專利名稱：：糖苷水解酶的變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及糖苷水解酶的變體，其相對(duì)于它的親代酶具有一種或多種改進(jìn)的性質(zhì)，編碼所述變體的核酸，產(chǎn)生所述變體的方法和應(yīng)用所述變體的方法。
背景技術(shù)：
：纖維素是單糖葡萄糖通過(guò)beta-l,4-鍵共價(jià)連接的聚合物。許多微生物產(chǎn)生水解beta-連接的葡聚糖的酶。這些酶包括內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase)、纖維素二糖水解酶(cdlobk)hydrolase)和糖苦水解酶。內(nèi)切葡聚糖酶在隨機(jī)的位點(diǎn)消化纖維素聚合物，打開它以被纖維素二糖水解酶攻擊。纖維素二糖水解酶隨后從纖維素聚合物的末端依次釋放纖維二糖的分子。纖維二糖是葡萄糖的水溶性beta-l，4-連接的二聚體。糖苷水解酶將纖維二糖水解為葡萄糖。纖維素的原料到乙醇的轉(zhuǎn)化具有大量原料的簡(jiǎn)便的可用性、避免燃燒或填埋原料的需要性和乙醇燃料的清潔度的優(yōu)點(diǎn)。將木材、農(nóng)業(yè)殘余物(agriculturalresidue)、草本作物(herbaceouscrop)和城市固體廢物(municipalsolidwaste)作為乙醇生產(chǎn)的原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素(hemicellulose)和木質(zhì)素(lignin)。一旦纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖，所得的葡萄糖容易地通過(guò)酵母發(fā)酵為乙醇。Stahlberg等,1996,J.Mol.Biol.264:337-349,描述了來(lái)自7HcWe畫ree^Z的催化缺陷突變體(catalyticallydeficientmutant)的活性研究和晶體結(jié)構(gòu)。Boer和Koivula,2003，Eur.J.Biochem.270:841-848，公開了以野生型和突變體7Hc/7oArwaree"/纖維二糖水解酶Cel7A研究的熱穩(wěn)定性和最適pH之間的關(guān)系。WO2004/016760公開了//;^ocrea乂econ'""纖維二糖水解酶的變體。在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中，提供具有改進(jìn)的性質(zhì)的糖苷水解酶變體用于將纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化為單糖、二糖和多糖是有利的。改進(jìn)的性質(zhì)包括改變的依賴于-溫度的活性圖譜、熱穩(wěn)定性、pH活性、pH穩(wěn)定性、底物特異性、產(chǎn)物特異性和化學(xué)穩(wěn)定性。本發(fā)明的目的在于提供與它親代酶相比具有改進(jìn)的性質(zhì)的糖苷水解酶的變體。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及親代糖苷水解酶的分離的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代，其中所述的變體具有糖苷水解酶活性。本發(fā)明也涉及具有糖苷水解酶活性的分離的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的一個(gè)或多個(gè)位置不同于SEQIDNO:2的氨基酸1至513,并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置不同。本發(fā)明也涉及分離的核苷酸序列，其編碼所述變體糖苷水解酶或具有糖香水解酶活性的多肽，并涉及包含所述核苷酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)月包。本發(fā)明也涉及在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生親代糖苷水解酶的變體或具有糖苷水解酶活性的多肽的方法。本發(fā)明也涉及獲得親代糖苷水解酶的變體的方法，其包括(a)在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的一個(gè)或多個(gè)位置導(dǎo)入取代，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置導(dǎo)入耳又代，其中所述的變體具有糖普水解酶活性；和(b)回收所述的變體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及將所述的糖苷水解酶用于洗滌劑(detergent)和用于將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的方法。圖1顯示pAJ052的限制性圖譜。圖2顯示pJC106的限制性圖"^普。圖3顯示pAlLol的限制性圖譜。圖4顯示pBANe10的限制性圖譜。圖5顯示pAlLo2的限制性圖鐠。圖6顯示pCW026的限制性圖譜。圖7顯示pNP776G205R的限制性圖譜。圖8顯示pMJ04的限制性圖i普。圖9顯示pMJ06的限制性圖譜。圖10顯示pMJ09的限制性圖鐠。圖11顯示pCW045的限制性圖鐠。圖12顯示pSTM01的限制性圖譜。圖13顯示pSMK03的限制性圖譜。圖14顯示pEJG97的限制性圖譜。圖15顯示煙曲霉(A;^gz'〃^/Mm/ga^s)beta-糖苷酶的基因組DNA序列和推導(dǎo)出的氨基酸序列(分別為SEQIDNOS:56和57)。將預(yù)測(cè)的信號(hào)肽加下劃線而且預(yù)測(cè)的內(nèi)含子用斜體表示。圖16顯示煙曲霉beta-糖苦酶在50°和65。C的熱穩(wěn)定性。圖17顯示煙曲霉beta-糖苷酶在70°C的熱穩(wěn)定性。圖18顯示纖維二糖通過(guò)煙曲霉beta-糖香酶在65°C水解。圖19顯示通過(guò)所述親代7Wc/zoA/w"reew/菌林RutC30和表達(dá)變體776-M57的菌抹的PCS水解的時(shí)程(timecourse)曲線。具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及親代糖苷水解酶的分離的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代，其中所述的變體具有糖苷水解酶活性。定義術(shù)語(yǔ)"糖香水解酶"在本文中定義為由Coutinho,P.M.和Henrissat,B.,1999:Carbohydrate-activeenzymes:anintegrateddatabaseapproach,in"RecentAdvancesinCarbohydrateBioengineering",H丄Gilbert,G.Davies,B.Henrissat和B.Svenssoneds.,TheRoyalSocietyofChemistry,Cambridge,pp.3-12中描述的水解酶。糖苷水解酶的實(shí)例包括，但不限于，纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase)和外切葡聚糖酶(exoglucanase)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的糖苷水解酶屬于由Coutinho，P.M.和Henrissat,B.,1999,見上文，所定義的家族7。術(shù)語(yǔ)"纖維二糖水解酶"在本文中定義為1,4-D-葡聚糖纖維二糖水解酶(E.C.3.2.1.91),其催化纖維素、纖維四糖(cellotetriose)或含有beta-l,4-連接的葡萄糖的任何聚合物中1，4-beta-D-糖苷鍵的水解，從所述鏈的非還原端(non-reducingend)釋放纖維二糖。為了本發(fā)明的目的，根據(jù)由Lever等，1972，Anal.Biochem.47:273-279和由vanTilbeurgh等，1982，F(xiàn)EBSLetters,149:152-156;vanTilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBSLetters,187:283-288描述的方法測(cè)定纖維二糖水解酶活性。在本發(fā)明中，應(yīng)用所述Lever等方法來(lái)評(píng)價(jià)玉米秸稈(comstover)中纖維素的水解，而應(yīng)用vanTilbeurgh等的方法來(lái)根據(jù)發(fā)焚光的二糖衍生物測(cè)定所述的纖維二糖水解酶活性。術(shù)語(yǔ)"內(nèi)切葡聚糖酶，，在本文中定義為內(nèi)-l，4-(l，3;i，4)-beta-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(glucanohydrolase)(E.C.No.3.2.1.4),其催化纖維素、纖維素衍生物(如羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose)和羥乙基纖維素(hydroxyethylcellulose)、地衣淀粉(lichenin)、混合的beta-l，3葡聚糖中beta-l，4鍵如谷類beta-D-葡聚糖或木糖葡聚糖(xyloglucan)和其他含有纖維素組分的植物物質(zhì)中1，4-beta-D-糖香鍵的內(nèi)水解(endohydrolysis)。為了本發(fā)明的目的，根據(jù)Ghose，1987,Pure和Appl.Chem.59:257-268的方法應(yīng)用羧曱基纖維素(CMC)水解測(cè)定內(nèi)切葡聚糖酶活性。術(shù)語(yǔ)"外切葡聚糖酶"在本文中定義為1,4-beta-D-葡聚糖葡糖水解酶(glucohydrolase)(E.C.3.2.1.74),其在1，4-beta-D-葡聚糖中催化1，4-鍵(0-糖基鍵)的水解以去除連續(xù)的葡萄糖或纖維二糖單元。為了本發(fā)明的目的，根據(jù)由Himmel等，1986,J.Biol.Chem.261:12948-12955描述的方法測(cè)定外切葡聚糖酶活性。變體術(shù)語(yǔ)"變體"在本文中定義為包含一個(gè)或多個(gè)改變的糖苷水解酶，所述的改變?nèi)缭谒龆嚯牡囊粋€(gè)或多個(gè)具體位置取代、插入、缺失和/或截?cái)嘁粋€(gè)或多個(gè)具體的氨基酸殘基。野生型酶術(shù)語(yǔ)"野生型"糖苷水解酶表示通過(guò)天然存在的微生物，如天然存在的酵母或絲狀真菌表達(dá)的糖苷水解酶。親代酶本文中應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)"親代"糖苷水解酶指對(duì)其進(jìn)行修飾，例如，取代、插入、缺失和/或截?cái)嘁援a(chǎn)生本發(fā)明的酶變體的糖苷水解酶。此術(shù)語(yǔ)也指與變體進(jìn)行比較和比對(duì)的多肽。所述的親代可為天然存在的(野生型)多肽，或它還可為通過(guò)任何合適的方法制備的變體。例如，所述親代蛋白可為天然存在的多肽的變體，其氨基酸序列已經(jīng)被修飾或改變。親代也可為等位基因變體，其是由占據(jù)相同染色體基因座的基因的兩種或更多替換形式中的任一種所編碼的多肽。重排術(shù)語(yǔ)"重排"指兩個(gè)或更多個(gè)同源核苷酸序列之間的核苷酸序列的重組，其產(chǎn)生重組的核苷酸序列(即，已經(jīng)過(guò)重排循環(huán)的核苷酸序列)，其與起始的核苦酸序列相比具有許多交換的核苷酸。隨機(jī)化的文庫(kù)術(shù)語(yǔ)"隨機(jī)化的文庫(kù)"、"變體文庫(kù)"或"文庫(kù)"在本文中定義為變體多肽的文庫(kù)。變體文庫(kù)中的多樣性可以通過(guò)編碼所述變體的基因在DNA三聯(lián)子水平的突變產(chǎn)生，這樣就使單獨(dú)的密碼子，例如通過(guò)在PCR反應(yīng)中應(yīng)用部分隨機(jī)化的序列的引物多樣化。已經(jīng)描述了幾種方法，由這些方法可以通過(guò)使基因中的幾個(gè)核苷酸位點(diǎn)多樣化并將它們重組，來(lái)創(chuàng)建多種多樣的組合的文庫(kù)，例如，當(dāng)這些位點(diǎn)離得太遠(yuǎn)以至于不能被單一的(摻加的(spiked)或摻雜的(doped))寡核苷酸引物覆蓋。這些方法包括應(yīng)用如在WO97/07205第3頁(yè)，第8至29行所描述的單獨(dú)多樣化的基因節(jié)段的體內(nèi)重組。這些方法也包括應(yīng)用DNA重排方法創(chuàng)建全長(zhǎng)基因的文庫(kù)，其中一些基因節(jié)段:故組合，而且其中每個(gè)節(jié)段可，例如，通過(guò)摻加突變(spikedmutagenesis)(Stemmer,1994,Nature370:389-391;美國(guó)專利5,811,238;美國(guó)專利5,605,793和美國(guó)專利5，830,721)進(jìn)行多樣化?？梢圆捎镁幋a蛋白"骨架，，(野生型親代多肽)的基因作為模板多核苦酸，并將其與一個(gè)或多個(gè)單鏈或雙鏈的寡核苷酸組合，如在WO98/41623和WO98/41622中所描述的。所述的單鏈寡核苷酸可在合成的過(guò)程中進(jìn)行部分的隨機(jī)化。所述的雙鏈寡核苷酸可為在特定區(qū)域摻入多樣性的PCR產(chǎn)物。在兩種情況中，可以用編碼骨架蛋白的序列的對(duì)應(yīng)節(jié)段削弱多樣性，以限制導(dǎo)入變化的平均數(shù)。重組術(shù)語(yǔ)"重組，，在此定義為一種方法，其中核酸在同源的區(qū)域互相連接，在那些序列之間產(chǎn)生鏈內(nèi)DNA交換。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，根據(jù)由Paques和Haber,1999,MicrobiologyandMolecularBiologyReviews63:349-404總結(jié)的步驟，測(cè)定同源重組(homologousrecombination)。"同源重組"在此定義為重組，其中在相對(duì)于輸入核苷酸序列的同源區(qū)域內(nèi)核香酸序列不發(fā)生變化。為了完美的同源重組，所述的區(qū)域應(yīng)含有足夠數(shù)量的核酸，如15至1,500個(gè)-成基對(duì)，優(yōu)選100至1,500個(gè)^威基對(duì)，更優(yōu)選400至1,500個(gè);咸基對(duì)，并最優(yōu)選800至1,500個(gè)堿基對(duì)，其與對(duì)應(yīng)的核酸序列高度同源以增加同源重組的可能性。所述的重組也可通過(guò)非-同源重組(non-homologousrecombination)產(chǎn)生。"非-同源重組"在此定義為重組，其中任何模式的4參入鏈交換的DNA修復(fù)產(chǎn)生不同于任何重組序列的核苷S吏序列。改進(jìn)的性質(zhì)術(shù)語(yǔ)"改進(jìn)的性質(zhì)"在此定義為與變體有關(guān)的特性，其與親代糖苷水解酶相比是改進(jìn)的。這些改進(jìn)的性質(zhì)包括，但不限于，改變的依賴于溫度的活性圖譜、熱穩(wěn)定性、pH活性、pH穩(wěn)定性、底物特異性、產(chǎn)物特異性和化學(xué)穩(wěn)定性。改進(jìn)的熱活性術(shù)語(yǔ)"改進(jìn)的熱活性"在此定義為糖香水解酶變體的依賴于溫度的活性圖i普(profile),相對(duì)于親代糖苷水解酶依賴于溫度的活性圖譜在具體的溫度的改變。所述的熱活性值提供了在溫度范圍內(nèi)水解反應(yīng)的催化進(jìn)行當(dāng)中，酶的效率的測(cè)定方法。糖苷水解酶具有特異的溫度范圍，在所述的范圍中，所述的蛋白是穩(wěn)定的并保持其酶活性，但隨著溫度升高蛋白變得較不穩(wěn)定因而更不活潑。此外，由糖苷水解酶催化的反應(yīng)的初始速率可以通過(guò)升高溫度而加速，其通過(guò)測(cè)定變體的熱活性進(jìn)行測(cè)量。熱活性更高的變體導(dǎo)致水解速率增加，水解需要的時(shí)間減少和/或水解所需的酶濃度減少。可替換地，具有降低的熱活性的變體，可在低于親代酶的最適溫度的溫度催化水解反應(yīng)，所述親代酶的最適溫度由親代依賴于溫度的活性圖譜定義。改進(jìn)的熱穩(wěn)定性術(shù)語(yǔ)"改進(jìn)的熱穩(wěn)定性，，在此定義為在高溫溫育一段時(shí)間之后相對(duì)于親代酶顯示酶活性保留的變體酶。這樣的變體可以或不可以顯示相對(duì)于親代改變的熱活性圖譜，例如，變體可具有相對(duì)于親代的改進(jìn)的能力以在高溫溫育之后進(jìn)行重折疊。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)將在64。C或更高溫度對(duì)于4-甲基織酮-beta-D-乳糖苷(4-methylumbelliferylbeta-D-lactoside)的活性與在50°C、pH5進(jìn)行45分鐘的活性相比時(shí)，所述變體糖苷水解酶的熱活性比野生型變體高至少1.5-倍，優(yōu)選至少2-倍，更優(yōu)選至少5-倍，最優(yōu)選至少7-倍和甚至最優(yōu)選至少20-倍。改進(jìn)的產(chǎn)物特異性術(shù)語(yǔ)"改進(jìn)的產(chǎn)物特異性"在此定義為變體酶顯示相對(duì)于親代改變的產(chǎn)物分布(profile)，其中所述改變的產(chǎn)物分布在給定的應(yīng)用中，相對(duì)于親代改進(jìn)了變體的性能。術(shù)語(yǔ)"產(chǎn)物分布"在此定義為由酶法水解產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物的化學(xué)組合物。改進(jìn)的化學(xué)穩(wěn)定性術(shù)語(yǔ)"改進(jìn)的化學(xué)穩(wěn)定性，，在此定義為在一種或多種化學(xué)品存在的條件下溫育一段時(shí)間后變體酶顯示酶活性保留，所述的化學(xué)品是天然存在的或合成的，其降低親代酶的酶活性。改進(jìn)的化學(xué)穩(wěn)定性也可導(dǎo)致變體在上述化學(xué)品存在的條件下更強(qiáng)的催化反應(yīng)的能力。命名變體的慣例在本發(fā)明中，應(yīng)用了糖苷水解酶變體中氨基酸殘基位置的特殊的編號(hào)方式。例如，通過(guò)比對(duì)已知的糖苷水解酶的氨基酸序列，能夠給任何糖苷水解酶中的任何氨基酸殘基指定氨基酸位置編號(hào)。應(yīng)用發(fā)源于糖苷水解酶的氨基酸序列的編號(hào)系統(tǒng)，所述的糖苷水解酶在SEQIDNO:2中公開，與許多其他的糖苷水解酶的氨基酸序列比對(duì)，能夠顯示在糖苦水解酶的結(jié)構(gòu)同源性的區(qū)域中氨基酸殘基的位置。可以進(jìn)行蛋白序列的多重比對(duì)，例如，應(yīng)用"ClustalW"(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.和Gibson,T丄，1994,CLUSTALW:Improvingthesensitivityofprogressivemultiplesenquencealignmentthroughsenquenceweighting,position-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice,iVwc/e/c爿"'c/siesearch22:4673-4680)。用所述的蛋白比對(duì)作為模板，用來(lái)自所述DNA序列的對(duì)應(yīng)的密碼子替換所述的氨基酸，可進(jìn)行DNA序列的多重比對(duì)。通常采用的配對(duì)序列比較算法足夠檢測(cè)蛋白序列之間的相似性，所述的蛋白序列的差異不超過(guò)大約20-30。/。序列同一性的點(diǎn)(Doolittle，1992，ProteinSci.1:191-200;Brenner等，1998，Proc,Natl.Acad.Sci.USA.95，6073-6078)。然而，具有同樣的折疊和相似的生物學(xué)功能的真正同源的蛋白常常相差到某點(diǎn)，在該點(diǎn)傳統(tǒng)的基于序列的比較不能檢測(cè)到它們的關(guān)系(Lindahl和Elofsson，2000,J.MolBiol.295:613-615)。在基于序列的檢索中，應(yīng)用搜索程序可以獲得更高的敏感性，所述的搜索程序應(yīng)用蛋白家族(分布)的可能的代表物來(lái)搜索數(shù)據(jù)庫(kù)。例如，PSI-BLAST程序通過(guò)迭代的(iterative)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索過(guò)程產(chǎn)生分布，并能夠檢測(cè)關(guān)系疏遠(yuǎn)的同源物(Atschul等，1997,NucleicAcidsRes25:3389-3402)。如果所述目標(biāo)蛋白的家族或超家族在蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中具有一個(gè)或多個(gè)代表物，那么就可以得到更高的敏感性。程序如GenTHREADER(Jones1999，JMol.Biol.287:797-815;McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics19:874-881)應(yīng)用來(lái)自多種來(lái)源的信息(PSI-BLAST、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、結(jié)構(gòu)比對(duì)分布和溶劑化電勢(shì))輸入到神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)查詢序列的結(jié)構(gòu)折疊。同樣地，Gough等，2000,J，Mol,Biol,313:903-919的方法，可用于以SCOP數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的所述超家族的模型來(lái)比對(duì)未知結(jié)構(gòu)的序列。這些比對(duì)可依次用于產(chǎn)生目的蛋白的同源模型，并可采用為此目的開發(fā)的各種各樣的工具評(píng)價(jià)這樣的模型。對(duì)于已知結(jié)構(gòu)的蛋白，幾種工具和資源可用于檢索和產(chǎn)生結(jié)構(gòu)比對(duì)。例如SCOP超家族的蛋白已經(jīng)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)比對(duì)，而且那些比對(duì)是可以得到和可以下載的。這些比對(duì)可用于在結(jié)構(gòu)上和功能上預(yù)測(cè)相同結(jié)構(gòu)的超家族的蛋白中對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基。此信息，連同源自同源建模和分布搜索的信息，當(dāng)從一種蛋白中將目標(biāo)突變移動(dòng)到關(guān)系親近或關(guān)系疏遠(yuǎn)的同源物時(shí)，可用于預(yù)測(cè)對(duì)哪個(gè)殘基進(jìn)行突變。在描述本發(fā)明的多種糖苷水解酶變體時(shí)，應(yīng)用下述的命名法以便參考。在所有的情況中，應(yīng)用了公認(rèn)的IUPAC單字母或三字母氨基酸縮寫。取代.對(duì)于氨基酸取代，采用了如下的命名法[原始氨基酸，位置，取代的氨基酸]。因此，蘇氨酸在位置226用丙氨酸取代記為"Thr226Ala，，或"T226A"。多個(gè)突變通過(guò)加入標(biāo)記("+")分開，例如，"Gly205Arg+Ser411Phe"或"G205R+S411F",代表分別在位置205用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)和在位置411用苯丙氨酸(F)取代絲氨酸(S)。缺失.對(duì)于氨基酸缺失，采用了如下的命名法[原始氨基酸，位置*]。因此，在位置195缺失甘氨酸記為"Glyl95*，，或"G195*"。多個(gè)缺失通過(guò)加入標(biāo)記("+")分開，例如，"Glyl95氺+Ser411"或"G195承+S411承"。插入.對(duì)于氨基酸插入，采用了如下的命名法[原始氨基酸，位置，原始的氨基酸，新插入的氨基酸]。因此，在位置195的甘氨酸之后插入賴氨酸記為"Glyl95GIyLys，，或"G195GK"。多個(gè)修飾.包括多個(gè)修飾的變體加入標(biāo)記("+")分開，例如，"Argl70Tyr+GlyS95GIu"或"R170Y+G195E，，表示為位置170和195分別用酪氨酸和谷氨酸取代精氨酸和甘氨酸。親代糖苷水解酶在本發(fā)明中，所述親代糖苷水解酶是(a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸1至513具有至少70%的同一性；或(b)由核苷酸序列編碼的多肽，所述核苷酸序列在低嚴(yán)緊性條件下與SEQIDNO:1的核苷酸52至1539或其互補(bǔ)鏈雜交。在第一個(gè)方面，所述親代糖苷水解酶包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸1至513具有至少70%,優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%,還更優(yōu)選至少卯％，最優(yōu)選至少95%，并甚至最優(yōu)選至少97%的同一性程度，其具有糖香水解酶活性(在下文中稱為"同源多肽")。為了本發(fā)明的目的，兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度通過(guò)Clustal方法(Higgins,1989,C4BI055:151-153),應(yīng)用具有同一性表和下述多個(gè)比對(duì)參數(shù)的LASERGENETMMEGALIGN丁M軟件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)進(jìn)行確定缺口(gap)罰IO分和缺口長(zhǎng)度罰10分。配對(duì)比對(duì)參數(shù)為Ktuple=l，缺口罰分=3,窗口(window)=5和對(duì)角線(diagonal)-5。基本(substantially)同源的親代糖苷水解酶可具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失或添加。這些改變優(yōu)選較少天然的(minornature),其為如前所述的保守氨基酸取代和不顯著影響所述的蛋白或多肽的三-維折疊或活性的其他取代；通常為1個(gè)至大約30個(gè)氨基酸的小缺失；和氨基-末端或羧基-末端的小延伸，諸如氨基-末端的曱硫氨酸殘基、多達(dá)大約20-25個(gè)殘基的小連接肽或便于純化的小延伸(親和標(biāo)記)，如聚-組氨酸區(qū)(poly-histidinetract),或蛋白A(Nilsson等，1985,五MB(97:4:1075;Nilsson等，1991，Me//zoA五"矽mo/.198:3。也參見,通常，F(xiàn)ord等,1991，/Wd"Ex/re肌'o"a"(i/W折c加'ow2:95-107。保守修飾的實(shí)例是在堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和曱硫氨酸)之內(nèi)的。通常不改變所述比活性的氨基酸修飾在本
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中是公知的，并例如，由H.Neurath和R.L.Hill,1979，772eAcademicPress,NewYork描述。最常發(fā)生的改變?yōu)锳la/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、AWGlu和Asp/Gly以及反向(Taylor,1986,/owrwa/o/J7jeore"ca/Bzo/ogy119:205-218。雖然上述的改變優(yōu)選較少天然的，但是這樣的改變也可為真正天然的，如多至300個(gè)或更多個(gè)氨基酸的較大多肽的融合體作為氨基-末端或羧基-末端的延伸。除了20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸，非標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸(諸如4-羥脯氨酸(4-hydroxyproline)、6-N-曱基賴氨酸(6-N-methyllysine)、2-氨基異丁酸(2-aminoisobutyricacid)、異纈氛酸(isovaline)和alpha-曱基絲氛酸(alpha-methylserine))可取代野生型糖苷水解酶的氨基酸殘基。有限數(shù)目的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然的氨基酸可取代氨基酸殘基。"非天然的氨基酸"已經(jīng)在蛋白合成后經(jīng)過(guò)修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然的氨基酸可以化學(xué)合成，并優(yōu)選商業(yè)上可得到的，而且包4舌六氬吡。定羧酸(pipecolicacid)、遂:哇烷羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氬脯氨酸(dehydroproline)、3-和4-甲基脯氨酸和3,3-二曱基脯氨酸。優(yōu)選地，所述親代糖香水解酶包含SEQIDNO:2的氨基酸序列；或其等位基因變體；或其具有糖苷水解酶活性的片段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述親代多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述親代多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸l至513;或其等位基因變體；或其具有糖香水解酶活性的片段。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述親代多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸l至513。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述親代多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列；或其等位基因變體;或其具有糖苷水解酶活性的片段組成。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述親代多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述親代多肽由SEQIDNO:2的氨基酸1至513或其等位基因變體；或其具有糖苷水解酶活性的片段。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述親代多肽由質(zhì)粒pAJ052中包含的核苷酸序列編碼，所述質(zhì)粒pAJ052包含于大腸桿菌NRRLB-30683，其中所述核酸序列編碼具有糖苷水解酶活性的多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述親代多肽由質(zhì)粒pAJ052中包含的成熟多肽編碼區(qū)(maturepeptidecodingregion)編碼，所述質(zhì)粒pAJ052包含于大腸桿菌NRRLB-30683。SEQIDNO:2的片段是具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的多肽，所述的氨基酸是從此氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端缺失的。優(yōu)選地，片段含有至少450個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少470個(gè)氨基酸殘基，并最優(yōu)選至少490個(gè)氨基酸殘基。在第二個(gè)方面，親代糖苦水解酶由核香酸序列編碼，所述的核苷酸序列在低嚴(yán)緊性條件下，優(yōu)選中嚴(yán)緊性條件，更優(yōu)選中-高嚴(yán)緊性條件，還更優(yōu)選高嚴(yán)緊性條件，并最優(yōu)選非常高嚴(yán)緊性條件下，與核苷酸探針雜交，所述的核苷酸對(duì)采針在相同的條件下與(i)SEQIDNO:1的核苷酸52至1539，(ii)基因組核香酸序列,其包括SEQIDNO:l的核苷酸52至1539,(iii)(i)或(ii)的子序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈雜交(J.Sambrook,E.F,Fritsch,和T.Maniatus,1989,M/ecw/arC7om7g,爿Z^orafer_yMa"wa/,2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1的子序列可為至少100個(gè)連續(xù)的核苷酸，或優(yōu)選至少200個(gè)連續(xù)的核苷酸。而且，所述的子序列可編碼具有糖苷水解酶活性的多肽片段。SEQIDNO:l的子序列，或其同源物，是已經(jīng)從5，-和/或3，-末端缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸的核苦酸序列。優(yōu)選地，子序列包含至少1350個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少1410個(gè)核苷酸，并最優(yōu)選至少1470個(gè)核苷酸。所述親代多肽也可為具有糖苷水解酶活性的多肽的等位的變體，等位的變體意為占據(jù)相同染色體基因座的基因的兩種或更多替換形式中的任一種。等位的變異通過(guò)突變天然地發(fā)生，并可在種群內(nèi)產(chǎn)生多態(tài)性(polymorphism)?；蛲蛔兛梢允浅聊?不改變編碼的多肽)或可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位的變體由基因的等位基因變體編碼。SEQIDNO:l的核苷酸序列或其子序列，以及SEQIDNO:2的氨基酸序列或其片段，可用于設(shè)計(jì)核苦酸探針，以鑒定并從不同屬或種的菌抹中，根據(jù)本
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公知的方法，克隆編碼具有糖苷水解酶活性的親代多肽的DNA。尤其，這樣的探針可用于與目標(biāo)屬或種的基因組DNA或cDNA雜交，然后是標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟，以鑒定并分離在其中對(duì)應(yīng)的基因。這樣的探針可以顯著地短于所述的全序列，但是應(yīng)為至少15個(gè)，優(yōu)選至少25個(gè)，并更優(yōu)選至少35個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。也可采用較長(zhǎng)的探針。DNA探針和RNA探針都可以采用。通常(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin))標(biāo)記所述的探針用于檢測(cè)對(duì)應(yīng)的基因。從這樣的其他生物體制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)可篩選DNA,所述的DNA與上述的探針雜交，并編碼具有糖苷水解酶活性的親代多肽?；蚪MDNA或來(lái)自這樣的其他生物體的其他DNA,可以通過(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其他分離方法進(jìn)行分離?？蓪?lái)自所述文庫(kù)的DNA或分離的了鑒定與SEQIDNO:1或其子序列同源的克隆或DNA，將所述的載體材料用于Southern印跡。為了本發(fā)明的目的，雜交表示所述的核苷酸序列，在低嚴(yán)緊性條件至非常高嚴(yán)緊性條件下，與標(biāo)記的核苷酸探針雜交，所述的核苦酸探針對(duì)應(yīng)于在SEQIDNO:l中顯示的核苷酸序列，其互補(bǔ)鏈，或其子序列。所述探針與之雜交的分子可以應(yīng)用，例如，X射線膠片(X-myfilm)或任何其他本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的4企測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的核苷酸探針是核苷酸序列，其編碼SEQIDNO:2的多肽，或其子序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的核苦酸探針是SEQIDNO:l。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的核苷酸探針是SEQIDNO:1的核普酸52至1539。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的核苷酸探針是質(zhì)粒pAJ052中包含的核酸序列，所述質(zhì)粒pAJ052包含于大腸桿菌NRRLB-30683,其中所述核酸序列編碼具有糖苷水解酶活性的多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核苷酸探針是質(zhì)粒pAJ052中包含的成熟多肽編碼區(qū)，所述質(zhì)粒pAJ052包含于大腸桿菌NRRLB-30683。對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸長(zhǎng)探針，低嚴(yán)緊性條件至非常高嚴(yán)緊性條件定義為，在42。C,在5xSSPE、0.3%SDS、200昭/ml剪切的和變性的鮭精DNA,對(duì)于低嚴(yán)緊性25%曱酰胺，對(duì)于中和中-高嚴(yán)緊性35。/。曱酰胺，對(duì)于高和非常高嚴(yán)緊性50%甲酰胺中，進(jìn)行預(yù)雜交和雜交，然后是標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟，其最優(yōu)進(jìn)行12至24小時(shí)。對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，所述的載體材料最終用0.2xSSC，0.2%SDS,優(yōu)選至少在5(TC(低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在55。C(中嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在6(TC(中-高嚴(yán)緊性)，最優(yōu)選至少在65t:(高嚴(yán)緊性)，并甚至最優(yōu)選至少在70。C(非常高嚴(yán)緊性)洗滌三次，每次15分鐘。對(duì)于長(zhǎng)度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，嚴(yán)緊性條件定義為在比用Bolton和McCarthy(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48:1390)計(jì)算得出的Tm低5。C至10。C,在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA,0.5%NP-40,1x登哈特溶液(Denhardt'ssolution),1mM焦石粦酉交4內(nèi)(sodiumpyrophosphate),1mM石粦臥支二氪#)(sodiummonobasicphosphate),0.1mMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌(washingpost-hybridization),然后是標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟，其最優(yōu)進(jìn)行12至24小時(shí)。對(duì)于長(zhǎng)度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，所述載體材料在6xSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，并用6xSSC在低于計(jì)算的Tm5。C至l(TC洗滌兩次，每次15分鐘。所述親代糖苦水解酶可從任何屬的微生物得到。為了本發(fā)明的目的，本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)"從...中得到"連同給出的來(lái)源，可指由核苦酸序列編碼的親代糖苷水解酶通過(guò)所述的來(lái)源或通過(guò)細(xì)胞產(chǎn)生，在所述的細(xì)胞中已經(jīng)插入來(lái)自所述來(lái)源的核苦酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述親代糖苦水解酶是分泌到細(xì)胞外的。親代糖苷水解酶可為真菌糖苷水解酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的真菌糖苷水解酶是酵母糖普水解酶，諸如念珠菌屬(OwA^)、克魯維酵母屬(A7i(yvera附;/cay)、畢赤酵母屬(戶/cA/")、糖酵母屬(5"acc/Mr。，cay)、裂殖酵母屬OSW^oacc/arow)/c&y)或Kjttok^糖脊水解酶。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的真菌糖苷水解酶是絲狀真菌糖苷水解酶，諸如枝頂孢霉屬(y4cre附o"/w附)、廢蒜屬^4ga〃.cM"、鏈格孑包屬(」〃er"an'(3)、曲審屬(^5/erg77/^s)、葡萄座腔菌屬(j8o^yo5paen'fl)、Cen)wn'o/wi、C7zaeto/w'c//M/77、麥角屬(C7av/ceps)、旋孑包腔菌屬(Coc/7//060/1^)、Co/W"o/wj^、Co/to^"mes、Cbz-y"asciw、0_y//20"ec/n.fl、色二孑包屬(￡)^/<%//)、黑耳屬(&aW/'a)、鐮孑包屬(Fz^ar/ww)、赤霉屬((7ZZ^e/^〃a)、Z7o/omaWgoto/血s、腐質(zhì)霉屬(/7ww/co/a)、耙菌屬(/z7ex)、丄ew/z力w/a、丄epfaspaen'a、Tl/agwapo/^/2e、A/e/a"ocfl^pzis、_/kfenjp//^s、纟殳絲霉屬(Afyce//o//^/jora)、月永孑包菌屬(A^wos/ora)、青霉屬(尸em'c/〃z'wwz)、尸/zawerac/wee、PmYras/a、々i黑盤菌屬(尸sej^o//ectom'a)、尸seM^on'c/zowymp/w、才艮毛霉屬(7/n'zomwcor)、柱頂孢屬(Sqyto/Wwm)、3果節(jié)菌屬(ra/aramyces)、嗜熱子嚢菌屬(77ze削oasc—、77H'e/av/a、木霉屬(7h.c/iocferma)、長(zhǎng)毛盤菌屬(7Hc/iopAaea)、輪枝孢屬(7e"/cz7^m)、Ko/van'eZ/a(小包腳菇屬)或炭角菌屬(Xy/an'a)糖苷水解酶。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述親代糖苷水解酶是卡爾酵母OSacc/^ww^c"ca廠/^6erge"^/s)、面良酒酉孝^"(5"acc/2fl廠om少cesce廠ev/57'ae)、4唐4匕S^^(5^cc/2aromycesd/ay她'cw"、Sacc/7ar歸jFce9fifowg/as77、克魯弗酵母(&cc/zaram少cesA:/w"e〃')、諾地酵母(iSacc/7"ra"^yce51mr6em7》或卵形糖酵母(Sflcc/wrawycey,yb/-m&J糖苷水解酶。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代糖苷水解酶是Arewo"^wce〃w/o/,'cz^、棘孑包曲霉(y45perg77/wacw/eato)、泡盛曲霉(A/7ez-g,〃w5awawon')、^因曲零(J5/erg7'〃iw/wm/gaft^)、臭曲審(y^/erg7'〃z^ybe/z'(ii^)、步因曲審(^^/^g7'〃z^/wm/ga^s)、日本曲霉(v45^erg〃/w"fl/om'cttf)、構(gòu)巢曲霉C^perg7'〃z^s剛V/w/am1)、黑曲霉(/ls/erg7.〃i^m.ger)、米曲霉(A/erg飾so，fle)、桿孑包狀嫌孑包(Fwrar/謂6a"nV^'o/cfes)、FMsan'wncerea/z'51、尸wsan'w"7crooAwe〃erae、大刀鐮孑包(Fksan'MWcw/morMm)、禾本牙牛鐮孑包(F"san'MWgmmz'"earwm)、禾赤鐮孑包(F"son'wwgram/"MW)、異孑包鐮孑包(Fwsan'Mm/^Zwcw/oram)、合7欠木鐮孑包(F"sar/wmegww//)、尖鐮孑包(Fwran'wwox_y5/wn/w)、多枝鐮孑包(Fwsan'wmrWcw/a&w)、粉纟工鐮孑包(Fw^sw7'wmrayeww)、才妄骨木鐮孑包(Fws(2n'wm6w^wcz'"ww)、月夫色鐮孑包(Fz^"n'wmsarcoc/wx^w)、腐皮鐮孑包(Fwsa〃'wmso/am')、擬、分斗支孑包鐮孑包(Fwan'wmfn'c/zo^^c/oz'^/es、尸wsan'wwve"ewafww、灰腐質(zhì)審(Z/wm/co/agr/sea)、//wm/co/a//iso/em1、//w附/co/a/a"wgz'"osa、乳白把菌(T/pex/ac&w)、米黑毛霉(7Wwcorw/e/ze/)、嗜熱毀絲霉(鄉(xiāng)ce/Zop楊ora*r,pM<a)、粗糙脈孑包菌(臉w觸;70racrassa)、纟電4大青霉(尸ew.cz7/iwm/Mm'cw/osw/w)、產(chǎn),，青霉(Pew'"7/^w/wrpwrage"wm)、戶/a"erac/2aefec/z;^yos/on.Mm、裂4習(xí)菌(5b/n.zop/z少〃wwc畫mw"e)、齊整小核菌(Sc/era"謂ro^7'z.)、5^wofrz'c/應(yīng)ce〃w/o/M訓(xùn)、ra/arawycese附ersow7、土生氺炎孑包霉(r/z/e/av/afe/resfn'"、THc/zoderma/zarz/a"wm、康亍木審(7>&/20<^6/70A:o"/wgz.0、7h.c/zocferma/owg/6rac/z/afwm、或綠色木霉(7Hc/ic^ermaviW&)糖苷水解酶。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的親代糖香水解酶是7Hc/20cfemw"e"/糖苷水解酶，并最優(yōu)選SEQIDNO:2的7Wc/w&rmaree化/纖維二糖水解酶I或其成熟多肽。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的親代糖苷水解酶由質(zhì)粒pAJ052中包含的核苷酸序列編碼，其中所述的質(zhì)粒pAJ052包含于大腸桿菌NRRLB-30683,其中所述核苷酸序列編碼具有糖苷水解酶活性的多肽。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的親代糖普水解酶由質(zhì)粒pAJ052中包含的成熟多肽編碼區(qū)編碼，其中所述的質(zhì)粒pAJ052包含于大腸桿菌NRRLB-30683。可以理解，對(duì)于上迷的菌種而言，本發(fā)明包括其完全階段和不完全階段(perfectandimperfectstates),和其他分類學(xué)的等同物，例如，無(wú)性型(anamorph)，而不管它們已知的種名。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易地辨別適當(dāng)?shù)牡韧锏耐恍?。這些菌種的菌林容易地被公眾在許多培養(yǎng)物保藏中心獲得，諸如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物禾口纟田胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammiungvonMikroorganismenundZellkuiturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection),NorthernRegionalResearchCenter(NRRL)。所述親代糖苷水解酶也可從其他來(lái)源鑒定和獲得，所述的來(lái)源包括從自然(例如，土壤、堆肥(compost)、水等)分離的微生物或直接從天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)應(yīng)用上述的探針得到的DNA樣品。直接從天然的生活環(huán)境(habitat)分離微生物和DNA的方法是本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的。編碼糖苷水解酶的核苦酸序列于是可通過(guò)同樣地篩選另一種微生物的cDNA文庫(kù)或混合的DNA樣品得到。一旦用本文所述的合適的探針探測(cè)到編碼糖香水解酶的核苦酸序列，該序列可通過(guò)應(yīng)用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所公知的方法進(jìn)行分離或克隆(參見，例如，J.Sambrook，E.RFritsch,和T.Maniatus,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)。如在此定義的，"分離的"糖苷水解酶是基本上無(wú)其他非-糖苷水解酶多肽的多肽，例如，至少大約20%純度，優(yōu)選至少大約40%純度，更優(yōu)選大約60%純度，還更優(yōu)選大約80%純度，最優(yōu)選大約90°/。純度，和甚至最優(yōu)選大約95%純度，如通過(guò)SDS-PAGE所測(cè)定的。所述親代糖芬水解酶也可包括融合的多肽或可切割的融合多肽，其中另一種多肽融合于所述多肽或其片段的N-末端或C-末端。融合的多肽是通過(guò)將編碼另一種多肽的核苦酸序列(或其一部分)融合于本發(fā)明的核苷酸序列(或其一部分)來(lái)產(chǎn)生。產(chǎn)生融合多肽的方法是本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的，并包括將編碼所述多肽的編碼序列連接，以使它們位于框架中，并在同樣的啟動(dòng)子和終止子的控制下表達(dá)所述融合的多肽。融合蛋白也可應(yīng)用內(nèi)蛋白(intein)方法構(gòu)建，其中融合是在翻譯后產(chǎn)生的(Cooper等，1993，EMBOJ12:2575-2583;Dawson等，1994，Science266:776-779)。親代糖苷水解酶的基本氨基酸可根據(jù)本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的方法，諸如定位突變(site-directedmutagenesis)或丙氨酉菱-才3突變(alanine-scanningmutagenesis)進(jìn)行鑒定(Cunningham和Wells,1989，Science244:1081-1085)。在后一種方法中，單一丙氨酸突變?cè)诜肿又械拿總€(gè)殘基引入，并測(cè)定得到的突變分子的生物活性(即，糖苦水解酶活性)以鑒定對(duì)于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。也參見，Hilton等，1996，J.BiolChem.271:4699-4708。所述酶或其他生物相互作用的活性位點(diǎn)也可以通過(guò)結(jié)構(gòu)的物理分析進(jìn)行測(cè)定，如通過(guò)核磁共振(nuclearmagneticresonance)、結(jié)晶學(xué)(crystallography)、電子衍射(electrondiffraction)或光親和標(biāo)記(photoaffinitylabeling)這才羊的方法，連同突變推定的接觸位點(diǎn)氨基酸進(jìn)行測(cè)定。參見，例如，deVos等，1992,5We/ce255:306-312;Smith等，1992，Mo/.說(shuō)o/.224:899-904;Wlodaver等，1992,309:59-64?；景被岬耐恍砸部捎膳c本發(fā)明的多肽相關(guān)的多肽的同一性分析進(jìn)行推斷?？蛇M(jìn)行單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，并應(yīng)用已知的突變、重組和/或重排方法，繼之以相關(guān)的篩選步驟進(jìn)行枱r測(cè)，所述的篩選步驟諸如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,S"'e"ce241:53-57;Bowie和Sauer，1989，Prac編^cad5b/86:2152-2156;WO95/17413或WO95/22625所公開的。其他可以采用的方法包括易錯(cuò)PCR(error-pronePCR)、噬菌體展示(phagedisplay)(例如，Lowman等，1991，Biochem.30:10832-10837;美國(guó)專利No.5,223,409;WO92/06204)和區(qū)域定點(diǎn)突變(region-directedmutagenesis)(Derbyshire等，1986,Gene46:145，Ner等，1988，DNA7:127)。質(zhì)粒用于制備糖苷水解酶變體的一種或多種質(zhì)?？蔀榻?jīng)過(guò)重組DNA步驟的任意質(zhì)粒或載體。包括編碼糖苷水解酶的核苷酸序列的質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)將所述的核香酸序列連接到合適的質(zhì)粒中，或通過(guò)其他合適的方法進(jìn)行制備。所述的質(zhì)粒優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)在此描述的可選擇的標(biāo)記(selectablemarker),其允許容易地篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。質(zhì)粒的選擇常常依賴于它將導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明中，所述的質(zhì)粒可為一種自主復(fù)制(autonomousreplication)的質(zhì)粒，即，作為染色體外的(extmchromosomal)實(shí)體而存在的質(zhì)粒，它的復(fù)制與染色體的復(fù)制有所區(qū)別。所述質(zhì)粒復(fù)制子可為任何質(zhì)粒復(fù)制子，其介導(dǎo)在細(xì)胞中發(fā)揮功能的自主復(fù)制。術(shù)語(yǔ)"質(zhì)粒復(fù)制子"在本文中定義為能使質(zhì)粒或載體在體內(nèi)復(fù)制的序列。在酵母細(xì)胞中有用的質(zhì)粒復(fù)制子的實(shí)例是復(fù)制的2孩i米起點(diǎn)(2micronorigin)、ARS1、ARS4、ARS1與CEN3的組合，及ARS4與CEN6的組合。在絲狀真菌細(xì)胞中有用的質(zhì)粒復(fù)制子的實(shí)例是AMA1和ANSI(Gems等,1991,G匿98:61-67;Cullen等，1987,A^c/e/d油/e濯rc/215:9163-9175;WO00/24883)。根據(jù)在WO00/24883中公開的方法，可以實(shí)現(xiàn)AMA1基因的分離和包含該基因的質(zhì)?；蛟泽w的構(gòu)建。所述質(zhì)粒的線性化(linearizing)可以定向到所述質(zhì)粒中的任何位點(diǎn)。所述質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)本
