一種細菌耐藥性篩查pcr芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細菌耐藥性篩查PCR芯片。
【背景技術(shù)】
[0002] 眾所周知，細菌容易對抗菌素產(chǎn)生耐藥性。細菌產(chǎn)生耐藥性的機制大體上可分為 兩類，一是本身具有抗性基因或產(chǎn)生了抗性突變，稱天然耐藥性；二是細菌通過融合或轉(zhuǎn)化 方式獲得耐藥性基因，耐藥性細菌也可從其它耐藥性細菌中獲得新的耐藥性基因，從而產(chǎn) 生多耐藥性細菌。
[0003] 細菌耐藥性基因按照耐藥性基因的功能可以分為多類，列舉幾類如下：
[0004] (1)編碼抗菌素修飾酶，如aminoglycoside、acetyltransferases、 aminoglycoside、adenylyltransferases、aminoglycosidephosphotransferases、 beta-lactamase等，通過對抗菌素進行乙酰化、腺苷化、磷酸化等修飾使抗菌素失效；
[0005] (2)編碼抗菌素外排系統(tǒng)的關(guān)鍵蛋白（如multidrugeffluxpumps)，增強細胞把 抗菌素排除細胞外的能力，從而降低抗菌素在細胞內(nèi)的有效濃度，產(chǎn)生細菌耐藥性；
[0006] (3)編碼抗菌素靶標蛋白，由于基因突變，靶蛋白喪失與抗菌素的結(jié)合能力，導致 抗菌素無法發(fā)揮作用。
[0007] 細菌耐藥性基因的獲得使得細菌對藥物產(chǎn)生耐藥性，從而使常規(guī)抗菌素作用下降 甚至失效。因此在使用抗菌素前檢測患者體內(nèi)的細菌獲得了哪些耐藥性基因，這些耐藥性 基因的表達水平如何，可以指導醫(yī)生采用哪種抗菌藥類型及其劑量。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)中的細菌耐藥性的檢測，常規(guī)做法是抗菌素藥敏實驗，首先需要分離和 培養(yǎng)細菌，然后再逐一進行藥敏實驗。藥敏實驗只能確定細菌對某一種抗菌素耐藥，而無法 判斷是哪種耐藥基因?qū)е碌哪退幮?。這種檢驗方式在單一耐藥性、少量樣本的情況下仍需 要數(shù)日到數(shù)周，而在進行批量檢測時耗時更長，且極易出錯。
[0009] 隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，逐步開始采用基因檢測方法檢測抗菌素基因，主要分為通 過雜交直接檢測細菌耐藥性基因的方法，以及對目標基因進行擴增（PCR)后檢測的方法。 通過雜交直接檢測細菌耐藥性基因的方法中，有學者做過用DNA芯片來檢測60多種耐藥性 基因的研究，然而，DNA芯片的檢測條件同樣需要將細菌進行分離、擴大培養(yǎng)，即便如此，其 準確度、靈敏度、專一性都還仍然不能與對目標基因進行擴增的PCR方法相提并論。而傳統(tǒng) PCR由于每個基因的PCR條件不完全一致，只能停留在逐一檢測的水平上；采用大規(guī)模集成 化載體一次檢測大量抗性基因的PCR產(chǎn)品市面上未見。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種能夠大規(guī)模集成化檢測多種細菌耐藥基因的細菌耐 藥性篩查PCR芯片，相對于上述傳統(tǒng)細菌耐藥性檢測手段來說，其優(yōu)勢在于：
[0011] 1.采用實時熒光定量PCR，準確度、靈敏度、專一性極高
[0012] 2.采用大規(guī)模集成化檢測，2小時可檢測170個耐藥性基因的190種靶點
[0013] 3.可用于復合樣本的耐藥性篩查：可在99%非耐藥細菌存在的背景下檢測出1% 含量的耐藥性基因，無需進行分離培養(yǎng)，可直接或經(jīng)預擴增后用于復雜環(huán)境中混合樣本的 微生物耐藥性篩選。
[0014] 4.不僅提供了耐藥性基因篩查，同時可幫助弄清耐藥性機制
[0015] 5.無需細菌培養(yǎng)，無需藥敏實驗，加快檢測速度、減少人工成本
[0016] 6.使用方便，只需混合PCRMasterMix和分配上板，無需對每個基因進行標記，大 大簡化實驗操作。
[0017] 本發(fā)明提供的PCR芯片，其組分包括：分別用于擴增與細菌耐藥相關(guān)的基因的擴 增引物對，PCR陽性對照（PPC)，用于固定擴增引物對和承載PCR反應的集成化PCR載體。
[0018] 優(yōu)選的，集成化PCR載體可以是384孔PCR板或2塊96孔PCR板。
[0019] 優(yōu)選的，用于擴增與細菌耐藥相關(guān)的基因的擴增引物對序列分別為SEQN0 :1-380 所示的核苷酸序列。
[0020] 優(yōu)選的，基因擴增引物在384孔板上的排列順序如說明書附圖1，可檢測2個樣本。
[0021] 優(yōu)選的，基因擴增引物在2塊96孔板上的排列順序如說明書附圖2。
[0022] 優(yōu)選的，上述引物對都在統(tǒng)一的PCR條件下工作。具體PCR擴增程序如表1所示：
[0023] 表 1
[0024]
【主權(quán)項】
