尖孢鐮刀菌核酸序列定性標準樣品及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種尖孢鐮刀菌核酸序列定性標準樣品及其 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 世界糧農(nóng)組織(FA0)報告，全球每年約有25%的農(nóng)作物遭受真菌及其真菌毒素污 染，約有2%的農(nóng)作物因污染嚴重而失去營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值，由此估算，全球每年因真菌 毒素污染而造成的直接及間接損失將可能達到數(shù)百億美元。
[0004] 在目前已知的真菌毒素中，鐮刀菌(Fusarium)是一種重要的植物病原菌，危害小 麥、玉米、水稻、蔬菜等農(nóng)作物，造成嚴重的減產(chǎn)，所產(chǎn)生的玉米赤霉烯酮毒素鐮刀菌毒素具 有明顯的細胞毒和對蛋白質(zhì)、DNA合成的抑制作用，并有肯定的致畸性和致突變性，且污染 十分廣泛。目前針對真菌毒素的檢測，我國主要為理化方法，只能檢測到已經(jīng)產(chǎn)生的毒素， 對于已被污染但尚未產(chǎn)生毒素的高風險食品卻束手無策，更無法溯源，而且由于真菌的形 態(tài)相似性及產(chǎn)毒真菌的產(chǎn)毒狀況的復雜性，目前各菌種保藏中心提供的標準菌株基本信息 不全，基本不涵蓋產(chǎn)毒信息，使檢驗工作難以獲得真正的陽性標準樣品。
[0005] 真菌毒素是困擾食品安全的大問題，但是目前針對真菌毒素檢測的化學方法無法 檢測還未產(chǎn)生毒素但攜帶毒素基因的潛在產(chǎn)毒真菌，而分子生物學方法則可以快速篩選， 預先排除存在的產(chǎn)毒真菌，從而避免糧食、食品的大面積的污染。但是由于真菌孢子易于飄 散，極易污染且難以消除等特性，需要特殊的操作空間，一些實驗室不具備相應的工作條 件，檢測工作難以完成。
[0006] 近年來PCR技術(shù)在微生物的檢測方面具有明顯優(yōu)勢。ITS(Internal Transcribed Spacer):內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，是真菌核糖體RNA(rRNA)基因非轉(zhuǎn)錄區(qū)的一部分。用 于真菌鑒定的ITS序列通常包括ITS1、5 .8 S和ITS24DNA上的5 .8S、18S和28S rRNA基 因有極大的保守性，即存在著廣泛的異種同源性。而由于ITS區(qū)不加入成熟核糖體，所以 ITS片段在進化過程中承受的自然選擇壓力非常小，因此能容忍更多的變異，在絕大多數(shù) 的真核生物中表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性，即使是親緣關(guān)系非常接近的2個種都能 在ITS序列上表現(xiàn)出差異，顯示最近的進化特征。研究表明，ITS片段的進化速率是18 S rDNA的10倍，這就是ITS序列在微生物種類鑒定和群落分析的理論基礎(chǔ)。ITS1和ITS2 是中度保守區(qū)域，其保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對一致，種間差異比較明顯。這種特點使 ITS適合于真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育 關(guān)系分析。由于ITS的序列分析能實質(zhì)性地反映出屬間、種間以及菌株間的堿基對差異， 同時ITS序列片段較小、易于分析，目前已被廣泛應用于真菌屬內(nèi)不同種間或近似屬間的 系統(tǒng)發(fā)育研究中。ITS的序列分析還有效地解決真菌應用形態(tài)學特征進行分類所引起的紛 爭，彌補了傳統(tǒng)分類上的一些不足。
[0007] 另外，目前已研制的分類定級國家標準樣品多數(shù)溯源至相應的文字標準，生物類 定性標準樣品多數(shù)溯源至公認的測試方法，部分國家標準樣品沒有溯源性的描述。對2010 年~2015年批準的146項分類定級國家標準樣品溯源性描述的調(diào)查表明：無溯源性描述內(nèi) 容的35項，溯源至測試方法標準的102項，溯源至核酸序列的22項，溯源至產(chǎn)品標準的5項， 溯源至計量基準的1項，溯源至權(quán)威專家的1項。分類定級國家標準樣品溯源性描述的狀況 說明人們對這類標準樣品的溯源性認識和理解上處于比較混亂的階段，還沒有一個統(tǒng)一的 規(guī)范。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是克服上述不足問題，提供一種生物和產(chǎn)毒信息明確的尖孢鐮刀菌 核酸序列定性標準樣品制備方法，同時采用標準物質(zhì)分類定級理論，建立尖孢鐮刀菌核酸 序列定性標準樣品定值溯源參照系與參照指標。本發(fā)明的另一目的是提供一種尖孢鐮刀菌 核酸序列定性標準樣品的制備方法。
[0009] 本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是:一種尖孢鐮刀菌核酸序列定性標準 樣品，其特征在于:所述尖孢鐮刀菌核酸序列定性標準樣品包含的序列為： 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因（ITS)序列： TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCACTTGTT GCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTATATGTAA CTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGC AAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTAT TCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGTTAATTCGCGT TCCCCAAATTGATTGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAGTAAAACCCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGC CACGCCGTTAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATAGGAG GCGAATAAC； 核糖體rRNA 18S基因（18S)序列： GTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCAATTATACAGCGAAACTGCGAA TGGCTCATTATATAAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACTTGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATAC ATGCTAAAAATCCCGACTTCGGAAGGGATGTATTTATTAGATTAAAAACCAATGCCCTTTCGGGGCTCACTGGTGAT TCATGATAACTCCTCGAATCGCATGGCCTTGTGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTTCCCTATCAACTTTCGATG TTTGGGTATTGGCCAAACATGGTTGCAACGGGTAACGGAGGGTTAGGGCTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAAC GGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACT GATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAA GTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGTGGTTAAAAAGCTCGTAGTT GAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGTGTACTGGTCCGGCCGGGCCTTTCCCTCTGTGGAACCCCA TGCCCTTCACTGGGTGTGGCGGGGGAAACAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGCTCCAGGCAGGCCTATGCT CGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTA ATAGGGACAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGA AAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTC TTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGGTGTTATTTTTTGACCCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAG TGCTTGGGCTCCAGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAG； 核糖體rRNA 28S基因（28S)序列： GTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGTTTATGACCAGACTTGGGCTTGGTTAATCATCTGGGGTTCTCCCCAGTGC ACTTTTCCAGTCCAGGCCAGCATCAGTTTTCCCCGGGGGATAAAGGCGGCGGGAATGTGGCTCTCTTCGGGGAGTGT TATAGCCCACCGTGTAATACCCTGGGGGGGACTGAGGTTCGCGCATCTGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAAC GACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTC； 尖孢鐮刀菌18S特異序列基因(F.Oxy)序列： TACCACTTGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTC TGTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATC GAT