技術(shù)領(lǐng)域：
所公知的任何合適的方法線性化，例如，以一種或多種限制酶消化。所述質(zhì)粒的線性化的末端可以用核苦酸填充，如由Pompon等，1989,Gene83:15-24所描述的。然而，當(dāng)它可以產(chǎn)生移碼(frameshift)時(shí)，優(yōu)選不填充所述的線性化的末端。為了簡(jiǎn)化篩選方法，所述質(zhì)粒優(yōu)選為表達(dá)載體，其中所述的核苷酸序列可操作地連接于DNA轉(zhuǎn)錄所需的附加區(qū)段。通常，所述表達(dá)載體源自質(zhì)粒、粘粒(cosmid)或噬菌體(bacteriophage)，或可以包含元件中的任一種或所有這些元件。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)"質(zhì)粒，，和"載體，，可以互換地采用。DNA片段與線性化的質(zhì)粒的同源區(qū)通過(guò)體內(nèi)重組隨機(jī)組合(或"重排")的DNA片段的文庫(kù)，可以通過(guò)任何合適的方法進(jìn)行制備。例如，所述的DNA片^殳可以通過(guò)包含所述核苷酸序列的質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增(例如，易錯(cuò)PCR),應(yīng)用特異性引物進(jìn)行制備，例如，如在美國(guó)專利No.4,683,202或Saiki等，1988,5Wewce239:487-491中所描述的。所述的DNA片段也可從包含所需的核苷酸序列的質(zhì)粒中通過(guò)用限制酶消化進(jìn)行分離，然后再應(yīng)用例如，電泳進(jìn)行分離。所述的DNA片段可替換地，可以通過(guò)已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法合成制備，例如，由Beaucage和Camthers，1981,7^ra/zedra"Le股^22:1859-1869描述的亞磷酰胺(phosphoamidite)方法，或由Matthes等，1984,JoM,"a/3:801-805描述的方法。根據(jù)亞磷酰胺方法，在自動(dòng)DNA合成儀上合成寡核苷酸，純化、退火、連接，并克隆入合適的質(zhì)粒。所述的DNA片段也可為合成DNA與基因組DNA混合來(lái)源的、合成DNA與cDNA混合來(lái)源的，或基因組DNA與cDNA混合來(lái)源的，其通過(guò)將合成DNA、基因組DNA或cDNA來(lái)源的片段連接而制備，所述的片段依照標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)應(yīng)于全部核香S吏序列的各個(gè)部分。DNA片段的文庫(kù)包括所述核苷酸序列的一個(gè)或多個(gè)突變，其中所述的片段包括至少兩種區(qū)域，一個(gè)或多個(gè)與線性化的核苷酸序列和/或質(zhì)粒序列的缺口的5，-區(qū)或3'-區(qū)同源的區(qū)域，和一個(gè)或多個(gè)與所述文庫(kù)的DNA片段的5，-區(qū)或3，-區(qū)同源的第二區(qū)域。所述DNA片段的區(qū)域可為與所述的核苷酸序列和/或質(zhì)粒序列同源的任何序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述DNA片段的區(qū)域?yàn)閭?cè)翼與編碼糖苷水解酶的基因相連的5，-區(qū)和/或3，-區(qū)；或編碼糖苷水解酶的基因的5，-區(qū)和/或3，-區(qū)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的一個(gè)或多個(gè)DNA片段在導(dǎo)致低、中或高隨機(jī)突變頻率的條件下制備。為了獲得低突變頻率，所述的核苷酸序列(包括所述的DNA片段)可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增方法制備(US4,683,202或Saiki等，1988,Sc/e"ce239:487-491)。中或高突變頻率可以通過(guò)在降低通過(guò)熱穩(wěn)定的聚合酶復(fù)制的保真度，和增加核苷酸的錯(cuò)誤摻入的條件下實(shí)施PCR擴(kuò)增獲得，例如，由Deshler，1992,9:103-106;Leung等,1989歷orec/zm々wes1:11-15所描述的。所述的PCR擴(kuò)增可應(yīng)用合適的物理或化學(xué)誘變劑(mutagenizingagent)與突變步驟組合，所述的誘變劑例如誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化(transition)、顛換(transversion)、倒位(inversion)、混亂(scrambling)、在夾失和/或插入的i秀變劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將進(jìn)行重排的DNA片段優(yōu)選具有大約15bp至8kb的長(zhǎng)度，更優(yōu)選大約30bp至6kb，還更優(yōu)選大約40bp至6kb，還更優(yōu)選大約80bp至4kb,并最優(yōu)選大約100bp至2kb,以能夠與線性化的質(zhì)粒最優(yōu)地相互作用。真菌細(xì)胞將質(zhì)粒/片段核苷酸序列的混合物導(dǎo)入其中的真菌細(xì)胞，可為本發(fā)明中有用的任何真菌細(xì)胞。"重組真菌細(xì)胞"在本文中定義為能夠介導(dǎo)大量同源核苷酸序列重排的細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的真菌重組細(xì)胞是酵母細(xì)胞。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的酵母重組細(xì)胞是念珠菌屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、糖酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉(Yarrowia)細(xì)胞。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的酵母重組細(xì)胞是乳酸克魯維酵母(K/Myveromycey/acto)、卡爾酵母、酉良酒酵母、4唐4b酵母、Sacc/wramycesdowg/os7',、克魯弗酵母、諾地酵母、<Sacc/wr。w_ycesovz/o，/s或Jb/rowZa/fj%>/_y"ca細(xì)月包。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的真菌重組細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌重組細(xì)胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬、脈孢菌屬、青霉屬、Thielavia、Tolypocladium或木霉屬細(xì)胞。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌重組細(xì)胞是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌重組細(xì)胞是桿孢狀鐮孢、尸z^flr/wm、尸wsan'wwcroc^we/Zem^,大刀鐮孑包、禾本:f+鐮孑包、Fw"Wwwg廠"w/www、異孑包鐮孑包、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孑包錄孑包、Fz^iar/匿to妙"w,、FiWJY7n',、Wc/w/Zzec/oz'^fey或F^"/7'MWve"ewa/MW細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌重纟且細(xì)月包是//wm/co/aZ"so/e"s、//iwn'co/a/a"wg/"osa、米黑毛霉(A/wcorm/e/ze0、嗜熱毀絲霉(M7cW0//^0raAenwo;^//"),粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、土生才炎孑包霉、7Hc/zode7'ma/zarz/a"wm、康寧木霉、7Hc/70(ierma/owg/6n3c/z/a^m、7z'c/z。(ier附are^sez'或鄉(xiāng)錄色木審纟田月包。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的曲霉細(xì)胞是米曲霉細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的曲霉細(xì)胞是黑曲霉細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述的^FksaWwmve"ewamm細(xì)月包是尸^y"n'"wve"e加/w/wA3/5，其起初作為禾本科鐮孢ATCC20334保藏，并最近由Yoder和Christianson,1998，F(xiàn)wwga/Gewe^s5z'o/ogy23:62-80和O'Donnell等,1998,Fw"ga/Ce"e".csa"t/B/o/ogy23:57-67重分類為Fiwan'wmveMe"a加m;以及/^san'wwvewe"atow的分類學(xué)等同物,而不管它們普遍,i^知的種名。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的尸wan^mve"e朋/ww細(xì)胞是T^iwan,Mmve"ewafM加A3/5或■FMsar/wwveweMafMmATCC20334^(/形'態(tài)哭哭體(morphologicalmutant),如在WO97/26330中公開的。真菌細(xì)胞可通過(guò)包括形成原生質(zhì)體、轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體和以本身已知的方式再生細(xì)胞壁的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的合適的步驟在EP238023禾口Yelton等,1984,iVoceW"gso///zeiV加'o"a/^cacfemy0/5We"cey[75^81:1470-1474中描述。轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適的方法由Malardier等，1989，Ge"e78:147-156和WO96/00787描述。酵母可以應(yīng)用由Becker和Guarente，/"Abelson,J.N.和Simon,M.I.,,editors,GWdeto腸WGe"e"cs和M/ecw/(3r她Ao(iy/"E"z戸o/ogy，Volume194,pp182-187,AcademicPress,Inc.,NewYork;Ito等,1983,Towma/o/J5a"e7'/o/ogy153:163和Hinnen等,1978，/Vocee^"g51o/Ae7Va"o朋/Jcaofem_y0/6b/e"cesC/5L475:1920中描述的步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)化。體內(nèi)重組可以將大量的變體或同源基因組合在一個(gè)轉(zhuǎn)化中，以有效地從同源基因中產(chǎn)生基因嵌合體(genechimera)。重排這些基因、編碼改進(jìn)的變體、野生型基因或其組合，產(chǎn)生能夠表達(dá)的嵌合體，然后通過(guò)篩選應(yīng)用有益突變的最優(yōu)組合以鑒定那些嵌合體。此方法將所能得到的進(jìn)一步改進(jìn)的變體的數(shù)量，與只應(yīng)用隨機(jī)突變的方法相比增加了多-倍(為了回顧，參見Kuchner和Arnold,1997，7TBrec/715:523-530)。隨機(jī)突變將突變導(dǎo)入目標(biāo)核苷酸序列，產(chǎn)生的有害突變(deleteriousmutation)比有益突變更多。這樣的突變循環(huán)輪(iterativeround)中，有害突變比有益突變積累得更快，在篩選的過(guò)程中顯著地屏蔽了有益突變的鑒定。兩個(gè)或多個(gè)在它們的核苷酸序列中含有多個(gè)單核苷酸改變的同源核苷酸序列，它們之間的隨機(jī)重組可能允許所有那些包含在一個(gè)變體中的核苷酸改變，所述的變體將從彼此分離并被替換與存在于其他變體的任何突變隨機(jī)組合。這種突變的重排提供了一種方法，通過(guò)此方法來(lái)自不同親代序列的突變可以相互隨機(jī)組合，以增加在單核苷酸序列中組合核苷酸改變的可能性。突變/重排方法可與高產(chǎn)量、自動(dòng)化的篩選方法組合，以檢測(cè)由宿主細(xì)胞表達(dá)的、克隆的、突變的多肽的活性。編碼活性多肽的突變的DNA分子可以應(yīng)用本
技術(shù)領(lǐng)域：
的標(biāo)準(zhǔn)方法從宿主細(xì)胞中回收并快速地測(cè)序。這些方法允許快速檢測(cè)目標(biāo)多肽中重要的單個(gè)氨基酸殘基，并可應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。應(yīng)用體內(nèi)重組方法有效重組多個(gè)重疊片段，是從變體或同源基因產(chǎn)生嵌合體的方法。小如15bp的重疊部分對(duì)于重組是足夠的，并可以應(yīng)用于甚至是關(guān)系疏遠(yuǎn)的基因的非常簡(jiǎn)單的區(qū)域重排。在區(qū)域重排中，非-同源DNA的優(yōu)選至少一個(gè)重排循環(huán)是與初始應(yīng)用的一個(gè)或多個(gè)DNA片段進(jìn)行的回交循環(huán)(backcrossingcycle),所述的DNA片段可為野生型DNA片段。這就消除了不重要的(non-essential)突變。不重要的突變也可以通過(guò)應(yīng)用野生型DNA片段作為初始應(yīng)用的輸入DNA材料進(jìn)行消除。兩段以上的核苷酸序列可以同時(shí)重排，而且其優(yōu)勢(shì)在于可以快速地制備大量完全不同的變體，而不需增加循環(huán)步驟。當(dāng)從同樣的區(qū)域重組多個(gè)片段時(shí)，所述片段的多個(gè)重疊部分會(huì)自動(dòng)地增加DNA互換的頻率，但同樣重要的是在重疊區(qū)具有相對(duì)大量的隨機(jī)交換體(mndomcrossover),以重新組合位置接近的變體/差異。兩個(gè)片段之間小如15bp的重疊部分足夠得到有效的重組。因此，在15至5000bp范圍內(nèi)的重疊，優(yōu)選30bp至500bp，尤其是30bp至100bp是適于本發(fā)明的。在本發(fā)明中，優(yōu)選兩段或更多的重疊片段，更優(yōu)選2至50個(gè)重疊片段，并最優(yōu)選2至IO個(gè)重疊片段，可有利地用作重排循環(huán)中的DNA片4殳。除了允許產(chǎn)生嵌合體基因，應(yīng)用重疊片段是區(qū)域重排的有用的方法，所述的區(qū)域重排是通過(guò)在來(lái)自不同區(qū)域的DNA片段之間產(chǎn)生小的重疊部分，并篩選其最優(yōu)的組合來(lái)進(jìn)行的。例如，在3個(gè)DNA片段的情況中，所述的重疊區(qū)域可為如下第一個(gè)片段的第一個(gè)末端與所述線性化的質(zhì)粒第一個(gè)末端重疊，第二個(gè)片段的第一個(gè)末端與第一個(gè)片段的第二個(gè)末端重疊，而且第二個(gè)片段的第二個(gè)末端與第三個(gè)片段的第一個(gè)末端重疊，第三個(gè)片段的第一個(gè)末端(如上所述)與第二個(gè)片段的第二個(gè)末端重疊，而第三個(gè)片段的第二個(gè)末端與所述線性化的質(zhì)粒的第二個(gè)末端重疊?？梢岳斫?，當(dāng)應(yīng)用兩段或更多DNA片段作為起始材料(startingmaterial)時(shí)，優(yōu)選所述質(zhì)粒和DNA片段的末端之間具有連續(xù)的重疊部分。雖然優(yōu)選以DNA片段和線性化的質(zhì)粒的形式重排同源的核苷酸序歹'j,但也可能重排兩個(gè)或多個(gè)包含編碼多肽的同源核苷酸序列的線性化的質(zhì)粒。然而，在這樣的情況中重要的是在不同的位點(diǎn)將所述的質(zhì)粒線性化。在本發(fā)明中，兩個(gè)或多個(gè)線性化的質(zhì)粒和一個(gè)或多個(gè)同源DNA片^:可用作將重排的起始材料。線性化的質(zhì)粒和同源DNA片段之間的比例優(yōu)選處于20:1至1:50的范圍內(nèi)，并更優(yōu)選2:1至1:10(mol質(zhì)粒mol片段)，及1pM至10M的DNA特異的濃度。通過(guò)在質(zhì)粒中缺失所述片段之間的重疊部分，線性化的質(zhì)粒可具有缺口。而在所述質(zhì)粒中修復(fù)所述缺口需要，除將所述的片段與有缺口的質(zhì)粒的末端重新組合之外，將所述的片段相互重新組合，以重新構(gòu)成環(huán)形的、自主復(fù)制的質(zhì)粒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒或載體的線性化在所述核苷酸序列的編碼序列中產(chǎn)生足夠的缺口，以推動(dòng)所述的DNA片段與所述核苷酸序列的對(duì)應(yīng)區(qū)域的同源重組，重新產(chǎn)生環(huán)形的復(fù)制的質(zhì)粒。變體在本發(fā)明中，所述親代糖苷水解酶的分離的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代，其中所述具有糖苷水解酶活性的變體包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與所述親代糖苷水解酶的氨基酸序列具有至少70%,優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85°/。，還更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%,并甚至最優(yōu)選至少97%的同一性程度。為了本發(fā)明的目的，兩個(gè)氨基酸序列的同一性程度通過(guò)Clustal方法(Higgins,1989,CABIOS5:151-153)，應(yīng)用具有同一性表和下述多個(gè)比對(duì)參數(shù)的LASERGENEMEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.,Madison，WI)進(jìn)行確定缺口罰10分和缺口長(zhǎng)度罰10分。配對(duì)比對(duì)參數(shù)為Ktuple=l，缺口罰分=3,窗口=5和對(duì)角線=5。如本文所定義的，親代糖苷水解酶的"分離的變體"是基本上無(wú)其他非-糖苷水解酶多肽的多肽，例如，如通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定的至少20%純度，優(yōu)選至少40%純度，更優(yōu)選至少60%純度，還更優(yōu)選至少80%純度，最優(yōu)選至少90%純度，并甚至最優(yōu)選至少95%純度。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的變體中氨基酸取代的數(shù)目包含優(yōu)選33，更優(yōu)選32，還更優(yōu)選31，還更優(yōu)選30，還更優(yōu)選29,還更優(yōu)選28,還更優(yōu)選27,還更優(yōu)選26,還更優(yōu)選25，還更優(yōu)選24,還更優(yōu)選23,還更優(yōu)選22,還更優(yōu)選21，還更優(yōu)選20,還更優(yōu)選19，還更優(yōu)選18，還更優(yōu)選17，還更優(yōu)選16,還更優(yōu)選15,還更優(yōu)選14，還更優(yōu)選13,還更優(yōu)選12,還更優(yōu)選ll,還更優(yōu)選IO,還更優(yōu)選9，還更優(yōu)選8，還更優(yōu)選7，還更優(yōu)選6，還更優(yōu)選5，還更優(yōu)選4，還更優(yōu)選3，還更優(yōu)選2，并最優(yōu)選l。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代糖苷水解酶的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代糖苷水解酶的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的兩個(gè)或更多位置包含取代，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代糖苷水解酶的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的三個(gè)或更多位置包含取代，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代糖苷水解酶的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的四個(gè)或更多位置包含取代，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代糖苷水解酶的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的五個(gè)或更多位置包含取代，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代糖苷水解酶的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的六個(gè)或更多位置包含取代，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、25、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代糖香水解酶的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸I至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的七個(gè)或更多位置包含取代，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置包含耳又代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代糖苷水解酶的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的八個(gè)或更多位置包含取代，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代糖苷水解酶的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的九個(gè)或更多位置包含取代，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代糖苦水解酶的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的十個(gè)或更多位置包含取代，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代糖苷水解酶的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的十一個(gè)或更多位置包含取代，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代糖苷水解酶的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的十二個(gè)或更多位置包含取代，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代糖苦水解酶的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的十三個(gè)或更多位置包含取代，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代糖苷水解酶的變體在至少對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的位置包含取代，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、GIn、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Pro作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S21P。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ser作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代G94S。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ala作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代G94A。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Arg作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代G94R。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Gln作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代G94Q。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157的位置電含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Arg作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代K157R。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、GIn、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Arg作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代G205R。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置206的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置206的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Tyr作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置206的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代H206Y。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Gu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Cys作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至5i3的取代Y247C。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置337的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置337的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Val作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置337的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代E337V。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置350的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置350的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ser作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置350的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代T350S。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置373的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置373的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含His作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置373的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代N373H。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置383的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置383的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ala作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置383的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代T383A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置438的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置438的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Leu作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置438的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代P438L。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置455的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置455的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、丁yr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ala作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置455的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代T455A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置467的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置467的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ser作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置467的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代G467S。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置486的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置486的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Vai的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Trp作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置486的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代C486W。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、GIu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含Pro作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8的位置的取代。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S8P。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置22的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置22的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Gu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含Asp作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置22的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代G22D。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含Ile作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代T411。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含Ser作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代N49S。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含Asn作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S57N。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置U3的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所迷變體進(jìn)一步包含Asn作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S113N。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置193的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置193的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含Lys作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置193的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代E193K。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含Pro作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S196P。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含Thr作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S196T。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含Phe作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置1%的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S196F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置226的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置226的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含Ala作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置226的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含SEQIDNO:2的氨基酸i至513的取代T226A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所迷變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含Ala作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代P227A。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含Leu作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代P227L。所述變體進(jìn)一步包含Gly作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代P227G。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所迷變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含Ile作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代T2461。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置251的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置251的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含Lys作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置251的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代R251K。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置255的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置255的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含Pro作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置255的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代T255P。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置259的位置包含fl代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置259的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含Asn作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置259的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代D259N。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置301的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置301的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含Ser作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置301的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代N301S。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置356的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置356的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含Ile作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置356的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代T3561。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置371的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置371的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含Cys作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置371的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代Y371C。