1. 一種細菌耐藥性篩查PCR芯片，包括PCR載體及分別用于擴增與細菌耐藥相關(guān)的基 因的擴增引物對，所述與細菌耐藥相關(guān)的基因包括： 氨基糖巧己醜轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因；aacA, aacAl, aacA4, aacA7, aacA29b, aacCl, aacC2, aacC3, aacC4, aac(3)-Id; 氨基糖巧腺巧轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因；aadA4, aadA7, aadA9, aadAlO, aadA12, aa曲； 氨基糖巧磯酸轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因；aph, apM, apM-3, apM-6, apM-7, aph2, aph (29) -lb, strA ； 目內(nèi)醜胺酶相關(guān)基因；ctx-m4, ctx-m26, ctx-m27, ctx-m32, ges_3，kpc_3，per-l, per-2, shv-34, blaTEM-1, blaTLA-1, blaTLA-2, imp-2, imp-5, imp-9, imp-13, imp-16, vim-4, vim-7, ampC, cmy-9, cmy-13, blanps-1, blanps-2, oxa-1, oxa-2, oxa-5, oxa-9, oxa-10,oxa-12,oxa-18,oxa-20,oxa-22,oxa-27,oxa-29,oxa-40,oxa-45,oxa-46,oxa-48, oxa-50, oxa-54, oxa-55, oxa-58, oxa-60, oxa-61, oxa-75 ; 氯霉素醜基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因；cat, cat2, catlll, catA, ca1:B2，ca1:B4，ca1:B6，ca1:B7， ca1:B8, ca1:B9, ca1:P ; 氯霉素/氣洛芬轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)基因；cmlAl，cmxA，fexA，floR ; 疏水性多膚相關(guān)基因；cmlB ; 五膚家族蛋白相關(guān)基因；qnrA3, qn;rBl，qn;rB4, qnr ; rRNA腺嘿嶺N6-甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因；ermA, ermB, ermD, ermF, erm(TR); 醋酶相關(guān)基因；ereA2, ereB ; MFS外輸粟相關(guān)基因；mefA, mefE, mel ; 大環(huán)內(nèi)醋29-磯酸轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因；mph(B)，m地(A)，mph，mphB，mph(BM); 水解酶相關(guān)基因；V曲(A); 鏈陽菌素B內(nèi)醋酶相關(guān)基因；vgbB ; ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因；arr2 ; 四環(huán)素轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)基因；tet (A)，tetA似，tetA (J)，te1:BSR，tet值），tet似， tet 化），tet (X)，tetA (Y)，tet 狂），eff J, tet (V)，tet 化），tet (30)，tet (33)，tet (38); 四環(huán)素失活蛋白相關(guān)基因；tet (37)，tet狂）； GTP 關(guān)聯(lián)延伸因子相關(guān)基因；tetB(F〇，tet(M)，tet(O)，tet 做，tet(W); 核糖體保護蛋白相關(guān)基因；tet (36)，tetQ，tet (T); 四環(huán)素阻遏蛋白相關(guān)基因；tetR(31); 四環(huán)素抵抗相關(guān)基因；tet扣）； 轉(zhuǎn)磯酸核糖基酶相關(guān)基因：tet (34); 二氨葉酸還原酶相關(guān)基因；壯rll，壯rV，壯rVI，壯rXII，壯rl3,壯rl6,壯rl7,壯rA19, 壯rB2,壯rD，化化，化巧，化化I，化化VIII，化打IX，化化XV ; 二氨蝶酸合成酶相關(guān)基因；sull，sum, sulIII ; 小型多藥外輸粟相關(guān)基因；qacB, qacD, qac邸 1，qacF, qacF, qacG, qacG2, qa地； 多藥外輸粟相關(guān)基因；acrB, acrD, mexB, mexD, mexF, mexl, mexY, orfllo
2. 如權(quán)利要求1所述的細菌耐藥性篩查PCR芯片，其特征在于，所示擴增引物對的序列 分別為SEQ ID NO ; 1-380所示的核巧酸序列。
3. 如權(quán)利要求1所述的細菌耐藥性篩查PCR芯片，其特征在于，所述擴增引物對分別成 對存在于384孔PCR板的孔中。
4. 如權(quán)利要求1所述的細菌耐藥性篩查PCR芯片，其特征在于，所述擴增引物對分別成 對存在于兩塊96孔PCR板的孔中。
5. 如權(quán)利要求1所述的細菌耐藥性篩查PCR芯片，其特在在于，所述引物對可W單次或 重復出現(xiàn)的方式分別成對存在于各種類型的集成化PCR載體中，即一塊集成化PCR載體可 W檢測單個或多個樣本，具體樣本量可根據(jù)實際需求與PCR載體的容量來確定。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細菌耐藥性篩查PCR芯片，包括集成化PCR載體和190對(380個)分別用于擴增與細菌耐藥相關(guān)的基因的擴增引物對序列。本發(fā)明的有益效果在于提供了一種細菌耐藥性PCR芯片，采用實時熒光PCR技術(shù)一次檢測170種不同類別的耐藥性因的190個靶點，無須細菌分離、培養(yǎng)，只需2小時即可快速、準確、靈敏地篩查復合樣本中的細菌耐藥性基因。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104531877
【申請?zhí)枴緾N201410856255
【發(fā)明人】雷向東
【申請人】南京安闊醫(yī)療科技有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月31日