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一種酶催化與高溫水解相結(jié)合的制備羥基酪醇的方法與流程

文檔序號:11193076閱讀:769來源:國知局
一種酶催化與高溫水解相結(jié)合的制備羥基酪醇的方法與流程

本發(fā)明涉及生物化學(xué)和醫(yī)藥保健品領(lǐng)域,涉及從天然產(chǎn)物油橄欖葉提取物中制備羥基酪醇的方法,具體為一種酶催化與高溫水解相結(jié)合的制備羥基酪醇的方法。



背景技術(shù):

油橄欖(oleaeuropaeal.)又名齊墩果,屬木犀科木犀欖屬常綠喬木,地中海國家,如西班牙、希臘、意大利、突尼斯等為其集中產(chǎn)地,種植面積約占全球種植面積的95%。我國于20世紀(jì)60年代開始大面積引種油橄欖樹,主要分布在中西部如甘肅、四川等地,面積45萬多畝,共有500多萬株。每摘取100kg的油橄欖果大約可以得到3-5kg的油橄欖葉。目前油橄欖葉一般會被燃燒或作為有機(jī)肥。我國每年因?qū)τ烷蠙鞓溥M(jìn)行維護(hù)剪枝產(chǎn)生的葉子多達(dá)60萬噸。油橄欖葉被丟棄或焚燒,造成資源的浪費及生態(tài)環(huán)境的破壞。而油橄欖葉中含有豐富多樣的酚類化合物,已知的主要功能性成分有簡單酚類化合物、裂環(huán)烯醚萜(橄欖苦苷)和木酚素類三類抗氧化劑。其中油橄欖葉中橄欖苦苷的含量可以達(dá)到10-17%。

羥基酪醇化學(xué)名為3,4-二羥基苯乙醇,分子式c8h10o3,分子量154。它是一種來自橄欖的酚類化合物之一,被認(rèn)為是天然的最強(qiáng)的抗氧化劑之一。羥基酪醇有很強(qiáng)的清除自由基的能力,展現(xiàn)出許多生物學(xué)活性,其中包括抗癌活性、抗炎活性、抗菌活性、抗基因毒性、抗細(xì)胞毒素、預(yù)防高膽固醇、預(yù)防代謝疾病、預(yù)防氧化應(yīng)激、預(yù)防消化紊亂等。

游離的羥基酪醇很少存在于自然界中,以酯化物存在于橄欖各個部位的橄欖苦苷水解后可以得到羥基酪醇。由于其制備工藝較為復(fù)雜,商品的羥基酪醇的價格一般較為昂貴。利用酸、堿制備羥基酪醇時,因為酸、堿水解對設(shè)備的要求高,腐蝕性大,中和麻煩,中和后生成的小分子氯化鈉或硫酸鈣容易吸附小分子的羥基酪醇,使得后續(xù)的分離、純化較為困難。用化學(xué)的方法合成羥基酪醇雖有少量的報道,但合成的成本較高,而且得率較低。因此,通過溫和的酶催化反應(yīng)制備羥基酪醇具有廣泛的前景。cn104926615a中報道了利用半纖維素酶制備羥基酪醇的方法,橄欖苦苷(含量38.6%)的降解率為85.28%,羥基酪醇的含量為6.07%(羥基酪醇的得率相當(dāng)于55.18%)。hamza等利用黑曲霉纖維素酶酶解橄欖葉提取物,羥基酪醇的得率為23.25%。原姣姣等研究了橄欖苦苷(含量81.04%)半纖維素酶解制備羥基酪醇,得到橄欖苦苷的降解率為98.54%,羥基酪醇含量為11.31%(羥基酪醇的得率相當(dāng)于40.31%)。卜文文等采用β-葡萄糖苷酶水解橄欖葉提取物制備羥基酪醇,ht的得率為54.88%。因此,利用生物酶催化技術(shù),提高羥基酪醇的得率方面有很大的提升空間。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

發(fā)明目的:針對利用生物酶催化技術(shù)制備羥基酪醇的過程中,存在得率較低的缺點,本發(fā)明提供了一種酶催化與高溫水解相結(jié)合的制備羥基酪醇的方法,以期獲得較高的橄欖苦苷降解率和較高的羥基酪醇得率。

技術(shù)方案:為實現(xiàn)上述發(fā)明目的,本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:

一種酶催化與高溫水解相結(jié)合的制備羥基酪醇的方法,先以富含β-葡萄糖苷酶(bg)的纖維素酶的用量為10-60fpu/g橄欖苦苷對橄欖苦苷進(jìn)行酶解反應(yīng),然后不經(jīng)處理直接控溫80-100℃繼續(xù)水解24h以上,獲得橄欖苦苷的降解率95%以上,羥基酪醇的得率80%以上的羥基酪醇溶液。

所述的酶催化與高溫水解相結(jié)合的制備羥基酪醇的方法,橄欖苦苷的濃度28-50g/l。

所述的酶催化與高溫水解相結(jié)合的制備羥基酪醇的方法,富含β-葡萄糖苷酶的纖維素酶在50℃,ph值4.8,150rpm的條件下水解1-12h。

所述的酶催化與高溫水解相結(jié)合的制備羥基酪醇的方法,所述的富含β-葡萄糖苷酶的纖維素酶中,β-葡萄糖苷酶酶活(采用pnpg法)與濾紙酶活(按照國際標(biāo)準(zhǔn)iupac法測定)之比不小于25。

所述的酶催化與高溫水解相結(jié)合的制備羥基酪醇的方法,繼續(xù)水解時間在36-48h。

有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明采用酶催化和高溫水解相結(jié)合的方法,從油橄欖葉提取物中制備羥基酪醇,以溫和的酶催化進(jìn)行反應(yīng),酶的用量較少,節(jié)約成本,得到了較高的橄欖苦苷降解率為95%以上,和羥基酪醇得率為80-90%,特別是羥基酪醇的得率獲得顯著提高,為工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1是橄欖苦苷和羥基酪醇標(biāo)準(zhǔn)品的hplc色譜圖;

圖2是50℃不同酶解時間下的橄欖苦苷降解率的變化圖;

圖3是50℃不同酶解時間下的羥基酪醇得率的變化圖;

圖4是不同溫度條件下的工藝結(jié)果圖;

圖5是不同酶用量的工藝結(jié)果圖

圖6是酶解前的色譜圖;

圖7是酶解中的色譜圖;

圖8是酶解后的色譜圖;

圖9是纖維素酶和嗜熱bg酶在不同條件下的橄欖苦苷降解率的變化圖;

圖10是纖維素酶和嗜熱bg酶在不同條件下的羥基酪醇得率的變化圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。根據(jù)下述實施例,可以更好地理解本發(fā)明。實施例中的內(nèi)容僅僅用于說明本發(fā)明,但本發(fā)明不局限于這些實施例。

以下實施例中,橄欖苦苷和羥基酪醇的含量采用hplc測定。色譜條件如下:色譜儀:安捷倫高效液相色譜儀1260;色譜柱:zorbaxeclipse,xdb-c18(250×4.6mm,5μm);檢測器:紫外檢測,波長230nm;流動相:100%甲醇和0.2%磷酸水溶液,采用三段等度洗脫:0-10min,甲醇35%,磷酸水溶液65%,10.1-25min,甲醇55%,磷酸水溶液45%,25.1-30min,甲醇35%,磷酸水溶液65%。流速:0.6ml/min;時間:30min;柱溫:30℃;進(jìn)樣體積:10μl。采用從sigma購買的橄欖苦苷和羥基酪醇的標(biāo)準(zhǔn)品配制成混合溶液,以峰面積為縱坐標(biāo),橄欖苦苷和羥基酪醇的濃度為橫坐標(biāo),得到橄欖苦苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線:峰面積=26691.75*amt-45.38,r2=0.9999(其中amt指橄欖苦苷的濃度),羥基酪醇的hplc標(biāo)準(zhǔn)曲線:峰面積=23320.01*amt+165.40,r2=0.9998(其中amt指羥基酪醇的濃度)。橄欖苦苷和羥基酪醇標(biāo)準(zhǔn)品的hplc色譜圖如圖1所示。

以下實施例中,橄欖苦苷的降解率和羥基酪醇的得率計算如下:oe的降解率%=(1-水解后橄欖苦苷的質(zhì)量/水解前橄欖苦苷的質(zhì)量)*100,羥基酪醇的得率%=水解后羥基酪醇的質(zhì)量/(水解前橄欖苦苷的質(zhì)量*0.285)*100,(其中0.285為羥基酪醇轉(zhuǎn)換為橄欖苦苷的理論轉(zhuǎn)化系數(shù),因為完全降解1mol的橄欖苦苷(540g)可以生成1mol的羥基酪醇(154g),1g的橄欖苦苷得到羥基酪醇的化學(xué)計算值為154/540=0.285g。)