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置411的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置411的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含Phe作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置462的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置462的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含Ala作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置462的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體進(jìn)一步包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和259的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和259的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Gly(或Ala或Leu)和Asn分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和259的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸l至513的取代P227G(或P227A或P227L)+D259N。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和486的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和486的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ala(或Leu或Gly)和Trp分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和486的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代P227A(或P227L或P227G)+C486W。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置301和337的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置301和337的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取^。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ser和Val分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置301和337的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代N301S+E337V。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和350的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和350的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Va的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Pro(或Thr或Phe)和Ser分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和350的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S196P(或S196T或S196F)+T350S。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置22和467的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置22和467的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asp和Ser分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置22和467的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代G22D+G467S。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和57的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和57的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Pro和Asn分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和57的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S21P+S57N。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和41的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和411的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Arg和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代G205R+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和227的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和227的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Arg和Ala(或Leu或Gly)分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和227的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代G205R+P227A(或P227L或P227G)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和206的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和206的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Arg和Tyr分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和206的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代G205R+.H206Y。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8和205的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8和205的位置包含以AIa、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、GIu、Gy、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Pro和Arg分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8和205的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S8P+G205R。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94和205的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94和205的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ser(或Ala或Arg或Gln)和Arg分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94和205的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代G94S(或G94A或G94R或G94Q)+G205R。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和205的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和205的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Pro(或Thr或Phe)和Arg分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和205的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S196P(或S196T或S196F)+G205R。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置383和455的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置383和455的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ala和Ala分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置383和455的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代T383A+T455A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和411的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和411的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸i至513的位置113和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S113N+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和196的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和196的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn和Thr(或Pro或Phe)分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和196的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸l至513的取代S113N十S196T(或S196P或S196F)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和462的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和462的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn和Ala分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和462的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代SI13N+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和462的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置1%和462的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Thr(或Pro或Phe)和Ala分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和462的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S196T(或S196P或S196F)+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和462的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41和196的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含lie和Phe(或Pro或Thr)分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41和196的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至5D的取代T41I+S196F(或S196P或S196T)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94和226的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94和226的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ala(或Ser或Arg或Gln)和Ala分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94和226的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代G94A(或G94S或G94R或G94Q)+T226A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和462的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和462的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn、Thr(或Pro或Phe)和Ala分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和462的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S113N+S196T(或S196P或S196F)+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157和205的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157和205的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Arg和Arg分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157和205的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代K157R+G205R。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157和255的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157和255的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Arg和Pro分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157和255的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代K157R+T255P。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和255的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和255的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Arg和Pro分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和255的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代G205R+T255P。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、205和255的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、205和255的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Arg、Arg和Pro分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、205和255的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代K157R+G205R+T255P。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41和193的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41和193的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ile和Lys分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置41和193的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代T41I+E193K。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41和411的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41和411的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ile和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代T41I+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置193和411的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置193和411的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Lys和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置193和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代E193K+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41、193和411的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41、193和411的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ue、Lys和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置41、193和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代T41I+E193K+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247和371的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247和371的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Cys和Cys分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247和371的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代Y247C+Y371C。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247和411的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247和411的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Cys和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代Y247C+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置371和411的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置371和411的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Cys和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置371和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代Y371C+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247、371和411的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247、371和411的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的耳又4&。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Cys、Cys和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置247、371和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代Y247C+Y371C+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和227的位置包含取代。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和227的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn和Ala(或Leu或Gly)分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和227的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S113N十P227A(或P227L或P227G)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和227的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸I至513的位置196和227的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Thr(或Pro或Phe)和Ala(或Leu或Gly)分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和227的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S196T(或S196P或S196F)+P227A(或P227L或P227G)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和462的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和462的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ala(或Leu或Gly)和Ala分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至5i3的位置227和462的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代P227A(或P227L或P227G)+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和227的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置142、196和227的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn、Thr(或Pro或Phe)和Ala分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置142、196和227的位置的取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227和462的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227和462的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn、Ala(或Leu或GIy)和Ala分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227和462的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S113N+P227A(或P227L或P227G)+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227和462的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227和462的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的耳又代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Thr(或Pro或Phe)、Ala(或Leu或Gly)和Ala分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227和462的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S196T(或S196P或S196F)+P227A(或P227L或P227G)+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227和462的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227和462的位置包含以AIa、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn、Thr(或Pro或Phe)、Aa(或Leu或Gly)和Ala分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227和462的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代SI13N+S196T(或S196P或S196F)+P227A(或P227L或P227G)+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49和113的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49和13的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ser和Asn分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49和113的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸l至513的取代N49S+S113N。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49和227的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49和227的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ser和Ala(或Leu或Gly)分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49和227的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代N49S+P227A(或P227L或P227G)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49和438的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49和438的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ser和Leu分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49和438的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代N49S+P438L。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和438的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和438的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、SenThr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn和Leu分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和438的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代SI13N+P438L。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和438的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和438的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ala(或Leu或Gly)和Leu分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和438的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代P227A(或P227L或P227G)+P438L。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、113和227的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、113和227的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ser、Asn、和Ala(或Leu或Gly)分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、113和227的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代N49S+S113N+P227A(或P227L或P227G)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、227和438的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、227和438的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ser、Ala(或Leu或Gly)和Leu分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、227和438的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代N49S+P227A(或P227L或P227G)+P438L。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227和438的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227和438的^f立置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn、Ala(或Leu或Gly)和Leu分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置113、227和438的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S113N+P227A(或P227L或P227G)+P438L。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、113和438的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、113和438的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ser、Asn和Leu分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、113和438的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸l至513的取代N49S+SI13N+P438L。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、113、227和438的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置49、113、227和438的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的耳又代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ser、Asn、AIa(或Leu或Giy)和Leu分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、113、227和438的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代N49S+S113N+P227A(或P227L或P227G)+P438L。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157和411的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Arg和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代K157R+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和411的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Arg和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代G205R+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置255和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置255和411的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Pro和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置255和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代T255P+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、255和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、255和411的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Arg、Pro和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置157、255和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代K157R+T255P+S41iF。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至5I3的位置205、255和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205、255和411的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Arg、Pro和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205、255和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代G205R+T255P+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、205和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、205和411的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Arg、Arg和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、205和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代K157R+G205R+S41F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、205、255和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置157、205、255和411的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Arg、Arg、Pro和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置157、205、255和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至53的取代K157R、G205R+T255P+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和4U的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Thr(或Pro或Phe)和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S196T(或S196P或S196F)+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和411的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ala(或Leu或Gly)和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代P227A(或P227L或P227G)+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227和411的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn、Ala(或Leu或Gly)和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置113、227和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S113N+P227A(或P227L或P227G)+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227和411的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Thr(或Pro或Phe)、Ala(或Leu或Gly)和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S196T(或S196P或S196F)+P227A(或P227L或P227G)+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和411的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn、Thr(或Pro或Phe)和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代SI13N+S196T(或S196P或S196F)+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227和411的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn、Thr(或Pro或Phe)、Ala(或Leu或Gly)和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S113N+S196T(或S196P或S196F)+P227A(或P227L或P227G)+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和356的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和356的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所迷變體包含Asn和Ile分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和356的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S113N+T3561。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和356的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和356的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Thr(或Pro或Phe)和Ile分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和356的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S196T(或S196P或S196F)+T356I。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和356的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和356的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、IIe、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ala(或Leu或Gly)和lie分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和356的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代P227A(或P227L或P227G)+T356I。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置356和462的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置356和462的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ile和Ala分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置356和462的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代T356I+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227和356的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227和356的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn、Ala(或Leu或Gly)和Ile分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置113、227和356的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸i至513的取代S113N+P227A(或P227L或P227G)+T356I。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227和356的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227和356的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Thr(或Pro或Phe)、Ala(或Leu或Gly)和lie分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227和356的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S196T(或S196P或S196F)+P227A(或P227L或P227G)+T356L在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227和462的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227和462的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Thr(或Pro或Phe)、Ala(或Leu或Gly)和Ala分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227和462的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S196T(或S196P或S1%F)+P227A(或P227L或P227G)+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、356和462的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、356和462的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Thr(或Pro或Phe)、Ile和Ala分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置196、356和462的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S196T(或S196P或S196F)+T356I+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和356的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和356的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn、Thr(或Pro或Phe)和Ile分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和356的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S113N+S196T(或S196P或S196F)+T356I。