一種檢測核糖核酸酶的方法及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測核糖核酸酶的方法及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 核糖核酸酶(Rib〇nuCleaSe，RNa Se)能將RNA底物水解成小分子核酸。大部分核糖 核酸酶活性需要二價陽離子(如Ca2+、Mg 2+等）。其中RNase A是一種有廣泛應(yīng)用的核酸內(nèi)切 酶。RNase A對RNA有水解作用，但對DNA則不起作用。
[0003] RNase A在嘧啶核苷酸殘基C和U的3'端處高效且專一地催化RNA鏈骨架上的磷酸 二酯鍵的裂開，形成具有2'，3~環(huán)磷酸衍生物的寡聚核苷酸。
[0004] RNase是實驗室普遍存在的環(huán)境污染物，對RNase活性的監(jiān)測是一個常規(guī)質(zhì)量控制 (QC)步驟。另一方面，對RNase的檢測方法還可應(yīng)用于疾病診斷中，如癌癥檢測。1970年， Reddi首次證實胰腺癌患者血清RNase異常升高（Reddi KK，Holland JF.Elevated serumribonuclease in patients with pancreatic cancer.Proc Natl Acad Sci USA. 1976,73(7) :2308-10),血清RNase濃度檢測可用于胰腺癌診斷。
[0005] 測量RNase活性的方法有多種，如放射性同位素法（Egly JM and KempfJ. Detection and estimation of very low ribonuclease activities in biological fluids.FEBS 1^1^618，1976,63:25〇-254)、分光光度法（？&8]161八？， Iordache1 MC and Wagner LP.A simple spectrophotometrie method for the measurement of ribonuclease activity in biological fluids · J · Biochem. Biophys .Methods，1983，8: 291-297)和焚光淬滅法（James DA and Woolley GA.Afluorescence-based assay for ribonuclease aactivity · Anal · Biochem.，1998，264: 26-33)，電化學(xué)法（Takenaka，S.S.a.S.(2014)·" Highly Sensitive Nuclease Assays Based on Chemically Modified DNA or RNA." Sensors)等。其中以人工合成的寡聚核糖核酸分子為底物的RNA酶檢測技術(shù)準(zhǔn)確性較高 (ffitmer MR,Falcomer CM,Weiner MP,Kay MS,Begley TP,Ganem B andScheraga HA.U-37-BCIP：a chromogenic substrate for the detection of RNase A inrecombinant DNA expression systems.Nucleic Acids Res·，1991，19:1-4)〇
[0006] 但以往的方法易產(chǎn)生放射性污染、步驟多、周期長，難以實現(xiàn)高通量、自動化;其靈 敏度也有較大改進(jìn)空間。尤其是實驗室的核糖核酸酶質(zhì)控對檢測技術(shù)的靈敏度要求較高， 為避免樣本的污染或?qū)嶒炇?，需要確定實驗室試劑、容器或環(huán)境中微量核糖核酸酶的含 量。但目前商品化檢測方法的靈敏度僅為l〇-l〇〇pg/ml的RNase A范圍，無法滿足實驗室常 規(guī)質(zhì)控的需求。因此，一種高靈敏度、高通量的RNase檢測方法是必需的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明一個目的是提供一種檢測待測樣本中核糖核酸酶的方法。
[0008] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：
[0009] 1)設(shè)計合成RNA探針；
[0010] 所述RNA探針由單鏈RNA、能量供體基團(tuán)和能量受體基團(tuán)組成；
[0011] 所述單鏈RNA由2-30個核糖核苷酸組成且所述單鏈RNA包含至少一個核糖核酸酶 切割位點、至少1個G和至少1個C;
[0012] 所述能量供體基團(tuán)和所述能量受體基團(tuán)分別位于所述核糖核酸酶切割位點的兩 側(cè)；
[0013] 2)將待測樣本和含有所述RNA探針的反應(yīng)體系混勻，得到反應(yīng)液；
[0014] 3)檢測所述反應(yīng)液熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度確定待測樣本是否含有核糖核酸酶。
[0015] 上述方法中，步驟1)中，所述1個G和1個C形成1個GC或CG序列；
[0016] 所述能量供體基團(tuán)和所述能量受體基團(tuán)與所述單鏈RNA兩個末端的核苷酸連接，
[0017] 或所述能量供體基團(tuán)和所述能量受體基團(tuán)與位于RNase切割位點兩側(cè)的核糖核苷 酸連接；
[0018] 所述單鏈RNA還包括至少一個被修飾的核糖核苷酸，
[0019] 所述修飾為核糖修飾、核苷間鍵修飾和堿基修飾中的至少一種；
[0020] 所述能量供體基團(tuán)為熒光發(fā)射基團(tuán)，所述能量受體基團(tuán)為與所述熒光發(fā)射基團(tuán)對 應(yīng)的熒光淬滅基團(tuán)。
[0021 ]上述方法中，緊鄰所述GC序列或所述CG序列中的G的核苷酸為A或U。
[0022]所述被修飾的核糖核苷酸位于所述單鏈RNA的5 '末端和/或3 '末端；