β-葡萄糖苷酶的活力采用pnpg(對硝基苯酚-β-d-葡萄糖苷)試劑測定,0.1ml適當(dāng)稀釋的酶液與0.9ml5mmol/lpnpg溶液(分別預(yù)熱5分鐘)混合后,于50℃下保溫10min。10min后立即加入2ml1mol/lna2co3溶液終止反應(yīng)后,再加入10ml的蒸餾水,搖勻。在400nm下測定吸光度。以0.1ml蒸餾水代替酶液作空白對照。(要做2~3個平行樣,取平均值)。一個β-葡萄糖苷酶酶活力單位定義為,在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下,每分鐘水解生成1μmol對硝基苯酚所需要的酶量。

濾紙酶活采用國際理論和應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(iupac)推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法測定,一個濾紙酶活力的國際單位(fpu)等于在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下每分鐘生成1μmol葡萄糖所需的酶量。

實施例1

取濃度為10.0g/l的橄欖苦苷溶液50ml置于125ml的錐形瓶中,加入10fpu/g橄欖苦苷的富含高活力β-葡萄糖苷酶的纖維素酶(novozyme,β-葡萄糖苷酶酶活與濾紙酶活之比不小于25),50℃酶解12h,然后升高溫度到90℃,繼續(xù)水解36h。酶解結(jié)束后,酶解液在8000r/min離心10min。離心后濾液過0.22μm的濾膜,稀釋后hplc檢測分析,得到橄欖苦苷的降解率為100%,羥基酪醇的得率為88.90%(含量相當(dāng)于2.53g/l)。

實施例2

量取濃度為12.5g/l的橄欖苦苷溶液50ml置于125ml的錐形瓶中,加入60fpu/g橄欖苦苷的富含高活力β-葡萄糖苷酶的纖維素酶(novozyme,β-葡萄糖苷酶酶活與濾紙酶活之比不小于25),50℃酶解12h,然后升高溫度到90℃,繼續(xù)水解36h。酶解結(jié)束后,酶解液在8000r/min離心10min。離心后濾液過0.22μm的濾膜,稀釋后hplc檢測分析,得到橄欖苦苷的降解率為100%,羥基酪醇的得率為83.89%(含量相當(dāng)于2.99g/l)。

實施例3

量取濃度為10.0g/l的橄欖苦苷溶液50ml置于125ml的錐形瓶中,加入50fpu/g橄欖苦苷的富含高活力β-葡萄糖苷酶的纖維素酶(novozyme,β-葡萄糖苷酶酶活與濾紙酶活之比不小于25),50℃酶解1h,然后升高溫度到90℃,繼續(xù)水解47h。酶解結(jié)束后,酶解液在8000r/min離心10min。離心后濾液過0.22μm的濾膜,稀釋后hplc檢測分析,得到橄欖苦苷的降解率為100%,羥基酪醇的得率為82.38%(含量相當(dāng)于2.35g/l)。

實施例4

量取濃度為10.0g/l的橄欖苦苷溶液50ml置于125ml的錐形瓶中,加入40fpu/g橄欖苦苷的富含高活力β-葡萄糖苷酶的纖維素酶(novozyme,β-葡萄糖苷酶酶活與濾紙酶活之比不小于25),50℃酶解12h,然后升高溫度到80℃,繼續(xù)水解36h。酶解結(jié)束后,酶解液在8000r/min離心10min。離心后濾液過0.22μm的濾膜,稀釋后hplc檢測分析,得到橄欖苦苷的降解率為100%,羥基酪醇的得率為83.32%(含量相當(dāng)于2.37g/l)。

實施例5

量取濃度為5.0g/l的橄欖苦苷溶液50ml置于125ml的錐形瓶中,加入40fpu/g橄欖苦苷的富含高活力β-葡萄糖苷酶的纖維素酶(novozyme,β-葡萄糖苷酶酶活與濾紙酶活之比不小于25),50℃酶解12h,然后升高溫度到90℃,繼續(xù)水解24h。酶解結(jié)束后,酶解液在8000r/min離心10min。離心后濾液過0.22μm的濾膜,稀釋后hplc檢測分析,得到橄欖苦苷的降解率為100%,羥基酪醇的得率為84.54%(含量相當(dāng)于1.20g/l)。