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227、356和462的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227、356和462的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、GIu、Gly、His、IIe、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ala(或Leu或Gly)、Ile和Ala分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227、356和462的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代P227A(或P227L或P227G)+T356I+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227和356的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227和356的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn、Thr(或Pro或Phe)、Ala(或Leu或Gly)和Ile分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227和356的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S113N+S196T(或S196P或S196F)+P227A(或P227L或P227G)+T356I。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227、356和462的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227、356和462的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、ffis、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的耳又^。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn、Ala(或Leu或Gly)、lie和Ala分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227、356和462的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S113N+P227A(或P227L或P227G)+T356I+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、356和462的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置113、196、356和462的位置包含以AIa、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的耳又代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn、Thr(或Pro或Phe)、Ile和Ala分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置113、196、356和462的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S113N+S196T(或S196P或S196F)+T356I+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227、356和462的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227、356和462的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val6令耳又^。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Thr(或Pro或Phe)、Ala(或Leu或Gly)、Ile和Ala分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227、356和462的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S196T(或S196P或S196F)+P227A(或P227L或P227G)+T356I+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227、356和462的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、1%、227、356和462的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、GIu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn、Thr(或Pro或Phe)、Ala(或Leu或Gly)、Ile和Ala分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227、356和462的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S113N+S196T(或S196P或S196F)+P227A(或P227L或P227G)+T356I+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和246的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和246的位置包含以Ala、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Pro和Ile分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和246的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S21P+T246L在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和251的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和251的位置包含以Ala、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Pro和Lys分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和251的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S21P+R251K。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和411的位置包含以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Pro和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S21P+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57和246的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57和246的位置包含以Ala、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn和Ile分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57和246的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S57N+T246I。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57和251的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57和251的位置包含以Ala、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn和Lys分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57和251的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S57N+R251K。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57和251的位置包含以Ala、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的fl代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S57N+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246和251的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246和251的位置包含以Ala、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ile和Lys分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246和251的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代T246I+R251K。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246和411的位置包含以Ala、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含lie和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代T246I+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置251和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置251和411的位置包含以Ala、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Lys和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置251和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代R251K+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57和246的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57和246的位置包含以Ala、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Pro、Asn和Ile分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57和246的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S21P+S57N+T246I。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、246和251的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、246和251的位置包含以Ala、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Pro、11e和Lys分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、246和251的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S21P+T246I+R251K。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、246和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、246和411的位置包含以Ala、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Pro、11e和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、246和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S21P+T246I+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、246和251的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、246和251的位置包含以Ala、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn、11e和Lys分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、246和251的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S57N+T246I+R251K。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、246和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、246和411的位置包含以Ala、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、IIe、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn、Ile和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、246和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S57N+T246I+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、251和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、251和411的位置包含以Ala、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn、Lys和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、251和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S57N+R251K+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57和251的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57和251的位置包含以Ala、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、IIe、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Pro、Asn和Lys分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57和251的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S21P+S57N+R251K。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246、251和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246、251和411的位置包含以Ala、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Ile、Lys和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246、251和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代T246I+R251K+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、246和251的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、246和251的位置包含以Ala、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Pro、Asn、Ile和Lys分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、246和251的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S21P+S57N+T246I+R251K。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、246、251和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、246、251和411的位置包含以Ala、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Pro、Ile、Lys和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、246、251和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨U吏1至513的取代S21P+T246I+R251K+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、251和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、251和411的位置包含以Ala、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Pro、Asn、Lys和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、251和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S21P+S57N+R251K+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、246、251和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、246、251和411的位置包含以Ala、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Asn、Ile、Lys和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、246、251和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S57N+T246I+R251K+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、246和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置21、57、246和411的位置包含以Ala、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Ghi、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的取代。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Pro、Asn、lie和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、246和411的位置的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S21P+S57N+T246I+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、246、251和411的位置包含取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、246、251和411的位置包含以Ala、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val的耳又^。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含Pro、Asn、Ile、Lys和Phe分別作為在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、246、251和411的位皇的取代。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S21P+S57N+T246I+R251K十S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含至少一個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的取代，并任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356LY371C、S411F和T462A的取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含至少兩個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、薦1S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的取代，并任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356LY371C、S411F和T462A的取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含至少三個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的取代，并任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、測(cè)S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含至少四個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的取代，并任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含至少五個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至5D的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、畫1S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的取代，并任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含至少六個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、廳1S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的取代，并任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含至少七個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、Ei93K、S196P、S196F、G205R、訓(xùn)6Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的取代，并任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356LY371C、S411F和T462A的取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含至少八個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246LY247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的取代，并任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含至少九個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、翻1S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的取代，并任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含至少十個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、訓(xùn)6Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、丁455A、G467S和C486W的取代，并任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含至少十一個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的取代，并任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含至少十二個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的取代，并任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T4H、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356LY371C、S411F和T462A的取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含至少十三個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的取代，并任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、薦S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的耳又代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含至少十四個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的取代，并任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、層S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的耳5C代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含至少十五個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、廳1S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的取代，并任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含至少十六個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、畫1S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的取代，并任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含至少十七個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、畫1S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的取代，并任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、SI13N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含至少十八個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的取代，并任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含至少十九個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的取代，并任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、丁411、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356LY371C、S411F和T462A的取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含至少二十個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、訓(xùn)1S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的取代，并任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變體包含由至少SEQIDN0:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、訓(xùn)6Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W組成的取代，并任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T4H、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的取代。本發(fā)明的變體可進(jìn)一步包含所述氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)缺失和/或插入。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體由341至350、351至360、361至370、371至380、381至390、391至400、401至410、411至420、421至430、431至440、441至450、451至460、461至470、471至480、481至490、491至500或501至513個(gè)氨基酸組成。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代T226A的變體由大腸桿菌NRRLB-30657中包含的核苷酸序列編碼。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S113N+S196T+T462A的變體由大腸桿菌NRRLB-30658中包含的核苷酸序列編碼。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代G22D+G467S的變體由大腸桿菌NRRLB-30659中包含的核苷酸序列編碼。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含SEQIDNO:2的氨基酸l至513的取代S21P+S57N的變體由大腸桿菌NRRLB-30661中包含的核苷酸序列編碼。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代K157R+G205R+T255P的變體由大腸桿菌NRRLB-30662中包含的核苷酸序列編碼。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S196P+G205R的變體由大腸桿菌NRRLB-30663中包含的核苷酸序列編碼。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含SEQIDNO:2的氨基酸l至513的取代S113N+S196T+P227A+T462A的變體由大腸桿菌NRRLB-30664中包含的核苷酸序列編碼。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代T41I+E193K+S411F的變體由大腸桿菌NRRLB-30665中包含的核苦酸序列編碼。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含SEQIDNO:2的氨基酸l至513的取代N49S+S113N+P227A+P438L的變體由大腸桿菌NRRLB-30666中包含的核苷酸序列編碼。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代N301S+E337V的變體由大腸桿菌NRRLB-30674中包含的核苷酸序列編碼。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S196P+T350S的變體由大腸桿菌NRRLB-30675中包含的核苷酸序列編碼。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代G205R+H206Y的變體由大腸桿菌NRRLB-30676中包含的核香酸序列編碼。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S8P+G205R的變體由大腸桿菌NRRLB-30677中包含的核苷酸序列編碼。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代G94S+G205R的變體由大腸桿菌NRRLB-30678中包含的核苷酸序列編碼。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代T383A+T455A的變體由大腸桿菌NRRLB-30679中包含的核苷酸序列編碼。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代N373H的變體由大腸桿菌NRRLB-30680中包含的核苷酸序列編碼。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代Y247C+Y371C+S411F的變體由大腸桿菌NRRLB-30681中包含的核苷酸序列編碼。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S2IP+S57N+T246I+R25IK+S411F的變體由大腸桿菌NRRLB-30682中包含的核苷酸序列編碼。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代P227G+D259N的變體由大腸桿菌NRRLB-30762中包含的核苷酸序列編碼。本發(fā)明也涉及獲得親代糖苷水解酶的變體的方法，其包括(a)在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的一個(gè)或多個(gè)位置將取代導(dǎo)入所述親代糖香水解酶，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置導(dǎo)入取代，其中所述變體具有糖苦水解酶活性；和(b)回收所述的變體。核苷^列本發(fā)明也涉及分離的核苷酸序列，其編碼親代糖苷水解酶的變體，其中所述核苷酸序列已被修飾以編碼本文中所述的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代。本文中應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)"分離的核苷酸序列"指基本上無(wú)其他核苷酸序列的核苷酸序列，例如，通過(guò)瓊脂糖電泳測(cè)定的至少20%純度，優(yōu)選至少40°/0純度，更優(yōu)選至少60%純度，還更優(yōu)選至少80%純度，和最優(yōu)選至少90%純度。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代T226A的變體的分離的核苷酸序列包含于大腸桿菌NRJRLB-30657。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代SI13N+S196T+T462A的變體的分離的核苷酸序列包含于大腸桿菌NRRLB-30658。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代G22D+G467S的變體的分離的核苷酸序列包含于大腸桿菌NRRLB-30659。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S21P+S57N的變體的分離的核苦酸序列包含于大腸桿菌NRRLB-30661。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代K157R+G205R+T255P的變體的分離的核苷酸序列包含于大腸桿菌NRRLB-30662。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S196P+G205R的變體的分離的核苷酸序列包含于大腸桿菌NRRLB-30663。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S113N+S196T+P227A+T462A的變體的分離的核苷酸序列包含于大腸桿菌NRRLB-30664。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代T41I+E193K+S411F的變體的分離的核芬酸序列包含于大腸桿菌NRRLB-30665。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代N49S+S113N+P227A+P438L的變體的分離的核苦酸序列包含于大腸桿菌NRRLB-30666。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代N301S+E337V的變體的分離的核苷酸序列包含于大腸桿菌NRRLB-30674。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S196P+T350S的變體的分離的核香酸序列包含于大腸桿菌NRRLB-30675。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代G205R+H206Y的變體的分離的核苷酸序列包含于大腸桿菌NRRLB-30676。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S8P+G205R的變體的分離的核苷酸序列包含于大腸桿菌NRRLB-30677。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代G94S+G205R的變體的分離的核苷酸序列包含于大腸桿菌NRRLB-30678。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代T383A+T455A的變體的分離的核苷酸序列包含于大腸桿菌NRRLB-30679。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代N373H的變體的分離的核苷酸序列包含于大腸桿菌NRRLB-30680。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代Y247C+Y371C+S411F的變體的分離的核苷酸序列包含于大腸桿菌NRRLB-30681。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代S21P+S57N+T246I+R251K+S411F的變體的分離的核苷酸序列包含于大腸桿菌NRRLB-30682。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代P227G+D259N的變體的分離的核苷酸序列包含于大腸桿菌NRRLB-30762。核酸構(gòu)建體本發(fā)明也涉及核酸構(gòu)建體，其包含編碼本發(fā)明的糖苷水解酶變體的核苷酸序列，該序列可操作地連接于一個(gè)或多個(gè)控制序列，所述的控制序列在合適的宿主細(xì)胞中，在與所述的控制序列相適合的條件下指導(dǎo)編碼序列表達(dá)。表達(dá)可理解為包括與產(chǎn)生所述變體有關(guān)的任何步驟，其包括但不限于，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾(posttranscriptionalmodification)、翁3譯、翁3譯后修飾(post陽(yáng)translationalmodification)和分)必。"核酸構(gòu)建體，，在本文中定義為單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然產(chǎn)生的基因，或其已被修飾以含有核酸的區(qū)段，所述的區(qū)段以自然中不存在的方式組合和并置(juxtapose)。當(dāng)所述的核酸構(gòu)建體含有表達(dá)本發(fā)明的變體的編碼序列所需的所有控制序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)核酸構(gòu)建體與術(shù)語(yǔ)表達(dá)盒(expressioncassette)是同義的。術(shù)語(yǔ)"編碼序列"在此定義為核酸序列，其直接地指明其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列?；蚪M編碼序列的邊界通常由恰位于mRNA的5'-末端的開放閱讀框上游的ATG起始密碼子，或可替換的起始密碼子如GTG和TTG,和恰位于mRNA的3，末端的開放閱讀框下游的轉(zhuǎn)錄終止子序列進(jìn)行確定。編碼序列可以包括，^f旦不限于DNA、cDNA和重組核酸序列。編碼本發(fā)明的糖苷水解酶變體的分離的核苷酸序列，可以以各種方式操作以提供所述變體的表達(dá)。將所述核苷酸序列插入載體之前的操作可為需要的或必須的，這取決于表達(dá)載體。應(yīng)用重組DNA方法修飾核酸序列的方法，在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是眾所周知的。術(shù)語(yǔ)"控制序列"在本文中定義為，包括所有對(duì)于表達(dá)本發(fā)明的糖苷水解酶變體來(lái)說(shuō)必需的或有利的成分。每個(gè)控制序列對(duì)于編碼所述變體的核酸序列可為天然的或外源的。上述控制序列包括，但不限于，前導(dǎo)序列(leader)、聚月泉香酸"f匕序歹'J(polyadenylationsequence)、前狀序歹'J(propeptidesequence)、啟動(dòng)子(promoter)、4言號(hào)月太序歹1)(signalpeptidesequence)和專爭(zhēng)錄終止子(transcriptionterminator)。最低限度，所述的控制序列包4舌啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。所述的控制序列可與接頭一起提供，用于引入具體的限制酶切位點(diǎn)以便于將所述的控制序列與編碼本發(fā)明的變體糖苷水解酶的核苷酸序列的編碼區(qū)連接。術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"在本文中定義為一種構(gòu)造(configuration),其中控制序列適合地位于相對(duì)于核苷酸序列的編碼序列的位置，以使所述的控制序列指導(dǎo)變體糖苷水解酶的表達(dá)。所述的控制序列可為適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列，其由表達(dá)所述核苷酸序列的宿主細(xì)胞所識(shí)別。所述啟動(dòng)子序歹'J包含轉(zhuǎn)錄控制序列(transcriptionalcontrolsequences),其介導(dǎo)所述變體糖芬水解酶的表達(dá)。所述啟動(dòng)子可為任意核酸序列，其在優(yōu)先選擇的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性，其包括突變體啟動(dòng)子(mutant)、被截短的啟動(dòng)子(truncated)和雜合體啟動(dòng)子(hybridpromoter),所述啟動(dòng)子可從編碼細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)與所述宿主細(xì)胞同源或異源的多肽的基因中獲得。指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適的啟動(dòng)子的實(shí)例，是從米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(i/^o/MMcw/mW2ez')天冬氨酸蛋白酶(asparticproteinase)、黑曲霉中性alpha-淀粉酶(neutralalpha-amylase)、黑曲霉酸穩(wěn)定性alpha-淀粉酶(acidstablealpha-amylase)、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glucoamylase)(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶(lipase)、米曲霉堿性蛋白酶(alkalineproteinase),米曲霉石粦酸丙糖異構(gòu)酶(triosephosphateisomerase)、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶(acetamidase)、Fwan'wmvewe加&w淀粉葡萄糖芬酶(amyloglucosidase)、尖鐮孑包月夷蛋白酶-才羊蛋白酶(trypsin-likeproteinase)(WO96/00787)、7Hc/z<%/e/777a廠eese/beta-葡糖苦酵、7Wc/zo(iemzareese/纖維素二糖水解酶I、7Hc/2ocfermareesez'內(nèi)切葡聚糖酶I、7Hc/2cxierma內(nèi)切葡聚糖酶II、7Hc/zc^enwareew/內(nèi)切葡聚糖酶III、7Hc/2oaferma內(nèi)切葡聚糖酶IV、7Hc/zoofermare^e/內(nèi)切葡聚糖酶V、7h.c/2o<ie/7waree"/木聚糖酶I、7Hc/zo(ie/7waree"/木聚糖酶II、7Hc/7odenw"rease/beta-木聚糖酶的基因得到的啟動(dòng)子以及NA2-tpi啟動(dòng)子(來(lái)自黑曲霉中性alpha-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子的雜合體)；其等同物；及其突變體啟動(dòng)子、被截短的啟動(dòng)子和雜合體啟動(dòng)子。在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子從釀酒酵母烯醇酶(enolase)(ENO-l)、釀酒酵母半乳糖激酶(galactokinase)(GAL1)、釀酒酵母醇脫氬酶(alcoholdehydrogenase)"-石舞酉臾甘'油趁脫氳酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)(ADH1,ADH2/GAP)、釀酒酵母磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(metallothionine)(CUP1)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶(3-phosphoglyceratekinase)的基因中得到。