為抗體標(biāo)記物用于真菌毒素的快速檢測也未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供快速、同時檢測糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)和伏馬菌素B1 (FB1)試紙條的制備及其應(yīng)用的方法，以適應(yīng)DON和FB1的快速檢測。
[0009]本發(fā)明提供的快速、同時檢測糧食中DON和FB1的試紙條包括硝酸纖維素膜(NC膜)、結(jié)合物釋放墊、樣品墊、底板和吸水墊，NC膜具有包被DON-MBSA和FB1-BSA偶聯(lián)物的測試區(qū)(T線)和包被羊抗鼠IgG的質(zhì)控區(qū)(C線)，所述結(jié)合物釋放墊包被了 DON單克隆抗體和FB1單克隆抗體-金花納米顆粒(60-70 nm)標(biāo)記物。
[0010]本發(fā)明所述的制備方法，包括如下步驟。
[0011](I) DON單克隆抗體-金花納米顆粒標(biāo)記物和FBl單克隆抗體_金花納米顆粒標(biāo)記物的制備。
[0012]a.向兩個錐型瓶中分別加入5-10 mL的60-70 nm的金花納米顆粒溶液，然后分別加入適量1(20)3溶液調(diào)節(jié)溶液的pH為5.5-7.5。
[0013]b.分別取0.1-20 μ L的濃度為5 mg/mL DON抗體和2 mg/mL ?81抗體，稀釋30-50倍后，然后分別逐漸加入到步驟(a)的金花納米顆粒溶液中，快速攪拌反應(yīng)60 min。
[0014]c.分別加入BSA，終濃度為1.0%，反應(yīng)30 min。
[0015]d.分別加入PEG-20000，終濃度為0.1%，反應(yīng)30 min。
[0016]e.反應(yīng)后分別采用10000 rpm離心60 min。
[0017]f.棄去上清，沉淀分別采用含5%蔗糖、1%BSA、0.5%PEG_20000、2%海藻糖PBS溶液的金子稀釋液復(fù)溶。
[0018](2)金標(biāo)結(jié)合物釋放墊的處理。
[0019]將金標(biāo)結(jié)合物釋放墊放入含0.5%BSA、5%蔗糖、0.5%PEG_20000的濃度為0.01 M的PBS溶液中浸泡30 min，37°C真空干燥。將步驟(I)制備的DON單克隆抗體-金花納米顆粒標(biāo)記物和FB1單克隆抗體-金花納米顆粒標(biāo)記物混合均勻，然后采用噴金機(jī)均勻的噴入到金標(biāo)結(jié)合物釋放墊上，噴量為10-15 μ L/cm, 37°C真空干燥。
[0020](3)硝酸纖維素膜的包被。
[0021]將濃度為0.1-1.0 mg/mL的D0N-MBSA和濃度為0.1-1.0 mg/mL的偶聯(lián)的檢測抗原噴在硝酸纖維素膜上，噴量為0.5-1.0 μ L/cm，分別作為DON和檢測線，兩者間距為4-7 mm ;在距離DON檢測線4-7 mm處噴濃度為1-2 mg/mL羊抗鼠Ig G，作為質(zhì)控線，噴量為0.5 -1.0 μ L/cm。37°C真空干燥，密封。
[0022]所述的DON-MBSA和FB1-BSA的制備分別參照鄧舜洲.DON無毒phage-ELISA檢測方法的建立及展青霉素免疫學(xué)檢測初探，博士論文，南昌大學(xué)，2006;鄒龍.抗伏馬菌素BI單鏈抗體的制備及其免疫學(xué)檢測初步應(yīng)用研宄，碩士論文，南昌大學(xué)，2013。
[0023](4)試紙條的制作。
[0024]將上述噴有DON檢測抗原、FB1檢測抗原和羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜(NC膜)粘貼在PVP底板上；在底板的質(zhì)控線一端為吸附墊，另一端為樣品墊，NC膜兩端分別與樣品吸附墊和金標(biāo)墊相互交疊連接(連接部分可在1-2 mm范圍)，金標(biāo)墊上壓有樣品墊。以寬度為3-4 mm/條切條后即為同時檢測DON和FB1的試紙條。
[0025]本發(fā)明所制備的快速、同時檢測DON和試紙條的應(yīng)用。
[0026]同時檢測稻谷、小麥和玉米中的DON和FB1:稱取1.0 g粉碎的樣品于錐形瓶中，加入100 mL的蒸飽水，充分搖勾3-5 min，以定性濾紙過濾，收集濾液；再取0.5 mL的濾液加入到I mL的蒸餾水中，充分混勻，作為待檢測溶液。
[0027]上樣液的制備:取上述待檢測溶液，加入2-6滴含0.01-0.5%的陰離子表面活性劑、0.5%-5% Tween-20 的 PBS (0.05-0.1M)溶液，作為上樣液。
[0028]取上述上樣液滴于試紙條的加樣孔中，5 min后即可觀察到檢測結(jié)果。
[0029]本發(fā)明所述的百分濃度(％)除特別指出的之外，均是指g/ml。
[0030]本發(fā)明所述的快速、同時檢測糧食中DON和FB1K紙條具有如下特點(diǎn)。
[0031](I)特異性，靈敏度高。本發(fā)明制備的同時檢測糧食中DON和FB1試紙條，對DON和FB1的檢測靈敏度均為5 ng/mL，相應(yīng)的Cut-off值均為1000 μ g/kg，且對AFB、0ΤΑ、a-Zearalenol、3-AC_D0N、β - Zearalenol、Nivalenol、Citrinin、T_2、和 ΗΤ-2 等真菌毒素?zé)o明顯的交叉反應(yīng)性。
[0032](2)檢測結(jié)果形象、直觀。當(dāng)試紙條顯示三條紅色線表示:DON的含量低于1000 μ g/kg，且FB1的含量低于1000 μ g/kg ;當(dāng)只有質(zhì)控線顯示紅線表示:樣品中DON的含量高于1000 μ g/kg，且FB1的含量高于1000 yg/kg;當(dāng)質(zhì)控線和DON的檢測線顯紅色表示:樣品中DON的含量低于1000 μ g/kg，而FB1的含量高于1000 μ g/kg ;當(dāng)質(zhì)控線和FB ι的檢測線顯紅色表示:樣品中DON的含量高于1000 μ g/kg，而FB1的含量低于1000 μ g/kg ;質(zhì)控線不顯色表示:試紙條無效。
[0033](3)操作簡便、快速。不需專業(yè)人員操作，5 min內(nèi)可出檢測結(jié)果。
[0034](4)易于大范圍推廣應(yīng)用。快速檢測試紙條操作簡單，不需其他儀器和設(shè)備，只需按說明書即可完成檢測，易于普及，廣泛適用于糧食收購現(xiàn)場檢測、食品安全檢測、海關(guān)檢疫等需求，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會效益。
【具體實(shí)施方式】
[0035]本發(fā)明將通過以下實(shí)施例作進(jìn)一步說明。
[0036]實(shí)施例1。同時快速檢測DON和FB1K制條的制備。
[0037]1、DON和FB1單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備