實施例6

量取濃度為7.0-12.5g/l的橄欖苦苷溶液50ml置于125ml的錐形瓶中,加入10-60fpu/g橄欖苦苷的富含高活力β-葡萄糖苷酶的纖維素酶(novozyme,β-葡萄糖苷酶酶活與濾紙酶活之比不小于25),50℃酶解1-12h,然后升高溫度到80-100℃,繼續(xù)水解24h以上。酶解結(jié)束后,酶解液在8000r/min離心10min。然后過0.22μm的濾膜,稀釋后,進(jìn)行hplc檢測橄欖苦苷和羥基酪醇的含量。以橄欖苦苷的降解率和羥基酪醇的得率為指標(biāo),獲得50℃不同的酶解時間、不同的溫度、不同的酶用量對橄欖苦苷溶液酶催化和高溫水解結(jié)合制備羥基酪醇的結(jié)果,每次試驗進(jìn)行2次,并取其平均值。

結(jié)果如圖1-8所示。由圖2可知,50℃酶解0.5h、1h、2h、6h、12h后,然后升高溫度繼續(xù)水解,24h時,橄欖苦苷的降解率幾乎一樣。由圖3可知,50℃酶解0.5h、1h、2h、6h、12h后,然后升高溫度繼續(xù)水解,36h后羥基酪醇的得率也基本一致。說明50℃酶解0.5-12h,升高溫度繼續(xù)水解,24h后橄欖苦苷的降解率和36h后羥基酪醇的得率基本一致。由圖4可知,隨著溫度的升高,橄欖苦苷的降解率基本一樣,但是羥基酪醇的得率隨著溫度的升高而增大。由此可知,高溫對于羥基酪醇的形成有利。由圖5可知,當(dāng)纖維素酶用量為2fpu/g橄欖苦苷和4fpu/g橄欖苦苷時,橄欖苦苷降解率和羥基酪醇得率明顯較低。隨著纖維素酶用量的增加,由10fpu/g橄欖苦苷到60fpu/g橄欖苦苷時,橄欖苦苷降解率和羥基酪醇得率基本相同。

圖6-8是纖維素酶酶解橄欖苦苷前后的hplc圖譜。由圖6可以看出,橄欖苦苷溶液富含橄欖橄欖苦苷,其它酚類物質(zhì)含量很少,幾乎不含有羥基酪醇。由圖7可知,酶解過程中,橄欖苦苷顯著降低,生成許多其它的中間產(chǎn)物,此時,羥基酪醇并不是太多。由圖8可知,橄欖苦苷消失,羥基酪醇顯著增加。由此可知,酶解前后物質(zhì)有明顯的變化。

對比例1

量取濃度為7.0-12.5g/l的橄欖苦苷溶液50ml置于125ml的錐形瓶中,分別加入80-120unit/g橄欖苦苷的13種酶(表1),在其最適的溫度下和ph值下,酶解18-30h。酶解結(jié)束后,90℃滅酶5min,酶解液在8000r/min離心10min。然后過0.22μm的濾膜,稀釋后,進(jìn)行高效液相色譜(hplc)檢測橄欖苦苷和羥基酪醇的含量。每次試驗進(jìn)行2次,并取其平均值,結(jié)果如表1和圖9-10所示。

表1酶的種類和來源對油橄欖葉橄欖苦苷酶解效率的影響

由表1可知,13種不同來源的酶在其最適溫度和ph值下,進(jìn)行酶解橄欖苦苷,novozyme纖維素酶酶解時,橄欖苦苷的降解率最高,南京林業(yè)大學(xué)嗜熱β-葡萄糖苷酶酶(bg)解時,羥基酪醇的得率最高。

由圖9可知,novozyme纖維素酶在50℃酶解12h,90℃酶解60h和novozyme在50℃酶解12h,添加南京林業(yè)大學(xué)的嗜熱β-葡萄糖苷酶90℃酶解60h的結(jié)果基本相同,在24h時橄欖苦苷的降解率均能達(dá)到100%。50℃單獨添加novozyme纖維素酶和90℃單獨添加嗜熱β-葡萄糖苷酶的橄欖苦苷降解率均不好。

由圖10可知,50℃單獨添加novozyme纖維素酶和90℃單獨添加嗜熱β-葡萄糖苷酶的羥基酪醇的得率都不高,在50%以內(nèi)。novozyme纖維素酶在50℃酶解12h,90℃酶解60h和novozyme在50℃酶解12h,添加南京林業(yè)大學(xué)的嗜熱β-葡萄糖苷酶90℃酶解60h時羥基酪醇的得率基本相同。所以由圖9-10可知,只需要單獨使用novozyme纖維素酶一種酶,在50℃酶解12h,升高溫度到90℃繼續(xù)水解,效果最好。

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