酵母宿主細(xì)胞的其他有用的啟動(dòng)子由Romanos等，1992，腸W8:423-488描述。所述控制序列也可為合適的轉(zhuǎn)錄終止序列，即由宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止序列與編碼所述變體糖苷水解酶的核苦酸序列的3'末端可操作地連接。任何在優(yōu)先選擇的宿主細(xì)胞中有功能的終止子可用于本發(fā)明。絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選的終止子從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯曱酸鹽合成酶(anthranilatesynthase)、黑曲霉alpha-葡萄糖苦酶(alpha-glucosidase)和尖鐮孢胰蛋白酶-樣蛋白酶的基因中得到。優(yōu)選的酵母宿主細(xì)胞的終止子從釀酒酵母烯醇酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(cytochromeC)(CYC1)和釀酒酵母3-磷酸甘油醛脫氫酶的基因中得到。酵母宿主細(xì)胞的其他有用的終止子通過(guò)Romanos等，1992,見前文描述。所述控制序列也可為合適的前導(dǎo)序列(leadersequence),即mRNA的不翻譯的區(qū)域，其對(duì)于由宿主細(xì)胞的翻譯是重要的。所述的前導(dǎo)序列與編碼所述變體糖苷水解酶的核酸序列的5'末端可操作地連接。任何在優(yōu)先選擇的宿主細(xì)胞中有功能的前導(dǎo)序列可用于本發(fā)明。優(yōu)選的絲狀真菌宿主細(xì)胞的前導(dǎo)序列，從米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因中得到。合適的酵母宿主細(xì)胞的前導(dǎo)序列從釀酒酵母烯醇酶(ENO-l)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母alpha-因子和釀酒酵母醇脫氫酶/3-磷酸甘油醛脫氫酶(ADH2/GAP)的基因中得到。所述的控制序列以可為聚腺苷酸化序列，即與所述多肽-編碼序列的3，末端可操作地連接的序列，而且當(dāng)它被轉(zhuǎn)錄時(shí)，它被宿主細(xì)胞識(shí)別為信號(hào)以將聚腺苷酸殘基添加在轉(zhuǎn)錄的mRNA上。任何在優(yōu)先選擇的宿主細(xì)胞中有功能的聚腺苷酸化序列可用于本發(fā)明。優(yōu)選的絲狀真菌宿主細(xì)胞的聚腺苷酸化序列從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯曱酸鹽合成酶、尖鐮孢胰蛋白酶-樣蛋白酶和黑曲霉alpha-葡萄糖苷酶的基因中得到。酵母宿主細(xì)胞的有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995，MolecularCellularBiology15:5983-5990描述。所述的控制序列也可為信號(hào)肽編碼區(qū)域，其編碼與變體糖苷水解酶的氨基末端連接的氨基酸序列，并指導(dǎo)編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑(secretorypathway)。所述核苷酸序列的編碼序列的5'末端可天然地包含信號(hào)肽編碼區(qū)，編碼分泌的變體糖香水解酶?？商鎿Q地，編碼序列的5'末端可包含信號(hào)肽編碼區(qū)，其對(duì)于所述的編碼序列是外源的。所述外源的信號(hào)肽編碼區(qū)可為必需的，其中所述編碼序列天然地不含信號(hào)肽編碼區(qū)?？商鎿Q地，所述外源的信號(hào)肽編碼區(qū)可簡(jiǎn)單地替換天然的信號(hào)肽編碼區(qū)，以增強(qiáng)所述變體糖香水解酶的分泌。然而，任何指導(dǎo)所表達(dá)的多肽進(jìn)入優(yōu)先選擇的宿主細(xì)胞的分泌途徑的信號(hào)肽編碼區(qū)可用于本發(fā)明。絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效的信號(hào)肽編碼區(qū)，為從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、//wm/co/a/mo/eraCel45A纖維素酶和//wm/co/a/a"wg/"os"月旨肪酶的基因中得到的信號(hào)肽編碼區(qū)。酵母宿主細(xì)胞的有用的信號(hào)肽從釀酒酵母alpha-因子(alpha-factor)和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶(invertase)的基因中得到。其他有用的信號(hào)肽編碼區(qū)通過(guò)Romanos等，1992,見前文描述。所述控制序列也可為前肽編碼區(qū)，其編碼位于變體糖苷水解酶的氨基末端的氨基酸序列。得到的多肽被稱為前酶(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或有些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無(wú)活性的，并可通過(guò)將所述多肽從前多肽上催化的或自催化的(autocatalytic)切割轉(zhuǎn)化為成熟的活性多肽。所述多肽編碼區(qū)可從釀酒酵母alpha-因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(laccase)(WO95/33836)的基因中得到。信號(hào)肽區(qū)和前肽區(qū)出現(xiàn)在多肽的氨基末端，所述前肽區(qū)緊接著位于多肽的氨基末端，而所述信號(hào)肽區(qū)緊接著位于前肽區(qū)的氨基末端。也需要添加調(diào)控序列，其允許相對(duì)于所述宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控所述變體糖苷水解酶的表達(dá)。調(diào)控系統(tǒng)的實(shí)例是那些響應(yīng)化學(xué)的或物理的刺激物(stimulus),包括調(diào)控化合物的存在，使所述基因的表達(dá)開啟或關(guān)閉的調(diào)控系統(tǒng)。在酵母中，可采用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，TAKAaipha-淀粉酶啟動(dòng)子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子可用作調(diào)控序列。調(diào)控序列的其他實(shí)例是那些允許基因擴(kuò)增的調(diào)控序列。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)控系統(tǒng)包括二氫葉酸還原酶(dihydrofolatereductase)基因，其在曱氨喋呤(methotrexate)存在的條件下被擴(kuò)增，和金屬硫蛋白(metallothionein)基因，其以重金屬擴(kuò)增。在這些情況中，編碼所述變體糖苦水解酶的核香酸序列與所述調(diào)控序列可操作地連接。表達(dá)載體本發(fā)明也涉及重組表達(dá)載體，其包括編碼本發(fā)明的變體糖苦水解酶的核苷酸序列、啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)?？蓪⑸鲜龅亩喾N核苷酸和控制序列結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體可包括一個(gè)或多個(gè)方便的限制酶切位點(diǎn)，以允許在這些位點(diǎn)上插入或取代編碼所述變體的核苷酸序列?？商鎿Q地，所述的核苷酸序列可以通過(guò)將所述核酸序列或包含所述序列的核酸構(gòu)建體插入適于表達(dá)的載體中進(jìn)行表達(dá)。在創(chuàng)建所述表達(dá)載體的過(guò)程中，所述編碼序列位于所述載體中，這樣一來(lái)，所述的編碼序列與適于表達(dá)的控制序列可搡作地連接。所述的重組表達(dá)載體可為任意載體(例如，質(zhì)粒或病毒)，其可以方便地經(jīng)過(guò)重組DNA步驟，并可使所述核苷酸序列表達(dá)。所述載體的選擇通常依賴于為線狀的質(zhì)粒或閉合環(huán)狀的質(zhì)粒。本發(fā)明的載體優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)可選擇的標(biāo)記，其允許容易地選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞?？蛇x擇的標(biāo)記為基因，該基因的產(chǎn)物可提供殺生物劑(biocide)或病毒抗性(viralresistance)、4元重金屬(resistancetoheavymetals)、營(yíng)養(yǎng)在夾陷型的原營(yíng)養(yǎng)(prototrophytoauxotrophs)等。酵母宿主細(xì)胞的合適的標(biāo)記為ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。在絲狀真菌宿主細(xì)胞中應(yīng)用的可選擇的標(biāo)記包括，但不限于(乙酰胺酶)、(鳥氨酸氨曱?；D(zhuǎn)移酶(ornithinecarbamoyltransferase))、6ar(膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶(phosphinothricinacetyltransferase))、/z//z(譯月霉素石粦酸專爭(zhēng)牙多酶(hygromycinphosphotransferase))、m.oD(賄酸鹽還原酶(nitratereductase))、wG(乳清酸核香-5，-磷酸脫羧酶(orotidine誦5'國(guó)phosphatedecarboxylase))、sC(碌u酸腺苦?；D(zhuǎn)移酶(sulfateadenyltransferase))、^7C(鄰氨基苯曱酸鹽合成酶)，以及其等同物。優(yōu)選用于曲霉屬細(xì)胞的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的am^S和基因和吸水鏈霉菌(5Vreptomyces/zygroscop/c附)的6ar基因。所述載體可為自發(fā)復(fù)制的(autonomouslyreplicating)載體，即作為染色體外的實(shí)體存在的載體，它的復(fù)制不同于染色體的復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外的元件(element)、極微染色體(minichromosome)或人造染色體。所述載體可包含確保自我復(fù)制(self-replication)的任何方法(means)?？商鎿Q地，當(dāng)所述載被導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)它被整合入基因組，并與被整合入所述載體的染色體一起復(fù)制。此外，可以采用單一的載體或質(zhì)?；蚬餐写龑?dǎo)入宿主細(xì)胞的基因組的總DNA的兩種或多種載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子(transposon)。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有元件，所述元件允許將所述載體整合到宿主細(xì)胞的基因組，或所述載體在所述細(xì)胞中不依賴于基因組地自發(fā)復(fù)制。為了整合入所述宿主細(xì)胞基因組，所述載體可依賴于編碼所述變體的核苷酸序列，或通過(guò)同源的或非同源的重組將所述載體整合入基因組中的任何其他元件?？商鎿Q地，所述的載體可包含附加的核酸序列，用于指導(dǎo)通過(guò)同源重組整合入宿主細(xì)胞的基因組。所述附加的核酸序列使所述載體在染色體的準(zhǔn)確位置整合入宿主細(xì)胞基因組。為了提高在準(zhǔn)確位置進(jìn)行整合的可能性，所述的整合元件應(yīng)優(yōu)選含有足夠數(shù)目的核酸，如100至10,000個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選400至10,000個(gè)石威基對(duì)，并最優(yōu)選800至10,000個(gè)石威基對(duì)，所述的核酸與對(duì)應(yīng)的靶序列高度同源，以增強(qiáng)同源重組的可能性。所述的整合元件可為與所述宿主細(xì)胞的基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，所述的整合元件可為非—編碼的或編碼的核s吏序列。另一方面，所述載體可通過(guò)非-同源重組整合入所述宿主細(xì)胞的基因組中。為了自發(fā)復(fù)制，所述載體可進(jìn)一步包含復(fù)制起點(diǎn)(originofreplication),它能夠使所述載體在所述的宿主細(xì)胞中自發(fā)的復(fù)制。在酵母宿主細(xì)胞中應(yīng)用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例為2微米(micro)復(fù)制起點(diǎn)，ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的組合、及ARS4和CEN6的組合。所述的復(fù)制起點(diǎn)可為具有突變的復(fù)制起點(diǎn)，所述突變使其在所述宿主細(xì)胞中具有溫度-敏感性的功能(參見，例如，Ehrlich,1978，尸raceW"gsAevV加'o"a/zlca^，。/S"'e"c^st/S/475:1433)。在絲狀真菌細(xì)胞中應(yīng)用的質(zhì)粒復(fù)制子的實(shí)例為AMA1和ANS1(Gems等，1991:Ge恥98:61-67;Cullen等，1987，7Vwc/e/cJ".Aiwewc/z15:9163-9175;WO00/24883)。分離AMA1基因和構(gòu)建含有該基因的質(zhì)?；蜉d體，可以#4居在WO00/24883中公開的方法實(shí)施?？蓪⒊^(guò)一個(gè)拷貝的本發(fā)明的核苷酸序列插入所述宿主細(xì)胞，以增加糖苷水解酶變體的產(chǎn)生。通過(guò)將所述序列的至少一個(gè)附加的"^貝整合入宿主細(xì)胞基因組，或者通過(guò)將可擴(kuò)增的可選擇標(biāo)記基因包含于所述的核酸序列中，其中細(xì)胞含有所述可選擇標(biāo)記基因的擴(kuò)增的拷貝，所述核酸序列的拷貝數(shù)可以得到增加，并由此所述核酸序列的附加拷貝可以通過(guò)在適當(dāng)?shù)倪x擇性試劑存在的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞來(lái)選擇。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的步驟，是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見前文)以得到基本上純的糖苷水解酶變體。宿主細(xì)胞本發(fā)明也涉及包含編碼變體糖苷水解酶的核苷酸序列的重組宿主細(xì)胞，其方便地應(yīng)用于重組產(chǎn)生所述變體。將包含本發(fā)明的核苷酸序列的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，所以所述載體作為染色體的組成部分，或作為如較早所述的自我-復(fù)制的染色體外的載體保持，。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞，，包括任何親代細(xì)胞的后代，其由于復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的突變而與親代細(xì)胞不相同。宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上依賴于編碼所述變體的基因及其來(lái)源。所述宿主細(xì)胞可為任何真核細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物、昆蟲、植物或真菌細(xì)胞。所述的宿主細(xì)胞可為任何真菌細(xì)胞。如在本文中應(yīng)用的"真菌"包括子嚢菌門(p/zj/ay^cow^coto),4旦子菌門(5as/(i/omycoto)，壺菌門(CT^^/fif/owycoto)和才妄合菌門(Zjgom少cota)(唑口由Hawksworth等在AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi，她edition,1995，CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定義的)，以及卵菌門(Oomycota)(如在Hawksworth等，1995,見前文，171頁(yè)所引用的)和所有有絲分裂孢子的真菌(Hawksworth等，1995,見前文)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。如在本文中應(yīng)用的"酵母，，包括產(chǎn)子嚢酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子酵母(basidiosporogenousyeast)和屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽孢綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在將來(lái)可變化，為了本發(fā)明的目的，將酵母定義為如在歷o/ogya"a^c//W"e>yo/lfe<aW(Skinner,RA.,Passmore,S.M.和Davenport,R.R.,eds,Soc.^"en'o/.5ywjms7'謂Sm.esNo.9，1980)中所描述的。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的酵母宿主細(xì)胞是念珠菌屬、漢遜酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、糖酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉細(xì)胞。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母宿主細(xì)胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、Sacc/zaramycesc/owg/awz,z'、克魯弗酵母、諾地酵母或Sacc/wom^ycesovz/orm&細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維酵母細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的酵母宿主細(xì)胞是Kwrcw/a/j^o(yrica細(xì)月包。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。"絲狀真菌，，包括所有絲狀形式的真菌和卵菌亞門(如由Hawksworth等，1995，見前文，所定義的)。所述的絲狀真菌通常以由曱殼質(zhì)(chitin)、纖維素、葡聚糖(glucan)、脫乙酰殼多糖(chitosan)、甘露聚糖(mannan)和其他復(fù)合多糖類(complexpolysaccharides)組成的菌絲體壁(mycelialwall)為特征。通過(guò)菌絲延長(zhǎng)(hyphalelongation)進(jìn)4亍營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)(vegetativegrowth),而碳分解^i射(carboncatabolism)是專性需氧的(obligatelyaerobic)。與此相反，酵母，諸如釀酒酵母的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)則是通過(guò)單細(xì)胞菌體的出芽生殖(budding)進(jìn)行的，而碳分解代謝是可為發(fā)酵的(fermentative)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌宿主細(xì)胞是，但不限于，枝頂孢霉屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬、脈孢菌屬、青霉屬、Thielavia、7b/少/7oc/a(i/MW或木審屬纟田月包。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真茵宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌宿主細(xì)胞是桿孢狀鐮孢、i^saWwmcereafe、Fwran'"/wcroo^we〃erae、大刀鐮孑包、禾本牙+鐮孑包、Fwsan'wwgnaw/"ww、異孑包鐮孑包、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孑包鐮孑包、Fwsan'Mwsw/p/zweww、尸wan'MWtonJoi^附、FwsaWw附fn'c/zo^2ec/o/(ies或Fwran'wwve"e朋&w細(xì)胞。在一個(gè)甚至最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌宿主纟田月包是Fwsan'wmvenewafwm(Nirenbergsp.nov.)細(xì)月包。在另一個(gè)最葉尤選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌宿主細(xì)胞是//wm/co/a/rao/era、//wm/co/a/a"Mg/"wfl、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)、7Hc/20<ferma/zara'aw畫、康亍木霉、7Hc/0(ie，a/owgArac/2/ato/w、rn'c/zotferma或纟錄色木霉細(xì)月包。在另一個(gè)甚至最"f尤選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌宿主細(xì)胞是7Hc/zo^rmare"e/RutC30?？筛鶕?jù)在此描述的步驟轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞。產(chǎn)生方法
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：本發(fā)明也涉及產(chǎn)生糖苷水解酶變體的方法，其包括(a)在適于表達(dá)所述變體的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含核苷酸序列，其已被修飾以編碼變體，該變體如本文所述在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代；和(b)從所述培養(yǎng)基中回收所述的變體。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，所述宿主細(xì)胞在適于產(chǎn)生所述糖苷水解酶變體的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，用本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的方法進(jìn)行培養(yǎng)。例如，所述細(xì)胞可通過(guò)搖瓶培養(yǎng)、小-規(guī)?；虼?規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)的、批式的、補(bǔ)料分批的或固態(tài)的發(fā)酵)，在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中，在合適的培養(yǎng)基中和在允許所述多肽表達(dá)和/或分離的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。所述的培養(yǎng)采用本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的方法，在合適的包含碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)生。合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)者得到，或根據(jù)發(fā)表的組合物(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)的目錄中)進(jìn)行制備。如果所述多肽分泌到所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，所述多肽可直接從該培養(yǎng)基中回收，如果所述多肽不分泌，那么它可以從細(xì)胞裂解物(celllysate)中回收。在一個(gè)替換的實(shí)施方案中，不回收所述的糖苷水解酶變體，但更可將表達(dá)變體的本發(fā)明的宿主細(xì)胞用作所述變體的來(lái)源。所述的變體糖苷水解酶可采用本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的、對(duì)所述多肽具有特異性的方法進(jìn)行檢測(cè)。這些檢測(cè)方法可包括應(yīng)用特異性抗體、酶產(chǎn)物形成或酶底物消失。例如，酶分析可用于測(cè)定所述多肽的活性，如本文在實(shí)施例中所描述的。得到的糖苷水解酶變體可以通過(guò)本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的方法進(jìn)行回收。例如，所述多肽可以通過(guò)常規(guī)的方法從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所迷常規(guī)方法包括，但不限于，收集、離心、過(guò)濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明的糖苷水解酶變體可通過(guò)本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的各種方法進(jìn)行純化，所述方法包括，但不限于色譜法(例如，離子交換、親和、疏水、色謙焦聚和大小排阻)、電泳的方法(例如，制備等電聚焦(preparativeisoelectricfocusing))、溶解性差異(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(extraction)(參見，例如，Pwr折ca"ow,J.-C.Janson和LarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)以得到基本上純的糖香水解酶變體。具有糖苷水解酶活性的其他多肽本發(fā)明也涉及具有糖苷水解酶活性的分離的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的一個(gè)或多個(gè)位置不同于SEQIDNO:2，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置不同。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸1至513相差優(yōu)選33個(gè)氨基酸，更優(yōu)選32個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選31個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選30個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選29個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選28個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選27個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選26個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選25個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選24個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選23個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選22個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選21個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選20個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選19個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選18個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選17個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選16個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選15個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選14個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選13個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選12個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選11個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選10個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選9個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選8個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選7個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選6個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選5個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選4個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選3個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選2個(gè)氨基酸，并最優(yōu)選1個(gè)氨基酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的一個(gè)或多個(gè)位置不同于SEQIDNO:2,并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的兩個(gè)或更多位置不同于SEQIDNO:2,并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的三個(gè)或更多位置不同于SEQIDNO:2，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的四個(gè)或更多位置不同于SEQIDNO:2,并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的五個(gè)或更多位置不同于SEQIDNO:2，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的六個(gè)或更多位置不同于SEQIDNO:2,并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的七個(gè)或更多位置不同于SEQIDNO:2,并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的八個(gè)或更多位置不同于SEQIDNO:2，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的九個(gè)或更多位置不同于SEQIDNO:2，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的十個(gè)或更多位置不同于SEQIDNO:2,并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的十一個(gè)或更多位置不同于SEQIDNO:2，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的十二個(gè)或更多位置不同于SEQIDNO:2,并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的十三個(gè)或更多位置不同于SEQIDNO:2,并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在至少對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的位置不同于SEQIDNO:2，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Giy、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21的位置與SEQIDNO:2相差Pro。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94的位置與SEQIDNO:2相差Ser。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的G94S。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的G94A。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)rg。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的G94R。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94的位置與SEQIDNO:2相差Gln。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的G94Q。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)rg。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的K157R。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)rg。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的G205R。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置206的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置206的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置20戶的位置與SEQIDNO:2相差Tyr。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的H206Y。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247的位置與SEQIDNO:2相差Cys。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的Y247C。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置337的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置337的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置337的位置與SEQIDNO:2相差Val。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的E337V。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置350的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置350的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、GIy、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置350的位置與SEQIDNO:2相差Ser。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的T350S。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置373的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置373的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置373的位置與SEQIDNO:2相差His。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的N373H。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置383的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置383的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置383的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)a。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的T383A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置438的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置438的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、GIy、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置438的位置與SEQIDNO:2相差Leu。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的P438L。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置455的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置455的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)Ia、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、丁hr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置455的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的T455A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置467的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置467的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置467的位置與SEQIDNO:2相差Ser。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的G467S。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置486的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置486的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、丁hr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置486的位置與SEQIDNO:2相差Trp。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的C486W。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8的位置與SEQIDNO:2相差Pro。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S8P。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置22的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置22的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置22的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sp。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的G22D。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、GIy、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41的位置與SEQIDNO:2相差I(lǐng)le。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的T41I。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49的位置與SEQIDNO:2相差Ser。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的N49S。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S57N。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S113N。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置193的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置193的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置193的位置與SEQIDNO:2相差Lys。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的E193K。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196的位置與SEQIDNO:2相差Pro。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S196P。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196的位置與SEQIDNO:2相差Thr。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S196T。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196的位置與SEQIDNO:2相差Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S196F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置226的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置226的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置226的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所迷多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的T226A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的P227A。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227的位置與SEQIDNO:2相差Leu。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的P227L。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227的位置與SEQIDNO:2相差Gly。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的P227G。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所迷多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246的位置與SEQIDNO:2相差I(lǐng)le。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的T246I。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置251的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置251的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置251的位置與SEQIDNO:2相差Lys。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至5D的R251K。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置255的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置255的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置255的位置與SEQIDNO:2相差Pro。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的T255P。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置259的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置259的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置259的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的D259N。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置301的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置301的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置301的位置與SEQIDNO:2相差Ser。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的N301S。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置356的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置356的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置356的位置與SEQIDNO:2相差I(lǐng)le。