本發(fā)明涉及生物化學(xué)和醫(yī)藥保健品領(lǐng)域，涉及從天然產(chǎn)物油橄欖葉提取物中制備羥基酪醇的方法，具體為一種酶催化與高溫水解相結(jié)合的制備羥基酪醇的方法。

背景技術(shù)：

油橄欖(oleaeuropaeal.)又名齊墩果，屬木犀科木犀欖屬常綠喬木，地中海國家，如西班牙、希臘、意大利、突尼斯等為其集中產(chǎn)地，種植面積約占全球種植面積的95％。我國于20世紀(jì)60年代開始大面積引種油橄欖樹，主要分布在中西部如甘肅、四川等地，面積45萬多畝，共有500多萬株。每摘取100kg的油橄欖果大約可以得到3-5kg的油橄欖葉。目前油橄欖葉一般會被燃燒或作為有機(jī)肥。我國每年因?qū)τ烷蠙鞓溥M(jìn)行維護(hù)剪枝產(chǎn)生的葉子多達(dá)60萬噸。油橄欖葉被丟棄或焚燒，造成資源的浪費及生態(tài)環(huán)境的破壞。而油橄欖葉中含有豐富多樣的酚類化合物，已知的主要功能性成分有簡單酚類化合物、裂環(huán)烯醚萜(橄欖苦苷)和木酚素類三類抗氧化劑。其中油橄欖葉中橄欖苦苷的含量可以達(dá)到10-17％。

羥基酪醇化學(xué)名為3,4-二羥基苯乙醇，分子式c8h10o3，分子量154。它是一種來自橄欖的酚類化合物之一，被認(rèn)為是天然的最強(qiáng)的抗氧化劑之一。羥基酪醇有很強(qiáng)的清除自由基的能力，展現(xiàn)出許多生物學(xué)活性，其中包括抗癌活性、抗炎活性、抗菌活性、抗基因毒性、抗細(xì)胞毒素、預(yù)防高膽固醇、預(yù)防代謝疾病、預(yù)防氧化應(yīng)激、預(yù)防消化紊亂等。

游離的羥基酪醇很少存在于自然界中，以酯化物存在于橄欖各個部位的橄欖苦苷水解后可以得到羥基酪醇。由于其制備工藝較為復(fù)雜，商品的羥基酪醇的價格一般較為昂貴。利用酸、堿制備羥基酪醇時，因為酸、堿水解對設(shè)備的要求高，腐蝕性大，中和麻煩，中和后生成的小分子氯化鈉或硫酸鈣容易吸附小分子的羥基酪醇，使得后續(xù)的分離、純化較為困難。用化學(xué)的方法合成羥基酪醇雖有少量的報道，但合成的成本較高，而且得率較低。因此，通過溫和的酶催化反應(yīng)制備羥基酪醇具有廣泛的前景。cn104926615a中報道了利用半纖維素酶制備羥基酪醇的方法，橄欖苦苷(含量38.6％)的降解率為85.28％，羥基酪醇的含量為6.07％(羥基酪醇的得率相當(dāng)于55.18％)。hamza等利用黑曲霉纖維素酶酶解橄欖葉提取物，羥基酪醇的得率為23.25％。原姣姣等研究了橄欖苦苷(含量81.04％)半纖維素酶解制備羥基酪醇，得到橄欖苦苷的降解率為98.54％，羥基酪醇含量為11.31％(羥基酪醇的得率相當(dāng)于40.31％)。卜文文等采用β-葡萄糖苷酶水解橄欖葉提取物制備羥基酪醇，ht的得率為54.88％。因此，利用生物酶催化技術(shù)，提高羥基酪醇的得率方面有很大的提升空間。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對利用生物酶催化技術(shù)制備羥基酪醇的過程中，存在得率較低的缺點，本發(fā)明提供了一種酶催化與高溫水解相結(jié)合的制備羥基酪醇的方法，以期獲得較高的橄欖苦苷降解率和較高的羥基酪醇得率。

技術(shù)方案：為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種酶催化與高溫水解相結(jié)合的制備羥基酪醇的方法，先以富含β-葡萄糖苷酶(bg)的纖維素酶的用量為10-60fpu/g橄欖苦苷對橄欖苦苷進(jìn)行酶解反應(yīng)，然后不經(jīng)處理直接控溫80-100℃繼續(xù)水解24h以上，獲得橄欖苦苷的降解率95％以上，羥基酪醇的得率80％以上的羥基酪醇溶液。