[0023]所述核糖修飾為核糖2 位修飾；
[0024]所述被修飾的核糖核苷酸為2甲基核糖核苷酸、2'-甲氧基乙氧基核糖核苷 酸、2 ' -F核糖核苷酸、2 脫氧核糖核苷酸、2 ' -0-烯丙基核糖核苷酸、2 ' -0-戊基核糖核苷酸 或2'-0-丁基核糖核苷酸；
[0025] 所述核苷間鍵修飾具體為硫代磷酸酯修飾、二硫代磷酸酯修飾、磷酸三酯修飾等。
[0026] 所述熒光發(fā)射基團(tuán)為FAM、TAMRA、HEX或花菁染料；
[0027] 所述熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA、FAM、BQH或Dabcyl;
[0028] 所述花菁染料具體為CY3或CY5。
[0029] 所述單鏈RNA由4-10個核糖核苷酸組成；所述單鏈RNA的長度優(yōu)選2-29、2-25、2_ 23、2-21、2-19、2-16、2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-3、3-29、3-25、3-23、3-21、3-19、3-16、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、4-29、4-25、4-23、4-21、4-19、4-16、4-11、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、 4-5、5-29、5-25、5-23、5-21、5-19、5-16、5-11、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-29、6-23、6-21、6_ 19、6-16、6-11、6-10、6-9、6-8、6-7、7-21、7-14、7-10、7-9、7-8、8-21、8-18、8-12、8-10、9-10、9-17、10-15、10-30個核苷酸長度。以上長度范圍與長度中間值也在本發(fā)明的保護(hù)范圍。 所述單鏈RNA具體由4、5、6、9或10個核苷酸組成。
[0030] 上述方法中，步驟2)中，所述含有RNA探針的反應(yīng)體系中RNA探針的濃度為 0.01?111〇1/111-1?111〇1/111 ;或1?熟探針的濃度(?111〇1/111)選自0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、 0·8、0·9〇
[0031] 上述方法中，所述含有RNA探針的反應(yīng)體系由RNA探針、10Χ反應(yīng)緩沖液和水組成；
[0032] 所述 10X 反應(yīng)緩沖液由0-5M NaCl、0-5M KCl、20mM-lM Tris、10-100mM MgCl2和 水組成，且NaCl和KC1的濃度均不為0。
[0033] 更優(yōu)選的范圍是，所述10 X反應(yīng)緩沖中，NaCl濃度為0.02-0.3M、KC1濃度為0.01-0.2M;優(yōu)選所述 10X反應(yīng)緩沖液由0.05M NaCl、0.02M KCl、20mM Tris、10mM MgCl2和水組 成。
[0034] 上述方法中，所述檢測反應(yīng)液熒光強(qiáng)度的方法為實時定量PCR、電泳法、熒光法、 HPLC法或電化學(xué)方法。
[0035] 上述方法中，所述核糖核酸酶為RNase I、RNase A或RNase T1;
[0036] 所述RNA探針為序列1所示的單鏈核苷核酸-序列9所示的單鏈核苷核酸中任一個 或其任意組合。
[0037] 所述RNA探針具體為序列9所示的單鏈核苷核酸。
[0038] 上述方法中，所述待測樣品為RNase A水溶液、RNase T1水溶液、T4 DNA Ligase制 備過程產(chǎn)物、商品化酶(如表4所示）、實驗用水或固體表面。
[0039]上述根據(jù)熒光強(qiáng)度確定待測樣本是否含有核糖核酸酶為若待測樣本的RFU值為陰 性對照(無核糖核酸酶水)1.1倍，則待測樣本含有核糖核酸酶，反之則沒有。
[0040]本發(fā)明另一個目的是提供一種檢測待測樣本中核糖核酸酶的試劑盒。
[0041 ]本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的方法中的RNA探針。
[0042] 上述方法中，所述試劑盒還包括上述的方法中的10X反應(yīng)緩沖液。
[0043] 上述的方法或上述的試劑盒在檢測待測樣本中核糖核酸酶含量或相對含量也是 保護(hù)的范圍；
[0044] 或上述的方法或上述的試劑盒在比較兩個或多個待測樣本中核糖核酸酶含量或 相對含量也是保護(hù)的范圍。
[0045] 上述待測樣本可為實驗室試劑、水、體液或包含RNase酶的任何液體樣本或可配置 為液體的樣本。
[0046] 上述方法基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理而建立，其中底物包含熒光基團(tuán)和熒光淬滅 基團(tuán)，所述熒光基團(tuán)的熒光信號能被熒光淬滅基團(tuán)抑制，而底物的裂解使淬滅基團(tuán)和熒光 基團(tuán)分離，淬滅效應(yīng)消失，熒光基團(tuán)信號被釋放。（見圖1)。
[0047] 焚光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET):當(dāng)一個 熒光基團(tuán)（又稱為熒光供體基團(tuán)）的熒光光譜與另一個熒光基團(tuán)（又稱為熒光受體基團(tuán)）的 激發(fā)光譜相重疊時，熒光供體基團(tuán)的激發(fā)能誘發(fā)熒光受體基團(tuán)發(fā)出熒光，同時供體熒光分 子自身的熒光強(qiáng)度衰減的一種現(xiàn)象。FRET的產(chǎn)生及效率與熒光供體基團(tuán)與熒光受體基團(tuán)的 空間距離緊密相關(guān)，該空間距離在7-10nm時FRET的效率最佳。隨著距離延長