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的T356I。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置371的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置371的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置371的位置與SEQIDNO:2相差Cys。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸l至513的Y371C。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置411的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、I)e、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置411的位置與SEQIDNO:2相差Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置462的位置不同于SEQIDNO:2。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在另一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和259的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和259的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基S吏序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和259的位置與SEQIDNO:2相差Gly(或Ala或Leu)和Asn。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的P227G(或P227A或P227L)+D259N。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和486的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和486的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和486的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la(或Leu或Gly)和Trp。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的P227A(或P227L或P227G)+C486W。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置301和337的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基S吏序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置301和337的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置301和337的位置與SEQIDNO:2相差Ser和Val。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的N301S+E337V。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和350的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和350的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glil、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和350的位置與SEQIDNO:2相差Pro(或Thr或Phe)和Ser。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S196P(或S196T或S196F)+T350S。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置22和467的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置22和467的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置22和467的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sp和Ser。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的G22D+G467S。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和57的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和57的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和57的位置與SEQIDNO:2相差Pro和Asn。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P+S57N。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)rg和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基S復(fù)序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的G205R+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和227的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和227的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和227的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)rg和Ala(或Leu或Gly)。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的G205R+P227A(或P227L或P227G)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和206的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和206的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和206的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)rg和Tyr。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的G205R+H206Y。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8和205的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8和205的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8和205的位置與SEQIDNO:2相差Pro和Arg。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S8P+G205R。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94和205的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94和205的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94和205的位置與SEQIDNO:2相差Ser(或Ala或Arg或Gln)和Arg。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的G94S(或G94A或G94R或G94Q)+G205R。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和205的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和205的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和205的位置與SEQIDNO:2相差Pro(或Thr或Phe)和Arg。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所迷多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S196P(或S196T或S196F)+G205R。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置383和455的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置383和455的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置383和455的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la和Ala。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的T383A+T455A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所迷多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S113N+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和196的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和196的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)ia、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和196的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn和Thr(或Pro或Phe)。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S113N+S196T(或S196P或S196F)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和462的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基S吏序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Va。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn和Ala。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S113N+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和462的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和462的位置與SEQIDNO:2相差Thr(或Pro或Phe)和Ala。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S196T(或S196P或S196F)+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和462的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41和196的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或VaL在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41和196的位置與SEQIDNO.'2相差I(lǐng)le和Phe(或Pro或Thr)。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的T41I+S196F(或S196P或S196T)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94和226的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94和226的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Ghi、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94和226的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la(或Ser或Arg或Gln)和Ala。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的G94A(或G94S或G94R或G94Q)+T226A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和462的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn、Thr(或Pro或Phe)和Ala。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S113N+S196T(或S196P或S196F)+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157和205的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157和205的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157和205的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)rg和Arg。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的K157R+G205R。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDN0:2的氨基酸I至513的位置157和255的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157和255的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、GIu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157和255的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)rg和Pro。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的K157R+T255P。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和255的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和255的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和255的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)rg和Pro。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的G205R+T255P。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、205和255的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、205和255的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、205和255的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)rg、Arg和Pro。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的K157R+G205R+T255P。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41和193的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41和193的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41和193的位置與SEQIDNO:2相差I(lǐng)le和Lys。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的T41I+E193K。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置41和411的位置與SEQIDNO:2相差I(lǐng)le和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的T41I+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置193和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置193和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置193和411的位置與SEQIDNO:2相差Lys和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的E193K+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41、193和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41、193和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41、193和411的位置與SEQIDNO:2相差I(lǐng)le、Lys和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的T41I+E193K+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247和37的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247和371的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247和371的位置與SEQIDNO:2相差Cys和Cys。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的Y247C+Y371C。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247和411的位置與SEQIDNO:2相差Cys和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的Y247C+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置371和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQID132NO:2的氨基酸1至513的位置371和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置371和411的位置與SEQIDNO:2相差Cys和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的Y371C+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247、371和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247、371和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247、371和411的位置與SEQIDNO:2相差Cys、Cys和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的Y247C+Y371C+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和227的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和227的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和227的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn和Ala(或Leu或Gly)。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S113N+P227A(或P227L或P227G)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和227的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和227的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、IIe、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和227的位置與SEQIDNO:2相差Thr(或Pro或Phe)和Ala(或Leu或Gly)。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S196T(或S196P或S196F)+P227A(或P227L或P227G)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和462的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、GIn、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la(或Leu或Gly)和Ala。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的P227A(或P227L或P227G)+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置U3、196和227的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和227的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和227的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn、Thr(或Pro或Phe)和Ala(或Leu或Gly)。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基S交序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S113N+S196T(或S196P或S196F)+P227A(或P227L或P227G)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227和462的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn、Ala(或Leu或Gly)和Ala。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S113N+P227A(或P227L或P227G)+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227和462的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227和462的位置與SEQIDNO:2相差Thr(或Pro或Phe)、Ala(或Leu或Gly)和Ala。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S196T(或S196P或S196F)+P227A(或P227L或P227G)+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和462的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn、Thr(或Pro或Phe)和Ala。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S113N+S196T(或S196P或S196F)+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227和462的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置1D、196、227和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn、Thr(或Pro或Phe)、Ala(或Leu或Gly)和Ala。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S113N+S196T(或S196P或S196F)+P227A(或P227L或P227G)+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49和113的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49和113的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、丁rp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49和113的位置與SEQIDNO:2相差Ser和Asn。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的N49S+S113N。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49和227的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49和227的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)a、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所迷多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49和227的位置與SEQIDNO:2相差Ser和Ala(或Leu或Gly)。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的N49S+P227A(或P227L或P227G)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49和438的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49和438的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49和438的位置與SEQIDNO:2相差Ser和Leu。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的N49S+P438L。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和438的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和438的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和438的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn和Leu。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S113N+P438L。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和438的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和438的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和438的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la(或Leu或Gly)和Leu。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的P227A(或P227L或P227G)+P438L。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、113和227的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、113和227的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、113和227的位置與SEQIDNO:2相差Ser、Asn和Ala(或Leu或Gly)。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的N49S+S113N+P227A(或P227L或P227G)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、227和438的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、227和438的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、227和438的位置與SEQIDNO:2相差Ser、Ala(或Leu或Gly)和Leu。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的N49S+P227A(或P227L或P227G)+P438L。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227和438的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基S吏序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227和438的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227和438的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn、Ala(或Leu或Gly)和Leu。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S113N+P227A(或P227L或P227G)十P438L。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、113和438的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、113和438的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、113和438的位置與SEQIDNO:2相差Ser、Asn和Leu。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的N49S+S113N+P438L。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、113、227和438的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、113、227和438的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、113、227和438的位置與SEQIDNO:2相差Ser、Asn、Ala(或Leu或Gly)和Leu。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的N49S,S113N+P227A(或P227L或P227G)+P438L。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gy、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)rg和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的K157R+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)rg和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的G205R+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置255和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置255和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置255和411的位置與SEQIDNO:2相差Pro和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的T255P+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、255和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、255和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、255和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)rg、Pro和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所迷多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的K157R+T255P+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205、255和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205、255和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205、255和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)rg、Pro和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的G205R+T255P+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、205和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、205和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、205和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)rg、Arg和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的G205R+G205R+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、205、255和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、205、255和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)Ia、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、Iie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置157、205、255和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)rg、Arg、Pro和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的K157R,G205R+T255P+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置196和411的位置與SEQIDNO:2相差Thr(或Pro或Phe)和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S196T(或S196P或S196F)+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置227和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la(或Leu或Gly)和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的P227A(或P227L或P227G)+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、GIu、Gly、His、IIe、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基S吏序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn、Ala(或Leu或Gly)和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S113N+P227A(或P227L或P227G)+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置196、227和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227和411的位置與SEQIDNO:2相差Thr(或Pro或Phe)、Aa(或Leu或Gly)和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S196T(或S196P或S196F)+P227A(或P227L或P227G)+S41IF。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置113、196和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn、Thr(或Pro或Phe)和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸l至513的S113N+S196T(或S196P或S196F)+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置113、196、227和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置113、196、227和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn、Thr(或Pro或Phe)、Ala(或Leu或Gly)和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S113N+S196T(或S196P或S196F)+P227A(或P227L或P227G)+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和356的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和356的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、GIn、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和356的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn和Ile。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S113N+T3561。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和356的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和356的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和356的位置與SEQIDNO:2相差Thr(或Pro或Phe)和Ile。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S196T(或S196P或S196F)+T356I。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和356的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和356的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和356的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la(或Leu或Gly)和Ile。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的P227A(或P227L或P227G)+T356I。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置356和462的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置356和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置356和462的位置與SEQIDNO:2相差I(lǐng)le和Ala。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的T356I+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227和356的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227和356的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基S吏序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置13、227和356的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn、Ala(或Leu或Gly)和Ile。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S113N+P227A(或P227L或P227G)+T356I。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227和356的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227和356的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227和356的位置與SEQIDNO:2相差Thr(或Pro或Phe)、Ala(或Leu或Gly)和Ile。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S196T(或S196P或S196F)+P227A(或P227L或P227G)+T356I。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227和462的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227和462的位置與SEQIDNO:2相差Thr(或Pro或Phe)、Ala(或Leu或Gly)和Ala。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S196T(或S196P或S196F)+P227A(或P227L或P227G)+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、356和462的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、356和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、356和462的位置與SEQIDNO:2相差Thr(或Pro或Phe)、Ile和Ala。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所迷多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S196T(或S196P或S196F)+T356I+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和356的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和356的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和356的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn、Thr(或Pro或Phe)和Ile。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S113N+S196T(或S196P或S196F)+T356L在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227、356和462的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227、356和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、.Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227、356和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la(或Leu或Gly)、Ile和Ala。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的P227A(或P227L或P227G)+T356I+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置113、196、227和356的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227和356的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所迷多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227和356的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn、Thr(或Pro或Phe)、Ala(或Leu或Gly)和Ile。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S113N+S196T(或S196P或S196F)+P227A(或P227L或P227G)+T356I。