所述的酶催化與高溫水解相結(jié)合的制備羥基酪醇的方法，橄欖苦苷的濃度28-50g/l。

所述的酶催化與高溫水解相結(jié)合的制備羥基酪醇的方法，富含β-葡萄糖苷酶的纖維素酶在50℃，ph值4.8，150rpm的條件下水解1-12h。

所述的酶催化與高溫水解相結(jié)合的制備羥基酪醇的方法，所述的富含β-葡萄糖苷酶的纖維素酶中，β-葡萄糖苷酶酶活(采用pnpg法)與濾紙酶活(按照國際標(biāo)準(zhǔn)iupac法測定)之比不小于25。

所述的酶催化與高溫水解相結(jié)合的制備羥基酪醇的方法，繼續(xù)水解時間在36-48h。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用酶催化和高溫水解相結(jié)合的方法，從油橄欖葉提取物中制備羥基酪醇，以溫和的酶催化進(jìn)行反應(yīng)，酶的用量較少，節(jié)約成本，得到了較高的橄欖苦苷降解率為95％以上，和羥基酪醇得率為80-90％，特別是羥基酪醇的得率獲得顯著提高，為工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1是橄欖苦苷和羥基酪醇標(biāo)準(zhǔn)品的hplc色譜圖；

圖2是50℃不同酶解時間下的橄欖苦苷降解率的變化圖；

圖3是50℃不同酶解時間下的羥基酪醇得率的變化圖；

圖4是不同溫度條件下的工藝結(jié)果圖；

圖5是不同酶用量的工藝結(jié)果圖

圖6是酶解前的色譜圖；

圖7是酶解中的色譜圖；

圖8是酶解后的色譜圖；

圖9是纖維素酶和嗜熱bg酶在不同條件下的橄欖苦苷降解率的變化圖；

圖10是纖維素酶和嗜熱bg酶在不同條件下的羥基酪醇得率的變化圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。實施例中的內(nèi)容僅僅用于說明本發(fā)明，但本發(fā)明不局限于這些實施例。

以下實施例中，橄欖苦苷和羥基酪醇的含量采用hplc測定。色譜條件如下：色譜儀：安捷倫高效液相色譜儀1260；色譜柱：zorbaxeclipse，xdb-c18(250×4.6mm,5μm)；檢測器：紫外檢測，波長230nm；流動相：100％甲醇和0.2％磷酸水溶液，采用三段等度洗脫：0-10min，甲醇35％，磷酸水溶液65％，10.1-25min，甲醇55％，磷酸水溶液45％，25.1-30min，甲醇35％，磷酸水溶液65％。流速：0.6ml/min；時間：30min；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：10μl。采用從sigma購買的橄欖苦苷和羥基酪醇的標(biāo)準(zhǔn)品配制成混合溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)，橄欖苦苷和羥基酪醇的濃度為橫坐標(biāo)，得到橄欖苦苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線：峰面積＝26691.75*amt-45.38，r²＝0.9999(其中amt指橄欖苦苷的濃度)，羥基酪醇的hplc標(biāo)準(zhǔn)曲線：峰面積＝23320.01*amt+165.40，r²＝0.9998(其中amt指羥基酪醇的濃度)。橄欖苦苷和羥基酪醇標(biāo)準(zhǔn)品的hplc色譜圖如圖1所示。

以下實施例中，橄欖苦苷的降解率和羥基酪醇的得率計算如下：oe的降解率％＝(1-水解后橄欖苦苷的質(zhì)量/水解前橄欖苦苷的質(zhì)量)*100，羥基酪醇的得率％＝水解后羥基酪醇的質(zhì)量/(水解前橄欖苦苷的質(zhì)量*0.285)*100，(其中0.285為羥基酪醇轉(zhuǎn)換為橄欖苦苷的理論轉(zhuǎn)化系數(shù)，因為完全降解1mol的橄欖苦苷(540g)可以生成1mol的羥基酪醇(154g)，1g的橄欖苦苷得到羥基酪醇的化學(xué)計算值為154/540＝0.285g。)