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227、356和462的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所迷多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、227、356和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gy、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Va。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置H3、227、356和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn、Ala(或Leu或Gly)、Ile和AIa。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基S吏1至513的SU3N+P227A(或P227L或P227G)+T356I+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置113、196、356和462的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、356和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、356和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn、Thr(或Pro或Phe)、Ile和Ala。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S113N+S196T(或S196P或S196F)+T356I+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置196、227、356和462的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227、356和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196、227、356和462的位置與SEQIDNO:2相差Thr(或Pro或Phe)、Ala(或Leu或Gly)、Ile和Ala。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S196T(或S196P或S196F)+P227A(或P227L或P227G)+T356I+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227、356和462的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227、356和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、GIu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或VaI。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227、356和462的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn、Thr(或Pro或Phe)、Ala(或Leu或Gly)、Ile和Ala。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S113N+S196T(或S196P或S196F)+P227A(或P227L或P227G)+T356I+T462A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和246的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和246的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和246的位置與SEQIDNO:2相差Pro和Ile。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P+T246I。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和251的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和251的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)—步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置21和251的位置與SEQIDNO:2相差Pro和Lys。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P+R251K。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Gu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和411的位置與SEQIDNO:2相差Pro和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57和246的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57和246的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57和246的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn和Ile。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S57N+T246I。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57和251的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57和251的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57和251的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn和Lys。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S57N+R251K。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S57N+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246和251的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246和251的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)Ia、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或VaI。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246和251的位置與SEQIDNO:2相差I(lǐng)le和Lys。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的T246I+R251K。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基S吏序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246和411的位置與SEQIDNO:2相差I(lǐng)le和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的T246I+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置251和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置251和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置251和411的位置與SEQIDNO:2相差Lys和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的R251K+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57和246的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57和246的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57和246的位置與SEQIDNO:2相差Pro、Asn和Ile。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P+S57N+T2461。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、246和251的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、246和251的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、丁yr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、246和251的位置與SEQIDNO:2相差Pro、Ile和Lys。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基S吏序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P+T246I+R251K。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、246和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、246和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)Ia、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、246和411的位置與SEQIDNO:2相差Pro、Ile和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P+T246I+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、246和251的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、246和251的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、246和251的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn、Ile和Lys。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S57N+T246I+R251K。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、246和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、246和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基S吏序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、246和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn、Ile和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S57N+T246I+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、251和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、251和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基S臾序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至5D的位置57、251和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn、Lys和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S57N+R251K+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57和251的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57和251的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57和251的位置與SEQIDNO:2相差Pro、Asn和Lys。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸I至513的S21P+S57N+R251K。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246、251和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246、251和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246、251和411的位置與SEQIDNO:2相差I(lǐng)le、Lys和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的T246I+R251K+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、246和251的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、246和251的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、246和251的位置與SEQIDNO:2相差Pro、Asn、lie和Lys。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P+S57N+T246I+R251K。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、246、251和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、246、251和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、246、251和411的位置與SEQIDNO:2相差Pro、Ile、Lys和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P+T246I+R251K+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、251和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、251和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、251和411的位置與SEQIDNO:2相差Pro、Asn、Lys和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P+S57N+R251K+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、246、251和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、246、251和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57、246、251和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)sn、Ile、Lys和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S57N+T246I+R251K+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、246和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、246和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、246和411的位置與SEQIDNO:2相差Pro、Asn、Ile和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P+S57N+T246I+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、246、251和411的位置不同于SEQIDNO:2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、246、251和411的位置與SEQIDNO:2相差A(yù)la、Arg、Pro、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、246、251和411的位置與SEQIDNO:2相差Pro、Asn、Ile、Lys和Phe。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步與SEQIDNO:2相差SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P+S57N+T246I+R25IK+S411F。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差至少一個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的差異，并任選地進(jìn)一步相差一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356LY371C、S411F和T462A的差異。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差至少兩個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的差異，并任選地進(jìn)一步相差一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356LY371C、S411F和T462A的差異。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差至少三個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、腦6Y、P227L、P227G、T2楊、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的差異，并任選地進(jìn)一步相差一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的差異。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差至少四個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246LY247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的差異，并任選地進(jìn)一步相差一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的差異。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差至少五個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的差異，并任選地進(jìn)一步相差一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的差異。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差至少六個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246LY247C、D259N、R251K、畫1S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的差異，并任選地進(jìn)一步相差一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的差異。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差至少七個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、畫1S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的差異，并任選地進(jìn)一步相差一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的差異。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差至少八個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的差異，并任選地進(jìn)一步相差一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的差異。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差至少九個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的差異，并任選地進(jìn)一步相差一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356LY371C、S411F和T462A的差異。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差至少十個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的差異，并任選地進(jìn)一步相差一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的差異。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差至少十一個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T2楊、Y247C、D259N、R251K、畫1S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的差異，并任選地進(jìn)一步相差一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的差異。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差至少十二個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246LY247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的差異，并任選地進(jìn)一步相差一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的差異。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差至少十三個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、畫1S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的差異，并任選地進(jìn)一步相差一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的差異。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差至少十四個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸l至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、腦6Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、畫1S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的差異，并《壬選地進(jìn)一步相差一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的差異。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差至少十五個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、訓(xùn)6Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的差異，并任選地進(jìn)一步相差一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的差異。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差至少十六個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、腦6Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的差異，并任選地進(jìn)一步相差一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T411、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的差異。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差至少十七個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸l至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的差異，并任選地進(jìn)一步相差一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的差異。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差至少十八個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的差異，并任選地進(jìn)一步相差一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356LY371C、S411F和T462A的差異。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差至少十九個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T2461、Y247C、D259N、R251K、翻1S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的差異，并任選地進(jìn)一步相差一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的差異。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差至少二十個(gè)選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的差異，并任選地進(jìn)一步相差一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的差異。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:2相差至少由SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W組成的差異，并任選地進(jìn)一步相差一個(gè)或多個(gè)選自S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356LY371C、S411F和T462A的差異。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽由341至350、351至360、361至370、371至380、381至390、391至400、401至410、411至420、421至430、431至440、441至450、451至460、461至470、471至480、481至490、491至500或501至513個(gè)氨基酸組成。所述分離的多肽與多肽SEQIDNO:2相比具有一種或多種改進(jìn)的性質(zhì)，其中所述改進(jìn)的性質(zhì)選自如本文所述的熱活性、熱穩(wěn)定性、pH活性、pH穩(wěn)定性、底物特異性、產(chǎn)物特異性和化學(xué)穩(wěn)定性。本發(fā)明也涉及編碼上述多肽的分離的核苷酸序列、包含該核苷酸序列的核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞，和產(chǎn)生具有糖苷水解酶活性的多肽的方法，根據(jù)本文對(duì)于糖香水解酶變體的相同的公開。纖維二糖水解酶I和其核苷酸序列本發(fā)明也涉及具有纖維二糖水解酶I活性的分離的多肽并涉及編碼所述多肽的分離的核苷酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述具有纖維二糖水解酶I活性的分離的多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位基因變體；或其具有纖維二糖水解酶I活性的片段。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513,或其等位基因變體；或其具有纖維二糖水解酶I活性的片段。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位基因變體；或其具有纖維二糖水解酶I活性的片段組成。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸1至513或其等位基因變體；或具有纖維二糖水解酶I活性的片段組成。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸1至513組成。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核苷酸序列列于SEQIDNO:1。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸序列是質(zhì)粒pAJ052中包含的序列，所述質(zhì)粒pAJ052包含于大腸桿菌NRRLB-30683。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核苷酸序列是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核苷酸序列是質(zhì)粒pAJ052中包含的成熟多肽編碼區(qū)，所述質(zhì)粒pAJ052包含于大腸桿菌NRRLB-30683。本發(fā)明也包括核苷酸序列，其編碼具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽，或其成熟多肽，其由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性不同于SEQIDNO:1。本發(fā)明也涉及SEQIDNO:1的子序列，其編碼具有纖維二糖水解酶I活性的SEQIDNO:2的片段。SEQIDNO:2的片段是多肽，其具有一個(gè)或多個(gè)由此氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失的氨基酸。優(yōu)選地，片段包含至少450個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少470個(gè)氨基酸殘基，和最優(yōu)選至少490個(gè)氨基酸殘基。SEQIDNO:l的子序列是由SEQIDNO:l包括的核酸序列，除了已經(jīng)從所述的5'和/或3'末端缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，子序列包含至少1350個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少1410個(gè)核苷酸，和最優(yōu)選至少1470個(gè)核苷酸。本發(fā)明也涉及突變體核酸序列，其在SEQIDNO:l的成熟多肽編碼序列中包括至少一個(gè)突變，其中所述的突變體核酸序列編碼多肽，所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸1至513組成。本發(fā)明也涉及包含所述核苷酸序列的核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞，所述核苷酸序列編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸l至513?？扇绫疚乃鰳?gòu)建核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生具有纖維二糖水解酶活性的多肽的方法，其包括(a)培養(yǎng)菌抹以產(chǎn)生所述的多肽，該菌抹以其野生型形式能產(chǎn)生所述多肽；和(b)根據(jù)本文所述的方法回收所述的多肽。優(yōu)選地，所述菌抹為木霉屬的菌抹，并更優(yōu)選7h'c/zocfer,reeyg"本發(fā)明也涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有助于產(chǎn)生所述多肽的條件下，培養(yǎng)包含編碼所述多肽的核苷酸序列的宿主細(xì)胞；和(b)根據(jù)本文所述的方法回收所述的多肽。將生物質(zhì)降解為單糖、二糖和多糖本發(fā)明的糖苷水解酶變體、具有糖苷水解酶活性的多肽和宿主細(xì)胞，可以用于由生物質(zhì)(biomass)產(chǎn)生單糖、二糖和多糖作為化學(xué)原料或發(fā)酵原料以產(chǎn)生乙醇、塑料或其他產(chǎn)品或中間體。所述的糖苷變體和具有糖苷水解酶活性的多肽可為去除細(xì)胞或者不去除細(xì)胞的粗發(fā)酵液的形式，或?yàn)榘?純化或純化的酶制劑的形式?？商鎿Q地，本發(fā)明宿主細(xì)胞在生物質(zhì)的發(fā)酵過(guò)程中可用作所述變體或具有糖香水解酶活性的多肽的來(lái)源。生物質(zhì)可以包括，但不限于，木材資源(woodresource),城市固體廢物、廢紙和作物殘余物(參見，例如，Wiselogel等，1995,在T/a"必ooA歷oe〃旭"(/(CharlesE.Wyman,editor),pp,105-118，Taylor&Francis,WashingtonD.C.;Wyman，1994，所omsowrce7fec/z"o/ogy50:3-16;Lynd,1990,5z.oc/zem/5tr_yaw/5z'o&c/zwo/ogy24/25:695-719;Mosier等，1999,/ece"/￡"gz'ween>ig/Bfofec/mo/ogy,T.Scheper,managingeditor,Volume65,pp.23-40,Springer-Verlag,NewYork)。生物質(zhì)的初生細(xì)胞壁(primarycellwall)中最主要的多糖是纖維素，第二豐富的是半-纖維素(hemi-cdlulose),第三是果膠(pectin)。細(xì)胞停止生長(zhǎng)后產(chǎn)生的次生細(xì)胞壁(secondarycellwall)也含有多糖，并通過(guò)與半纖維素共價(jià)交聯(lián)的聚合的木質(zhì)素來(lái)增強(qiáng)。纖維素是脫水纖維二糖(anhydrocellobiose)的均聚物(homopolymer)，因而成為線狀的beta-(l-4)-D-葡聚糖，而半纖維素包括各種化合物，諸如具有一系列(spectrum)取代基的復(fù)合分支結(jié)構(gòu)的木聚糖(xylan)、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖(ambinoxylan)和甘露聚糖(mannan)。雖然纖維素通常是多態(tài)的(polymorphous),但發(fā)現(xiàn)纖維素在植物組織中主要作為平行葡聚糖鏈(parallelglucanchain)的不可溶的結(jié)晶母體(crystallinematrix)。半纖維素通常與纖維素以及其他半纖維素通過(guò)氫鍵連接，這有助于穩(wěn)定細(xì)胞壁基質(zhì)(cellwallmatrix)。三種主要類型的糖水解酶(glycohydrolase)用于分解纖維素的生物質(zhì)(1)"內(nèi)-l，4-beta-葡聚糖酶"或1,4-beta-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC3.2.1.4),其隨機(jī)地作用于可溶的和不可溶的1,4-beta-葡聚糖底物。(2)"外-l，4-beta-D-葡聚糖酶"，其包括1，4-beta-D-葡聚糖葡糖水解酶(EC3.2丄74),其從1,4-beta-D-葡聚糖釋放D-葡萄糖并緩慢地水解D-纖維二糖；和纖維二糖水解酶(l,4-beta-D-葡聚糖纖維素二糖水解酶，EC3.2丄91)，其從1,4-beta-葡聚糖釋放D-纖維二糖。(3)"beta-D-葡糖苷酶"或beta-D-葡糖苷葡糖水解酶(EC3.2丄21),其作用為從纖維二糖和可溶的纖維糊精(cellodextrin)中釋放D-葡萄糖單元，以及一系列的糖苦。這三類酶一起協(xié)同作用，導(dǎo)致有效地解晶(decrystallization)和水解來(lái)自生物質(zhì)的天然纖維素以產(chǎn)生還原糖類。本發(fā)明的糖苷水解酶變體和具有糖苷水解酶活性的多肽可以與上述提及的酶一起應(yīng)用，以進(jìn)一步降解生物質(zhì)底物的纖維素成分(參見，例如，Brigham等,1995，在T/(377必0(9A:ow歷o"/2"wo/(CharesE.Wyman,editor),pp.119-141，Taylor&Francis,WashingtonD.C.;Lee，1997，Jbma/o/5/ofec/z"o/ogy56:1-24)。乙醇可以通過(guò)酶法降解生物質(zhì)及將釋放的糖類轉(zhuǎn)化為乙醇來(lái)制備。這類乙醇常常被稱為生物乙醇(bioethanol)或生物燃料(biofuel)。它可以在少于1%直至100%(燃料替代物)的混合物中用作燃料添加劑或補(bǔ)充劑(extender)。洗滌劑組合物可加入本發(fā)明的變體和具有糖苦水解酶活性的多肽，其由此成為洗滌劑組合物的成分。本發(fā)明的洗滌劑組合物可被，例如，配制為手洗或機(jī)洗的洗滌劑組合物，其包括適于預(yù)-處理弄臟的纖維織物的洗衣添加劑組合物，和漂洗加入的織物柔軟劑組合物，或被配制為洗滌劑組合物，用于一般的家庭硬面的清潔操作，或被配制用于手洗或機(jī)洗碟子的操作。在具體的方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的變體和具有糖苷水解酶活性的多肽的洗滌劑添加劑。所述的洗滌劑添加劑，以及所述的洗滌劑組合物可包括一種或多種其他的酶，如蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶(cutinase)、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶(pectinase)、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶(galactanase)、木聚糖酶、氧化酶，例如，漆酶和/或過(guò)氧化物酶。通常，所述酶成分的性質(zhì)應(yīng)該與所選擇的洗滌劑相適應(yīng)(即，最適pH、與其他的酶成份和非-酶成份的相容性等)，而且所述酶成分應(yīng)以有效量存在。蛋白酶:合適的蛋白酶包括那些動(dòng)物、植物或微生物來(lái)源的，優(yōu)選微生物來(lái)源的。包括化學(xué)修飾的或蛋白工程的突變體。所述的蛋白酶可為絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶-樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實(shí)例是枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)，尤其是那些源自芽孢桿菌的，例如，枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(在WO89/06279中描述)。胰蛋白酶-樣蛋白酶的實(shí)例是胰蛋白酶(例如，來(lái)源于豬或牛)和在WO89/06270和WO94/25583中描述的鐮孢蛋白酶。有用的蛋白酶的實(shí)例是在WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和WO98/34946中描述的變體，尤其是在一個(gè)或多個(gè)下列位點(diǎn)具有取代的變體27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。優(yōu)選的商業(yè)上可得到的蛋白酶包括Alcalase、Savinase、PrimasTM、Duralase、Esperase和Kannase(NovozymesA/S),Maxatase、Maxacal、MaxapemTM、ProperaseTM、PurafectTM、PurafectOxPTM、FN2TM禾口FN3(GenencorInternationalInc.)。脂肪酶:合適的脂肪酶包括那些細(xì)菌來(lái)源或真菌來(lái)源的。包括化學(xué)修飾的或蛋白工程的突變體。有用的脂肪酶的實(shí)例包括來(lái)自腐質(zhì)霉屬(異名嗜熱霉屬)的脂肪酶，例如來(lái)自//./朋wg/wwa(7:/朋Mg/"osw)，如在EP258068和EP305216中所描述的，或來(lái)自z'rao/era，如在WO96/13580中所描述的；假單胞菌脂肪酶，例如來(lái)自產(chǎn)堿假單胞菌(尸a/ca/z'g^re力或類產(chǎn)堿假單胞菌(P/^0^3/^//^脫力(￡218272)、洋蔥假單胞菌CPce;flc/")(EP331376)、施氏假單胞菌CRWwteeW)(GB1,372,034)、熒光假單胞菌(P/7wo/^cera)、假單胞菌菌抹SD705(WO95/06720和WO96/27002)、PM^co"w"e"^s(WO96/12012);芽孢桿菌脂肪酶，例如來(lái)自枯草芽孢桿菌(Dartois等，1993，所oc/em!'cad所oj^;^'c"Jcto,1131,253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)或短小芽孢桿菌(及；ww,7"力(WO91/16422)。其他實(shí)例為脂肪酶變體如那些在WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中所描述的。優(yōu)選的商業(yè)可得到的脂肪酶包括Lipolase和LipolaseUltra(NovozymesA/S)。淀粉酶-.合適的淀粉酶(a-和/或卩-)包括那些細(xì)菌來(lái)源或真菌來(lái)源的。包括化學(xué)修飾的或蛋白工程的突變體。淀粉酶包括，例如，從芽孢桿菌得到的a-淀粉酶，例如地衣芽孢桿菌的具體菌抹，在GB1,296,839中詳述。有用的淀粉酶的實(shí)例為在WO94/02597、WO94/18314、W096/23873、WO97/43424中描述的變體，尤其是在一個(gè)或多個(gè)如下位點(diǎn)具有取代的變體15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。商業(yè)上可得到的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BAN(NovozymesA/S),Rapidase丁M和Pumstar(來(lái)自genencorInternationalInc.)。纖維素酶:合適的纖維素酶包括那些細(xì)菌來(lái)源或真菌來(lái)源的。包括化學(xué)修飾的或蛋白工程的突變體。合適的纖維素酶包括來(lái)自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢屬、Thielavia、枝頂孢霉屬的纖維素酶，例如US4,435,307、US5,648,263、US5,691,178、US5,776,757和WOS9/09259中公開的由/^mz'co/a//wo/era、嗜熱毀絲霉和尖鐮孢產(chǎn)生的真菌纖維素酶。特別合適的纖維素酶是具有顏色養(yǎng)護(hù)(colourcare)益處的堿性或中性的纖維素酶。這樣的纖維素酶的實(shí)例為在EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中描述的纖維素酶。其他實(shí)例為纖維素酶變體，如那些在WO94/07998,EP0531315、US5,457，046、US5,686,593、US5,763,254、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中所描述的。商業(yè)上可得到的纖維素酶包括CelluzymeTM和Carezyme(NovozymesA/S),ClazinaseTM和PuradaxHATM(genencorInternationalInc.)和KAC-500(B)TM(KaoCorporation)。過(guò)氧化物酶/氧化酶:合適的過(guò)氧化物酶/氧化酶包括那些植物、細(xì)菌或真菌來(lái)源的。包括化學(xué)修飾的或蛋白工程的突變體。有用的過(guò)氧化物酶的實(shí)例包括來(lái)自鬼傘屬(Q)pn'm^)，例如來(lái)自灰蓋鬼傘(C.d"erews)的過(guò)氧化物酶，及其變體，如那些在WO93/24618、WO95/10602和WO98/15257中所描述的。商業(yè)上可得到的過(guò)氧化物酶包括Guardzyme(NovozymesA/S)。所述的酶成分可通過(guò)加入含有一種或多種酶的獨(dú)立的添加劑，或通過(guò)加入包含所有這些酶的組合的添加劑，包含于洗滌劑組合物中。本發(fā)明的洗滌劑添加劑，即獨(dú)立的添加劑或組合的添加劑，可以配制為，例如顆粒、液體、漿體(sluny)等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑配制為顆粒，尤其是非-粉化的(non-dusting)顆粒，液體，尤其是穩(wěn)定的液體，或漿體。非-粉化的顆?？梢裕?，如在IJS4,106,991和4,661,452中所公開的進(jìn)行制備，并可以任意地通過(guò)本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的方法進(jìn)行包覆(coat)。蠟質(zhì)包覆材料(waxycoatingmaterial)的實(shí)例是具有1000至20000的平均分子量的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)品(聚乙二醇(polyethyleneglycol)，PEG);具有16至50個(gè)環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化的壬基酚(ethoxylatednonylphenols);乙氧基化的脂肪醇，其中所述的醇包含12至20個(gè)碳原子，而且其中有15至80個(gè)環(huán)氧乙烷單元；脂肪醇類；脂肪酸；和脂肪酸的甘油單酯和甘油二酯和甘油三酯。適于以流化床技術(shù)應(yīng)用的成膜包覆材料(film-formingcoatingmaterial)的實(shí)例在GB1483591中^^出。