β-葡萄糖苷酶的活力采用pnpg(對硝基苯酚-β-d-葡萄糖苷)試劑測定，0.1ml適當(dāng)稀釋的酶液與0.9ml5mmol/lpnpg溶液(分別預(yù)熱5分鐘)混合后，于50℃下保溫10min。10min后立即加入2ml1mol/lna2co3溶液終止反應(yīng)后，再加入10ml的蒸餾水，搖勻。在400nm下測定吸光度。以0.1ml蒸餾水代替酶液作空白對照。(要做2～3個平行樣，取平均值)。一個β-葡萄糖苷酶酶活力單位定義為，在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，每分鐘水解生成1μmol對硝基苯酚所需要的酶量。

濾紙酶活采用國際理論和應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(iupac)推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法測定，一個濾紙酶活力的國際單位(fpu)等于在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下每分鐘生成1μmol葡萄糖所需的酶量。

實施例1

取濃度為10.0g/l的橄欖苦苷溶液50ml置于125ml的錐形瓶中，加入10fpu/g橄欖苦苷的富含高活力β-葡萄糖苷酶的纖維素酶(novozyme，β-葡萄糖苷酶酶活與濾紙酶活之比不小于25)，50℃酶解12h，然后升高溫度到90℃，繼續(xù)水解36h。酶解結(jié)束后，酶解液在8000r/min離心10min。離心后濾液過0.22μm的濾膜，稀釋后hplc檢測分析，得到橄欖苦苷的降解率為100％，羥基酪醇的得率為88.90％(含量相當(dāng)于2.53g/l)。

實施例2

量取濃度為12.5g/l的橄欖苦苷溶液50ml置于125ml的錐形瓶中，加入60fpu/g橄欖苦苷的富含高活力β-葡萄糖苷酶的纖維素酶(novozyme，β-葡萄糖苷酶酶活與濾紙酶活之比不小于25)，50℃酶解12h，然后升高溫度到90℃，繼續(xù)水解36h。酶解結(jié)束后，酶解液在8000r/min離心10min。離心后濾液過0.22μm的濾膜，稀釋后hplc檢測分析，得到橄欖苦苷的降解率為100％，羥基酪醇的得率為83.89％(含量相當(dāng)于2.99g/l)。

實施例3

量取濃度為10.0g/l的橄欖苦苷溶液50ml置于125ml的錐形瓶中，加入50fpu/g橄欖苦苷的富含高活力β-葡萄糖苷酶的纖維素酶(novozyme，β-葡萄糖苷酶酶活與濾紙酶活之比不小于25)，50℃酶解1h，然后升高溫度到90℃，繼續(xù)水解47h。酶解結(jié)束后，酶解液在8000r/min離心10min。離心后濾液過0.22μm的濾膜，稀釋后hplc檢測分析，得到橄欖苦苷的降解率為100％，羥基酪醇的得率為82.38％(含量相當(dāng)于2.35g/l)。

實施例4

量取濃度為10.0g/l的橄欖苦苷溶液50ml置于125ml的錐形瓶中，加入40fpu/g橄欖苦苷的富含高活力β-葡萄糖苷酶的纖維素酶(novozyme，β-葡萄糖苷酶酶活與濾紙酶活之比不小于25)，50℃酶解12h，然后升高溫度到80℃，繼續(xù)水解36h。酶解結(jié)束后，酶解液在8000r/min離心10min。離心后濾液過0.22μm的濾膜，稀釋后hplc檢測分析，得到橄欖苦苷的降解率為100％，羥基酪醇的得率為83.32％(含量相當(dāng)于2.37g/l)。

實施例5

量取濃度為5.0g/l的橄欖苦苷溶液50ml置于125ml的錐形瓶中，加入40fpu/g橄欖苦苷的富含高活力β-葡萄糖苷酶的纖維素酶(novozyme，β-葡萄糖苷酶酶活與濾紙酶活之比不小于25)，50℃酶解12h，然后升高溫度到90℃，繼續(xù)水解24h。酶解結(jié)束后，酶解液在8000r/min離心10min。離心后濾液過0.22μm的濾膜，稀釋后hplc檢測分析，得到橄欖苦苷的降解率為100％，羥基酪醇的得率為84.54％(含量相當(dāng)于1.20g/l)。

實施例6

量取濃度為7.0-12.5g/l的橄欖苦苷溶液50ml置于125ml的錐形瓶中，加入10-60fpu/g橄欖苦苷的富含高活力β-葡萄糖苷酶的纖維素酶(novozyme，β-葡萄糖苷酶酶活與濾紙酶活之比不小于25)，50℃酶解1-12h，然后升高溫度到80-100℃，繼續(xù)水解24h以上。酶解結(jié)束后，酶解液在8000r/min離心10min。然后過0.22μm的濾膜，稀釋后，進(jìn)行hplc檢測橄欖苦苷和羥基酪醇的含量。以橄欖苦苷的降解率和羥基酪醇的得率為指標(biāo)，獲得50℃不同的酶解時間、不同的溫度、不同的酶用量對橄欖苦苷溶液酶催化和高溫水解結(jié)合制備羥基酪醇的結(jié)果，每次試驗進(jìn)行2次，并取其平均值。

結(jié)果如圖1-8所示。由圖2可知，50℃酶解0.5h、1h、2h、6h、12h后，然后升高溫度繼續(xù)水解，24h時，橄欖苦苷的降解率幾乎一樣。由圖3可知，50℃酶解0.5h、1h、2h、6h、12h后，然后升高溫度繼續(xù)水解，36h后羥基酪醇的得率也基本一致。說明50℃酶解0.5-12h，升高溫度繼續(xù)水解，24h后橄欖苦苷的降解率和36h后羥基酪醇的得率基本一致。由圖4可知，隨著溫度的升高，橄欖苦苷的降解率基本一樣，但是羥基酪醇的得率隨著溫度的升高而增大。由此可知，高溫對于羥基酪醇的形成有利。由圖5可知，當(dāng)纖維素酶用量為2fpu/g橄欖苦苷和4fpu/g橄欖苦苷時，橄欖苦苷降解率和羥基酪醇得率明顯較低。隨著纖維素酶用量的增加，由10fpu/g橄欖苦苷到60fpu/g橄欖苦苷時，橄欖苦苷降解率和羥基酪醇得率基本相同。

圖6-8是纖維素酶酶解橄欖苦苷前后的hplc圖譜。由圖6可以看出，橄欖苦苷溶液富含橄欖橄欖苦苷，其它酚類物質(zhì)含量很少，幾乎不含有羥基酪醇。由圖7可知，酶解過程中，橄欖苦苷顯著降低，生成許多其它的中間產(chǎn)物，此時，羥基酪醇并不是太多。由圖8可知，橄欖苦苷消失，羥基酪醇顯著增加。由此可知，酶解前后物質(zhì)有明顯的變化。

對比例1

量取濃度為7.0-12.5g/l的橄欖苦苷溶液50ml置于125ml的錐形瓶中，分別加入80-120unit/g橄欖苦苷的13種酶(表1)，在其最適的溫度下和ph值下，酶解18-30h。酶解結(jié)束后，90℃滅酶5min，酶解液在8000r/min離心10min。然后過0.22μm的濾膜，稀釋后，進(jìn)行高效液相色譜(hplc)檢測橄欖苦苷和羥基酪醇的含量。每次試驗進(jìn)行2次，并取其平均值，結(jié)果如表1和圖9-10所示。

表1酶的種類和來源對油橄欖葉橄欖苦苷酶解效率的影響

由表1可知，13種不同來源的酶在其最適溫度和ph值下，進(jìn)行酶解橄欖苦苷，novozyme纖維素酶酶解時，橄欖苦苷的降解率最高，南京林業(yè)大學(xué)嗜熱β-葡萄糖苷酶酶(bg)解時，羥基酪醇的得率最高。

由圖9可知，novozyme纖維素酶在50℃酶解12h，90℃酶解60h和novozyme在50℃酶解12h，添加南京林業(yè)大學(xué)的嗜熱β-葡萄糖苷酶90℃酶解60h的結(jié)果基本相同，在24h時橄欖苦苷的降解率均能達(dá)到100％。50℃單獨添加novozyme纖維素酶和90℃單獨添加嗜熱β-葡萄糖苷酶的橄欖苦苷降解率均不好。

由圖10可知，50℃單獨添加novozyme纖維素酶和90℃單獨添加嗜熱β-葡萄糖苷酶的羥基酪醇的得率都不高，在50％以內(nèi)。novozyme纖維素酶在50℃酶解12h，90℃酶解60h和novozyme在50℃酶解12h，添加南京林業(yè)大學(xué)的嗜熱β-葡萄糖苷酶90℃酶解60h時羥基酪醇的得率基本相同。所以由圖9-10可知，只需要單獨使用novozyme纖維素酶一種酶，在50℃酶解12h，升高溫度到90℃繼續(xù)水解，效果最好。