液體酶制劑可，例如，根據(jù)已建立的方法，通過(guò)添加多元醇(polyol),如丙二醇(propyleneglycol),糖或糖醇(sugaralcohol),乳酸或硼酸(boricacid)穩(wěn)定化。保護(hù)的酶可根據(jù)在EP238,216中公開的方法進(jìn)行制備。本發(fā)明的洗滌劑組合物可為任何方便的形式，例如，條、片、粉、顆粒、糊或液體。液體洗滌劑可為水性的，通常包含多至70%的水和0-30%的有機(jī)溶劑；或?yàn)榉?水性的。所述的洗滌劑組合物包含一種或多種表面活性劑(surfactant)，其可為非-離子的，包括半-極性的(semi-polar)和/或陰離子的和/或陽(yáng)離子的和/或兩性離子的(zwitterionic)。所述的表面活性劑通常以0.1%至60%(按重量計(jì)算)的水平存在。當(dāng)所述洗滌劑在其中包含時(shí)，所述的洗滌劑通常包含大約1%至大約40%的陰離子表面活性劑，諸如線狀的烷基苯磺酸鹽(linearalkylbenzenesulfonate)、alpha-烯烴磺酸鹽(alpha-olefinsulfonate),烷基硫酸酯(alkylsulfate)(月旨肪醇硫酸酯(fattyalcoholsulfate)),醇乙氧基硫酸酯(alcoholethoxysulfate),仲烷基磺酸鹽(secondaryalkanesulfonate),alpha-石黃基月旨肪酸曱酉旨(alpha-sulfofattyacidmethylester),步克基-或蜂基丁二酸(alkenylsuccinicacid)或月巴急。當(dāng)所述洗滌劑在其中包含時(shí)，所述的洗滌劑通常包含大約0.2%至大約40%的非-離子表面活性劑，諸如醇乙氧基化合物，壬基朌乙氧基化合物(nonylphenolethoxylate)，烷基聚糖苷(alkylpolyglycoside)，烷基二甲基氧化胺(aikyldimethylamineoxide),乙氧化的脂肪酸單乙醇酰胺(ethoxylatedfattyacidmonoethanolamide)，月旨肪酸單乙醇酰胺(fattyacidmonoethanolamide),多羥基烴基脂肪酸酰胺(polyhydroxyalkylfattyacidamide),或葡糖胺(glucosamine)("葡糖酰胺(glucamides)，，)的N-?；鵑烴基(N-acylN-alkyl)衍生物。所述的洗滌劑可包含0-65%的洗滌增效助劑(detergentbuilder)或絡(luò)合劑(complexingagent),諸如沸石(zeolite),二磷酸鹽(diphosphate),三磷酸鹽(triphosphate),磷酸鹽(phosphonate)，碳酸鹽(carbonate),杵4蒙酸鹽(citrate),氮川三乙酉臾(nitrilotriaceticacid)，乙二胺四乙酉臾(ethylenediaminetetraaceticacid),二)欠乙基三胺五乙酉吏(diethylenetriaminepentaaceticacid)，步克基-或烯基丁二酸，可溶性的硅酸鹽(silicate)或?qū)訝罟杷猁}(例如來(lái)自Hoechst的SKS-6)。所述的洗滌劑可包括一種或多種聚合物。實(shí)例為羧曱基纖維素(carboxymethylceliulose),聚(乙烯跳咯烷酮)(polyvinylpyrrolidone)),聚(乙二醇)(poly(ethyleneglycol)),聚(乙烯醇)(poly(vinylalcohol》，聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(poly(vinylpyridine-N-oxide)),聚(乙烯口米峻)(poly(vinylimidazole)),聚羧酸酯(polycarboxylates),諸如聚丙烯酸酯(polyacrylate)，馬來(lái)酸/丙烯酸共聚物(maleic/acrylicacidcopolymer)和十二烷基甲基丙烯酸酉旨/丙烯酸共聚物(laurylmethacrylate/acrylicacidcopolymer)。所述的洗滌劑可包含漂白裝置，所述漂白裝置可包括^02源，諸如過(guò)硼酸鹽(perborate)或過(guò)碳酸鹽(percarbonate),其可與形成過(guò)酸的漂白活化劑(peracid-formingbleachactivator),3口四乙酰乙二胺(tetraacetylethylenediamine)或壬酰氧基苯磺酸酯(nonanoyloxybenzenesulfonate)組合?？商鎿Q地，所述漂白裝置可包括例如酰胺類、酰亞胺類或砜類的過(guò)氧酸。本發(fā)明的洗滌劑組合物的酶成分可應(yīng)用常規(guī)的穩(wěn)定劑進(jìn)行穩(wěn)定化，所述的穩(wěn)定劑例如，多元醇如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物，例如，芳香族的硼酸酯(aromaticborateester)或苯基硼酸衍生物如4-曱酰笨基(formylphenyl)硼酸，而所述的組合物可例如在WO92/19709和WO92/19708中所描述的進(jìn)行配制。所述的洗滌劑也可含有其他常規(guī)洗滌劑成分，例如纖維調(diào)節(jié)劑(fabricconditioners)包4舌粘土(clay),發(fā)泡劑(foambooster),承卩泡劑(sudssuppressor),防腐性劑(anti-corrosionagent),懸污劑(soil-suspendingagent),抗污祐再沉積試劑(anti-soilredepositionagent),染料(dye)，殺菌劑(bactericide),光學(xué)增白劑(opticalbrightener)，助水溶物(hydrotrope),晦暗抑制劑(tarnishinhibitor)或香料(perflime)。在所述的洗滌劑組合物中，任何酶成分，尤其是本發(fā)明的變體和具有糖苷水解酶活性的多肽，可以以相應(yīng)于0.01-100mg的酶蛋白每升洗滌液(washliquor)的量加入，優(yōu)選0.05-5mg的酶蛋白每升洗滌液，尤其是0.1-1mg的酶蛋白每升洗滌液。本發(fā)明的變體和具有糖苷水解酶活性的多肽可附加地并入WO97/07202中公開的洗滌劑配方，WO97/07202在此并入作為參考。植物本發(fā)明也涉及轉(zhuǎn)基因的植物、植物部分或植物細(xì)胞，其已經(jīng)用編碼本發(fā)明的變體或具有糖苷水解酶活性的多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化，以表達(dá)并產(chǎn)生可回收量的所述變體或多肽。所述變體或多肽可從植物或植物部分中回收?？商鎿Q地，可應(yīng)用所述的包含所述變體或多肽的植物或植物部分以提高食物(food)或飼料(feed)的質(zhì)量，例如，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值(nutritionalvalue)、適口性(palatability)和流變學(xué)的(rheological)性質(zhì)，或破壞反營(yíng)養(yǎng)性的因子(antinutritivefactor)。轉(zhuǎn)基因的植物可為雙子葉的(dicotyledonous)(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實(shí)例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadowgrass)(藍(lán)草(bluegrass),早熟禾屬(Poa));飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(Fe"wca)、黑麥草屬(Zo〃ww);寒;也型斗丈草(temperategrass),i口Agrostis;禾口谷類，例i口，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻米(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實(shí)例是煙草(tobacco)，豆類(legumes),如羽扇豆(lupins)，馬鈴薯，糖甜菜(sugarbeet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)才直4勿(十字花牙牛(familyBrassicaceae))，^口花相卩菜(cauliflower),油菜籽(rapeseed)和緊密相關(guān)的模型生物體擬南芥(y4rahWop^Aa//^a)。植物部分的實(shí)例是莖(stem)、愈傷組織(callus)、葉(leave)、根(root)、果實(shí)(fruits)、種子(seed)和塊莖(tuber),以及包含這些部分的獨(dú)立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyma)、維管組織(vasculartissues)、分生組織(meristems)。而且具體的才直物細(xì)月包區(qū)室(compartments),i口葉綠體(chioroplast)、質(zhì)夕卜體(apoplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(vacuole)、過(guò)氧化物酶體(peroxisome)和細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)也被認(rèn)為是植物部分。此外，任何植物細(xì)胞，無(wú)論什么組織來(lái)源，都被認(rèn)為是植物部分。同樣地，植物部分，如分離以促進(jìn)本發(fā)明的應(yīng)用的具體組織和細(xì)胞也被認(rèn)為是植物部分，例^口胚月臺(tái)(embryos)、胚乳(endosperms)、糊4分(aleurone)和種皮(seedcoat)。上述植物、植物部分和植物細(xì)胞的子代也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。表達(dá)本發(fā)明的變體或多肽的轉(zhuǎn)基因的植物或植物細(xì)胞，可以依照本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的方法構(gòu)建。簡(jiǎn)言之，所述植物或植物細(xì)胞通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)編碼本發(fā)明的變體或多肽的表達(dá)構(gòu)建體整合入植物宿主基因組，并將所得的修飾的植物或植物細(xì)胞在轉(zhuǎn)基因的植物或植物細(xì)胞中增殖來(lái)進(jìn)行構(gòu)建。方便地，所述的表達(dá)構(gòu)建體是核酸構(gòu)建體，其包含編碼本發(fā)明的變體或多肽的核酸序列，所述核酸序列可操作地與在優(yōu)先選擇的植物或植物部分中表達(dá)所述核酸序列所必需的適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列相連接。此外，所述的表達(dá)構(gòu)建體可包含可選擇的標(biāo)記，其用于鑒別已經(jīng)整合入所述表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，和將該構(gòu)建體導(dǎo)入所述植物必需的DNA序列(后者依賴于所采用的DNA導(dǎo)入方法)。調(diào)控序列，如啟動(dòng)子和終止子序列及任選的信號(hào)序列或轉(zhuǎn)運(yùn)(transit)序列的選擇，例如，在需要所述變體或多肽何時(shí)、何地和怎樣表達(dá)的基礎(chǔ)上進(jìn)行確定。例如，表達(dá)編碼本發(fā)明的變體或多肽的基因可為組成型的(constitutive)或誘導(dǎo)型的(inducible)，或可為發(fā)育特異性的、階段特異性的或組織特異性的，而基因產(chǎn)物可耙向具體的組織或植物部分，如種子或葉。調(diào)控序列為，例如，由Tague等，1988,PlantPhysiology86:506所描述的。對(duì)于組成型表達(dá)，可以應(yīng)用35S-CaMV啟動(dòng)子、玉米泛素(maizeubiquitin)1啟動(dòng)子和稻肌動(dòng)蛋白(riceactin)1啟動(dòng)子(Franck等，1980，CW/21:285-294;Christensen等，1992,P/aWMa歷o/.18:675-689;Zhang等，1991，P/aWCe〃3:1155-1165)。器官特異性的啟動(dòng)子可為，例如，來(lái)自貯藏庫(kù)組織(storagesinktissue),如種子、馬鈴薯根莖和果實(shí)的啟動(dòng)子(Edwards&Coruzzi,1990,爿朋.iev,24:275-303),或來(lái)自代謝庫(kù)組織(metabolicsinktissues),如分生組織(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24:863-878),種子特異性的啟動(dòng)子，諸如來(lái)自稻的谷蛋白(glutelin)啟動(dòng)子、醇溶蛋白(prolamin)啟動(dòng)子、球蛋白(globulin)啟動(dòng)子或白蛋白(albumin)啟動(dòng)子(Wu等，l"8,尸/朋dCe//尸/2"/0/ow39:885-889)，來(lái)自豆球蛋白(legumin)B4和蠶豆(Wc/fly^a)的未知的種子蛋白基因的蠶豆啟動(dòng)子(Conrad等，1998,/0w72a/0/P/aW尸/z;w'0/0gK152:708-711)、來(lái)自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動(dòng)子(Chen等，1998,PlantandCellPhysiology39:935-941),來(lái)自歐洲油菜08ra^/ca"op^)的貯藏蛋白napA啟動(dòng)子，或本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的任何其他種子特異性的啟動(dòng)子，例如，在WO91/14772中所描述的。此外，啟動(dòng)子可為葉特異性的啟動(dòng)子，如來(lái)自稻或番茄的rk^啟動(dòng)子(Kyozuka等，1993，P/aWP/^/o/ogy102:991-1000),小球藻病毒(chlorellavims)腺嘌呤曱基轉(zhuǎn)移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動(dòng)子(Mitra和Higgins,1994,P/a"/A/o/ecM/w歷o/。^26:85-93),或來(lái)自稻的aW尸基因啟動(dòng)子(Kagaya等，1995,A^/ecw/w"wdgewera/ge""/"248:668-674),或傷口誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如馬鈴薯pin2啟動(dòng)子(Xu等，1993，Mo/ew/"r說(shuō)'o/ogy22:573-588)。同樣地，所述啟動(dòng)子可通過(guò)非生物的處理誘導(dǎo)，所述非生物的處理諸如溫度、干旱或鹽度變化，或通過(guò)外源應(yīng)用的激活所述啟動(dòng)子的物質(zhì)誘導(dǎo)，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脫落酸(abscisicacid)、赤霉酸(gibberellicacid)和/或重金屬。啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件也可用于在所述植物中實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的多肽的更高表達(dá)。例如，所述啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件可為內(nèi)含子(intron),其被置于啟動(dòng)子和編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列之間。例如，Xu等，1993,見前文，公開了稻肌動(dòng)蛋白l基因的第一個(gè)內(nèi)含子增強(qiáng)表達(dá)的應(yīng)用?？蛇x擇的標(biāo)記基因和所述表達(dá)構(gòu)建體的任何其他部分，可選自本
技術(shù)領(lǐng)域：
中可得到的那些。所述的核酸構(gòu)建體，根據(jù)本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的常規(guī)技術(shù)，整合入植物基因組，包括土壤桿菌(Jgra6acte^m)-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊(particlebombardment)、生物射彈轉(zhuǎn)化(biolistictransformation)和電穿孑L(Gasser等，1990,S"ewce244:1293;Potrykus,1990,所o/歸wo/ogy8:535;Shimamoto等，1989,胸匿338:274)。目前,才艮癌土;裏才干菌(Jgra6ac/en'ww/wme^zc/era)-介導(dǎo)的基因壽爭(zhēng)移(genetransfer),是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的優(yōu)先選擇的方法(為了考察，參見Hooykas和Schilperoort,1992,/7a"fMo/ecw/ar19:15-38),而且它也可以用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，雖然對(duì)于這些植物其他的轉(zhuǎn)化方法通常是優(yōu)選的。目前，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的優(yōu)先選擇的方法，是用粒子(涂有轉(zhuǎn)化DNA的微觀的金或鵠粒子)轟擊胚胎愈傷組織(embryoniccalli)或發(fā)育中的胚芽(developingembryos)(Christou,1992,P/aWJoMma/2:275-281;Shimamoto，1994,C野e對(duì)所她c/7"o/ogy5:158-162;Vasiletal.，1992,所o/rec/ww/ogv10:667-674)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的可替換的方法，是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如由Omimlleh等，1993,尸/朋fMZ簡(jiǎn)/ar腸/ogy21:415-428中所描述的。轉(zhuǎn)化之后，選"^具有整合的表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體，并將其根據(jù)本
技術(shù)領(lǐng)域：
中熟知的方法在全植物中再生。轉(zhuǎn)化步驟常常是為了在再生的過(guò)程中或在后面的世代中，通過(guò)應(yīng)用，例如，以兩個(gè)獨(dú)立的T-DNA構(gòu)建體共轉(zhuǎn)化或用特異性的重組酶(recombinase)位點(diǎn)特異性地切除選擇基因(selectiongene),選擇性去除選擇基因而設(shè)計(jì)的。本發(fā)明也涉及產(chǎn)生本發(fā)明的變體或多肽的方法，其包括(a)在有助于產(chǎn)生所述變體的條件下培養(yǎng)包含核酸序列的轉(zhuǎn)基因的植物或植物細(xì)胞，所述核酸序列編碼本發(fā)明的變體或具有糖苷水解酶活性的多肽；和(b)回收所述的變體或多肽。其他應(yīng)用本發(fā)明的具有糖苷水解酶活性的糖苷水解酶變體或多肽，也可以作為生物拋光劑(biopolishingagent)用于處理紡織品，并用于減少起毛(fbzz)、起球(pilling)、質(zhì)i也改變(texturemodification)和石'冼(stonewashing)(N.K.Lange，inP.Suominen，T.Reinikainen(Eds.),IHc/zocfemareesefCeZ/w/oses(9f/ze"外t/ro/a浴,FoundationforBiotechnicalandIndustrialFermentationResearch,Helsinki,1993,pp.263-272)。此外，所述具有糖苷水解酶活性的變體或多肽也可以用于木材加工中的生物制漿(biopulping)或去皮(debarking)，造紙中的纖維改性(fibermodification)、漂白和降低精制能源成本，白水處理(Whitewatertreatment),對(duì)于回收廢水(wastewaterrecycling)、回收木質(zhì)纖維素的(lignocellulosic)纖維(如脫墨(deinking)和次級(jí)纖維(secondaryfiber)加工)，和木材殘余物應(yīng)用來(lái)說(shuō)是重要的(S.D,Mansfield和A.R.Esteghlalian在S.D,Mansfield矛口J.N.Saddler(Eds.)，^/^//ca/wMsEw2ym&ytoZj.g/wce〃w/os7'(^y,ACSSymposiumSeries855，Washington,D.C.，2003，pp.2-29)。本發(fā)明通過(guò)如下實(shí)施例進(jìn)一步描述，所述的實(shí)施例不應(yīng)看作對(duì)本發(fā)明的范圍的跟制。實(shí)施例菌抹7h'c/KKfermareesdRutC30(ATCC56765;Montenecourt和Eveleigh,1979,Adv.Chem.Ser.181:289-301)來(lái)源自7h.c/zocfewwwe化z'Qm6A(ATCC13631;Mandels和Reese,1957,J.Bacteriol.73:269-278)。米曲霉Jal250菌抹(WO99/61651)用于表達(dá)所述熱穩(wěn)定的beta-葡糖苷酶。釀酒酵母YNG344(MATa,ura3-52,Ieu-2A2,pep4Al，Ws4-539,cir。)用于產(chǎn)生突變的糖苷水解酶(Cel7A)的文庫(kù)。用于產(chǎn)生質(zhì)粒的細(xì)菌菌抹為EpicuriancoliXL-10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(ultracompetentcell),(Stratagene，Inc.，LaJolla，CA)。培養(yǎng)基和'溶液酵母選擇培養(yǎng)基，由每升6.7g酵母氮堿基(nitrogenbase)、0.8g完全補(bǔ)充'混合物(completesupplementmixture)(CSM,Qbiogene,Inc.,Carlsbad,CA;在夫少尿嘧啶(uracil)并含有40mg/ml的腺嘌呤(adenine))、5g酪蛋白氨基酸(casminoacid)和20gNoble瓊脂組成。所述培養(yǎng)基也含有50mM琥珀酸鹽(succinate)pH5.0、2%葡萄糖和25嗎氯霉素(chloramphenicol)。酵母篩選培養(yǎng)基由每升6.7g酵母氮堿基、0、8gCSM-URA、5g酪蛋白氨基酸和20gNoble瓊脂組成。所述培養(yǎng)基每ml也含有50mM琥珀酸鹽pH5.0、2%半乳糖、0.1%葡萄糖和25(ig氯霉素。YPD培養(yǎng)基，由每升10g酵母提取物、20g細(xì)菌用胰蛋白胨(bactotryptone)和40ml50%葡萄糖組成。纖維素酶-誘導(dǎo)培養(yǎng)基由每升20g的ArboceiB800-天然纖維素纖維(J.RettenmaierUSALP，Schoolcraft,Michigan)、10g玉米》菱泡固體(cornsteepsolid)(SigmaChemicalCo"St,Louis,MO)、1,45g(NH4)2S04、2.08gKH2P04、0.28gCaCl2、0.42gMgS04'7H20、0.42ml7Hc/w&wwMaye/痕量金屬溶液和2滴pluronicacid組成；用10NNaOH將pH調(diào)節(jié)至6.0。7Hc/zwfermaree^'痕量金屬溶液由每升216gFeCl3*6H20、58gZnS04*7H20、27gMnS04*H20、10gCuS04'5H20、2.4gH3B03和336g檸檬酸組成。COVE選擇平板由每升342.3g蔗糖、20mlCOVE鹽溶液、10mM乙酰胺、15mMCsCl2和25gNoble瓊脂組成。COVE2加尿苷平板由每升30g蔗糖、20mlCOVE鹽溶液、10mM乙酰胺、10mM尿苷和25gNoble瓊脂組成。COVE鹽溶液由每升26gKCl、26gMgS04'7H20、76gKH2P04和50ml的COVE痕量金屬組成。'COVE痕量元素溶液(traceelementssolution)由每升0.04gNaB4O7'10H2O、0.4gCuSO4-5H2O、1.2gFeS04.7H20、0.7gMnS04-H20、0.8gNa2Mo02'2H20和10gZnS(V7H2O組成。PDA培養(yǎng)基由每升39克的馬鈴薯右旋糖瓊脂組成。IXSSC由每升8.765g氯化鈉和4.41g檸檬酸鈉組成。PEG緩沖液由每升500gPEG4000(BDH,Poole,England)、10mMCaCl2和10mMTris-HClpH7.5(過(guò)濾除菌)組成。STC由每升1M山梨醇、10mMCaCl2和10mMTris-HC1pH7.5組成，并過(guò)濾除菌。THdz^/ermareesd接種物培養(yǎng)基由每升20g葡萄糖、10g玉米浸泡固體(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO)、1.45g(NH4)2S04、2,08gKH2P04、0,28gCaCl2、0.42gMgS04'7H20、0.42ml7Hc/zocferma^e化/痕量金屬溶液和2滴pluronicacid;最終pH5.0組成。7h'c/70fifermaree化/發(fā)酵培養(yǎng)基由每升4g葡萄糖、10g玉米浸泡固體、30gArbocelB800-天然纖維素纖維(J.RettenmaierUSALP,Schoolcraft,Michigan)、3.8g(NH4)2S04、2.8gKH2P04、2.08gCaCl2、1.63gMgS04'7H20、0.75ml7Hc/iO(imMareese/痕量金屬溶液和1.8mlpluronicacid組成。7Hc/waferwareasa'補(bǔ)料培養(yǎng)基由每升600g葡萄糖、20g纖維素B800、35,5gH3P04,p5mlpluronicacid組成。米曲霉接種物培養(yǎng)基由每升50g葡萄糖、2gMgS04*7H20、10gKH2P04、2gK2S04、2.08gCaCl2'2H2O、2g檸檬酸、0g酵母提取物、0.5gAMG痕量金屬和2g尿素，最終pH6.0組成。AMG痕量金屬由每升14.3gZnS04'7H20、2.5gCuS04'5H20、0.5gNiCl2'6H20、13.8gFeS04'7H20、8.5gMnS04'H20和3g檸檬酸組成。米曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基由每升2gMgS04*7H20、2gKH2P04、3gK2S04、9g(NH4)2HP04、1g檸檬酸.H20、10g酵母提取物、0.5mlAMG痕量金屬、25g蔗糖和0.55mLplu腦ic組成。米曲霉補(bǔ)料培養(yǎng)基由每升1g檸檬酸'H20、320gSatinSweet65和5gpluronic組成。MDU2BP培養(yǎng)基由每升45g麥芽糖、1gMgS04'7H20、1gNaCl、2gK2S04、12gKH2P04、7g酵母提取物、2g尿素和0.5mlAMG痕量金屬溶液組成。實(shí)施例1:發(fā)酵和菌絲體組織(mycelialtissue)THc/wtferma"e"/RutC30在如本
技術(shù)領(lǐng)域：
所述的纖維素酶誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)條件下生長(zhǎng)(Mandels和Weber,1969,Adv.Chem.Ser.95:391-413)。通過(guò)經(jīng)Whatman紙過(guò)濾收獲菌絲體樣品并在液氮中快速冷凍。將所述樣品貯存在80°C直到將它們破碎用于RNA提取。實(shí)施例2:已表達(dá)序列標(biāo)簽(Expresseds叫uencetag)(EST)cDNA文庫(kù)構(gòu)建從實(shí)施例1中所述的菌絲體樣品中根據(jù)Timberlake和Barnard的方法(1981,Cell26:29-37)提取總細(xì)胞RNA,并在從1%曱醛-瓊脂糖凝膠印跡后通過(guò)Northern雜交分析所迷的RNA樣品(Davis等，1986，BasicMethodsinMolecularBiology,ElsevierSciencePublishingCo.,Inc.,NewYork)。從總RNA中用mRNASeparatorKit(ClontechLaboratories,Inc.,PaloAlto,CA)才艮據(jù)制造商的說(shuō)明分離聚腺苷酸化的(Polyadenylated)mRNA片段。應(yīng)用大約5poly(A)+mRNA根據(jù)Gubler和Hoffman的方法(1983，Gene25:263-269)合成雙鏈cDNA,除了將NotI-(dT)18引物(PharmadaBiotech,Inc.,Piscataway,NJ)用于初始化第一條鏈合成。所述cDNA用綠豆核酸酶(mungbeannuclease)(BoehringerMannheimCorporation,Indianapolis,IN)處理并用T4DNA聚合酶(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)將所述末端鈍化。將BamHI/EcoRI接頭(adaptor)連接于所述cDNA的4屯端。用Notl消化后，通過(guò)應(yīng)用TAE緩沖液(4.84gTris堿、1.14ml冰乙酸和2ml0.5MEDTApH8.0每升)的0.7%瓊脂糖凝膠電泳大小選擇所述的cDNA(ca.0.7-4.5kb),并與pYES2(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)連接，所述pYES2已經(jīng)用NotI力口BamHI"t刀割并以小牛-腸石咸寸生石舜g^酶(calf-intestinealkalinephosphatase)(BoehringerMannheimCorporation,Indianapolis,IN)脫去磷酸。所迷連接混合物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOP10細(xì)胞(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)。在以50ng每ml的終濃度添加氨千青霉素的2YT瓊脂平板上(Miller,1992,AShortCourseinBacterialGenetics.ALaboratoryManualandHandbookforEscherichiacoliandRelatedBacteria,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NewYork)選S奪轉(zhuǎn)化體。實(shí)施例3:模板制備和cDNA克隆的核苷酸測(cè)序從實(shí)施例2中描述的cDNA文庫(kù)中，將大約7000個(gè)轉(zhuǎn)化體菌落從所述的轉(zhuǎn)化平板直接挑入含有添加50嗎每ml氨千青霉素的100pi2YT培養(yǎng)液的96-孔微量滴定皿。將所述平板在37。C、200rpm振蕩的條件下過(guò)夜培育。培育之后，將100pl無(wú)菌的50%甘油加入每個(gè)孔。將所述轉(zhuǎn)化體在次級(jí)深-盤96-孑L微量培養(yǎng)平板(AdvancedGeneticTechnologiesCorporation,Gaithersburg，MD)上進(jìn)行復(fù)制，所迷平板中含有在每孔中添加50pg每ml氨千青霉素的1mlMagnificentBroth(MacConnellResearch,SanDiego，CA)。將初級(jí)孩i量滴定平板冷凍貯存在-80。C。將所述的次級(jí)深-盤平板在37。C及在旋轉(zhuǎn)-振蕩器上劇烈攪動(dòng)(300rpm)進(jìn)行過(guò)夜培育。為了避免泄漏和交叉-污染，及允許足夠的通氣，將每個(gè)次級(jí)培養(yǎng)平板用聚丙烯襯墊(AdvancedGeneticTechnologiesCorporation,Gaithersburg，MD)和塑料微量滴定皿蓋來(lái)覆蓋。應(yīng)用如Utterback等(1995，GenomeSci.Technol.1:l-8)修改的AdvancedGeneticTechnologiesCorporation的96-孑LMiniprepKit規(guī)程從每個(gè)孑L中分離DNA。應(yīng)用染料-終止子化學(xué)(Giesecke等，1992，JournalofVirologyMethods38:47-60)和T7測(cè)序引物5，-TAATACGACTCACTATAGGG-3，(SEQIDNO:3)以Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XL自動(dòng)化DNA測(cè)序儀(Perkin-Elmer/AppliedBiosystems,Inc.,FosterCity,CA)進(jìn)4亍單-通過(guò)DNA測(cè)序(EST)。實(shí)施例4:分析cDNA克隆的DNA序列數(shù)據(jù)為了質(zhì)量和載體序列仔細(xì)核對(duì)核苷酸序列數(shù)據(jù)并修剪所述DNA序列末端的不確定的堿基，在PHRED/PHRAP軟件(UniversityofWashington,Seattle,WA)的幫助下對(duì)所有序列進(jìn)行相互比較。將所得的重疊群(contig)和單元素(singleton)以六種框架進(jìn)行翻譯并應(yīng)用GeneMatcher軟件(Paracel，Inc.,Pasadena,CA)及采用BLOSUM62矩陣(matrix)的修改的Smith-Waterman算法搜索公眾可用的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。實(shí)施例5:鑒定編碼家族7纖維二糖水解酶I(Cel7A)的cDNA克隆通過(guò)將裝配的EST的推導(dǎo)的氨基酸序列與公眾可用的數(shù)據(jù)庫(kù)如Swissprot、Genpept和PIR中儲(chǔ)存的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較來(lái)鑒定推定的編碼家族7纖維二糖水解酶(Cel7A)的cDNA克隆。選擇一個(gè)克隆7Hc/zc^ew7a^ase/EST1Y0221用于核苷酸序列分析，該分析顯示含有如SEQIDNO:1所示的1452bp開放閱讀-框的1821bppYES2插入片段和如SEQIDNO:2所示的推導(dǎo)的氨基酸序列所述含有7Hc/w^fe/"mflre"e/Cel7A纖維二糖水解酶I的質(zhì)粒命名為pTr0221。實(shí)施例6:構(gòu)建釀酒酵母載體用于產(chǎn)生初級(jí)的和重排的7h'c/w&mmreew/CenA纖維二糖水解酶I文庫(kù)在初級(jí)文庫(kù)和重排文庫(kù)的產(chǎn)生中應(yīng)用兩個(gè)載體pJC106(WO9510602)和pAJ052(圖1)。質(zhì)粒pJC106是pYES2(InvitrogenInc.,Carlsbad,CA)的衍生體，但區(qū)別在于pJC106具有全-長(zhǎng)2微米復(fù)制子，其代替了pYES2中的部分2微米，并包含所述灰蓋鬼傘過(guò)氧化物酶(CIP)(Cherry等，1999，Nat.Biotechno.4:379-384)編碼序列，該序列被GAL1啟動(dòng)子調(diào)控。對(duì)于pAJ052，由7h'c/zocfermae^/Cel7A編碼序列的ATG起始密碼子跨越至TAA終止密碼子的1452bpDNA片段，從pTr0221(實(shí)施例5)中應(yīng)用下面顯示的引物aGal—776.1(有義)和aGal—776.1A(反義)進(jìn)行PCR擴(kuò)增引物aGal一776.1:ACCATGTATCGGAAGTTGGCCG-3，(SEQIDNO:4)引物aGal—776.1A:GTTACAGGCACTGAGAGTAG-3，(SEQIDNO:5)將引物aGal—776.1和aGal—776.1A設(shè)計(jì)為含有pJC106的同源的GAU啟動(dòng)子(Giniger和Ptashne,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA85:3S2-386)和所述CYC1終止子序列(Osbourne和Guarente,1988,GenesDev.2:766-772)(分別加下劃線的)用于所述PCR產(chǎn)物和pJC106的體內(nèi)同源重組。引物aGal—776.1和aGal—776.1A也設(shè)計(jì)為分別含有BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。引物aGal—776.1進(jìn)一步設(shè)計(jì)為在所述7>/c/wArma纖維二糖水解酶I(Cel7A)基因ATG的上游緊接著含有酵母Kozak序列(ACC,-3至-lbp;Kozak,1984，Nature308:241-246)。所述擴(kuò)增反應(yīng)(50|il)由IXPCR緩沖液(AppliedBiosystemsInc.，F(xiàn)osterCity,CA)、0.2mMdNTPs、3.2pM引物aGal一776.1、3.2pM引物aGal—776.1A、大約100ngpTr0221和2.5單位TaqDNA聚合酶(RocheAppliedScience,Manheim,Germany)組成。所述反應(yīng)在EppendorfMastercyder5333(EppendorfEG,Hamburg,Germany)中進(jìn)行,其程序?yàn)樵?4°C、3分鐘的1個(gè)循環(huán)，然后是94°C30秒、55°C30秒和72°C90秒的30個(gè)循環(huán)，然后是在72°C5分鐘的1個(gè)循環(huán)。然后將所述PCR產(chǎn)物應(yīng)用QIAquickPCRKit(QIAGENInc.，Valencia,CA)根據(jù)制造商的說(shuō)明進(jìn)行純化，然后通過(guò)體內(nèi)重組導(dǎo)入釀酒酵母。為了實(shí)現(xiàn)所述的體內(nèi)重組，在YEAS丁MAKER酵母轉(zhuǎn)化規(guī)程(ClontechLaboratoriesInc.，PaloAlto，CA)之后，將大約100ng用BamHI和XhoI消化的pJC016,和大約500ng純化的PCR片段共-轉(zhuǎn)化入釀酒酵母YNG344。將所述的轉(zhuǎn)化鋪于酵母選擇培養(yǎng)基上用于在30°C進(jìn)行4天菌落生長(zhǎng)。根據(jù)Kaiser和Auer,1993,BioTechniques14:552所述的規(guī)程選擇單菌落并分離質(zhì)粒DNA,其后續(xù)根據(jù)制造商的說(shuō)明導(dǎo)入大腸桿菌菌抹XL-10(StratageneInc.,LaJolla,CA)。將源自轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌才朱的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序以檢驗(yàn)所述PCR和重組事件的保真度(fidelity)。實(shí)施例7:在釀酒酵母中產(chǎn)生突變的Cel7A纖維二糖水解酶I的初級(jí)文庫(kù)在致力于鑒定所述7Hc/70tfermare^dCel7A纖維二4唐水解酶I的對(duì)于蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性和改進(jìn)的高-溫活性來(lái)說(shuō)關(guān)鍵的區(qū)域時(shí)，全部野生型7Hc/zo血rmareew/Cel7A纖維二糖水解酶I基因應(yīng)用易-錯(cuò)PCR以與所述酵母表達(dá)載體pJC106(圖2)同源的序列進(jìn)行突變，其可經(jīng)過(guò)不同片段的同源結(jié)構(gòu)域之間的體內(nèi)重組，由線性化的載體和PCR產(chǎn)物的組合產(chǎn)生環(huán)狀、復(fù)制的質(zhì)粒。應(yīng)用如下的模板/引物組合中的一個(gè)產(chǎn)生用于缺口修復(fù)的PCR產(chǎn)物1)如下顯示的引物aGal—776.1和引物aGal—776.1a用于易-錯(cuò)PCR擴(kuò)增來(lái)自pTR0221的Cel7A纖維二糖水解酶I基因以產(chǎn)生突變的序列。2)如下顯示的引物yes2term和引物CiPpcrdwn用于易-錯(cuò)PCR擴(kuò)增來(lái)自pAJ052的Cel7A纖維二糖水解酶I基因以產(chǎn)生突變的序列。3)如下顯示的引物cJC106.1a和引物CiPpcrdwn也用于易-錯(cuò)PCR擴(kuò)增來(lái)自pAJ052的Cd7A纖維二糖水解酶I基因以產(chǎn)生突變的序列。將所述片段克隆入pJC106用于在酵母中表達(dá)所述Cd7A纖維二糖水解酶I變體。引物aGal—776.1:ACCATGTATCGGAAGTTGGCCG-3'(SEQIDNO:6)引物aGal—776.1a:GTTACAGGCACTGAGAGTAG-3'(SEQIDNO:7)虧1物yes2term:5'-GGCGTGAATGTAAGCGTGAC-3，(SEQIDNO:8)虧i物CiPpcrdwn:5，-CTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGA-3，(SEQIDNO:9)引物cJC06.1a:5'-GCGTACACGCGTCTGTACA-3,(SEQIDNO:10)所述易-錯(cuò)PCR擴(kuò)增(50pl)由含MgCl2的IXPCR緩沖液、0.2mMdATP、0.2mMdGTP、0.1mMdCTP和0.1mMdTTP、50pmol有義和反義引物、0.05mM至0.6mMMnCl2和10-50ng的質(zhì)粒DNA(—些情況下為pTR0221，在其他情況下為pAJ052)組成。所述反應(yīng)應(yīng)用MJResearchthermocycler(MJResearch,Inc.Boston,MA)溫育，其程序設(shè)定為在95°C、3分鐘的1個(gè)循環(huán)，其后加入2.5單位的Ampitaq(PerkinElmer，F(xiàn)osterCity，CA),然后是95。C60秒、55°C60秒和72°C90秒的30個(gè)循環(huán)，然后將所迷反應(yīng)在72°C進(jìn)行5分鐘的延伸。將每種PCR產(chǎn)物的等分試樣應(yīng)用如前所述的TAE緩沖液在0.7%瓊脂糖凝膠上跑膠，其產(chǎn)生預(yù)期的大約1680至2030bp的條帶。PCR反應(yīng)應(yīng)用MiniElutePCR純化試劑盒(QIAGEN,Valencia,CA)進(jìn)行純化，洗脫入50^的EB緩沖液(QIAGEN，Valencia,CA)。質(zhì)粒pJC106通過(guò)用BamHI和XhoI消化來(lái)產(chǎn)生缺口，然后應(yīng)用QiaquickMinielute柱(QIAGEN，Inc.,Valencia,CA)純化凝膠。所述的消化通過(guò)將所述消化的等分試樣在0.8%瓊脂糖凝膠上應(yīng)用TAE緩沖液進(jìn)行分級(jí)并以溴化乙錠染色來(lái)證實(shí)，其中得到預(yù)期的10771bp(有缺口的)和1030bp(來(lái)自灰蓋鬼傘過(guò)氧化物酶基因)的片段。將所述PCR反應(yīng)以大約3比1的比例與所述有缺口的pJC106載體混合用于共轉(zhuǎn)化入釀酒酵母YNG344感受態(tài)細(xì)胞。所述共-轉(zhuǎn)化的片段，應(yīng)用引物aGal—776.1和aGal—776.1a進(jìn)行擴(kuò)增的含有至少5'同源DNA的67bp和3，同源DNA的66bp,應(yīng)用yes2term和CiPpcrdwn擴(kuò)增的含有至少5，同源DNA的293bp和3，同源DNA的41bp,而cJC106.la和CiPpcrdwn擴(kuò)增的在所述的末端含有至少5，同源DNA的293bp和3，同源DNA的190bp以促進(jìn)所述表達(dá)質(zhì)粒的缺口修復(fù)。在每個(gè)按照YEASTMAKER酵母轉(zhuǎn)化規(guī)程進(jìn)行轉(zhuǎn)化前制備釀酒酵母YNG344的感受態(tài)細(xì)胞，所述的規(guī)程具有如下修改(l)用于接種過(guò)夜培育(16-20小時(shí))的酵母培養(yǎng)物的體積為100-1,000jul;(2)轉(zhuǎn)化后在YPD培養(yǎng)基中在30。C回收細(xì)胞45分鐘；和(3)所述轉(zhuǎn)化混合物等分，用于鋪在酵母選擇培養(yǎng)基平板上和在控速制冷器(NalgeNuncInternational,Rochester,NY)中在-80。C冷凍。實(shí)施例8:構(gòu)建pAlLol和pAlLo2米曲霉表達(dá)載體作為克隆幾個(gè)Cel7A纖維二糖水解酶變體的主要(backbone)載體，構(gòu)建了兩種米曲霉表達(dá)載體。載體pAlLol通過(guò)修飾pBANe6(美國(guó)專利6,461,837)來(lái)構(gòu)建，其包含所述米曲霉alpha-淀粉酶啟動(dòng)子(TAKA啟動(dòng)子)、黑曲霉淀粉葡萄糖苦酶終止子序列(AMG終止子)和構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶基因OmdS)。pBANe6的修飾通過(guò)從所述am必選擇標(biāo)記通過(guò)定點(diǎn)突變首先消除位置2051、2722和3397bp的三個(gè)NcoI限制性酶切位點(diǎn)來(lái)進(jìn)行。所有的改變"^殳計(jì)為"沉默的，，，保持所述a/m/S基因產(chǎn)物的實(shí)際蛋白序列不改變。這三個(gè)位點(diǎn)的去除用GeneEditor定點(diǎn)突變?cè)噭┖?Promega,Madison，WI)根據(jù)制造商的說(shuō)明同時(shí)進(jìn)行，并采用如下引物(加下劃線的核苷酸表示改變的堿基)引物AMDS3NcoMut(2050):5'-GTGCCCCATGATACGCCTCCGG-3，(SEQIDNO:11)引物AMDS2NcoMut(2721):5'-GAGTCGTATTTCCAAGGCTCCTGACC-3'(SEQIDNO:12)引物AMDSlNcoMut(3396):5，-GGAGGCCATG4AGTGGACCAACGG-3，(SEQIDNO:13)然后將包含全部三種預(yù)期的序列改變的質(zhì)粒應(yīng)用QuickChange突變?cè)噭┖?Stratagene,LaJolla,CA)進(jìn)行定點(diǎn)突變，以在所述AMG終止子的末端消除位置1643的Ncol限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。如下的引物(力口下劃線的核苷酸代表改變的堿基)用于突變誘變所述黑曲霉AMG終止子序列的有義引物G-3，(SEQIDNO:14)誘變所述黑曲霉AMG終止子序列的反義引物5，-CTGGTCTTCTACACGAAGGAAAGAQCATGGCTTTCACGGTGTCTG-3，(SEQIDNO:15)修飾pBANe6的最后一步是將新的NcoI限制性酶切位點(diǎn)應(yīng)用QuickChange突變?cè)噭┖泻拖铝幸?力口下劃線的核苷酸表示改變的堿基)添加在所述聚合接頭(polylinker)的起點(diǎn)以獲得pAlLol(圖3)。誘變所述米曲霉TAKA啟動(dòng)子的有義引物5，-CTATATACACAACTGGATTTACCATGGGCCCGCGGCCGCAGATC-3'(SEQIDNO:16)誘變所述米曲霉TAKA啟動(dòng)子的反義引物'.5，-GATCTGCGGCCGCGGGCCCATGGTAAATCCAGTTGTGTATATAG-3'(SEQIDNO:17)pAILol的aw必基因同構(gòu)巢曲霉j^yK基因交換。將質(zhì)粒pBANe10(圖14)用作；,G基因的來(lái)源，所述的/^rG基因作為選擇標(biāo)記。pBANelO的序列的分析顯示，標(biāo)記包含于油/1限制性酶切片段中，并不包含WcoI或戶acI限制性酶切位點(diǎn)。由于am必兩側(cè)也有I限制性酶切位點(diǎn)，交換選擇標(biāo)記的策略為wn限制性酶切片段的簡(jiǎn)單交換。來(lái)自pAILol和pBANe10的質(zhì)粒DNA用限制酶A^'I消化，所述的產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳應(yīng)用TAE緩沖液進(jìn)行純化。將來(lái)自含有/7,G基因的pBANeiO的船z'I片段連接到pAILol的骨架上以代替原始的含有朋w^基因的7VWIDNA片段。重組的克隆通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化進(jìn)行分析以確定插入方向。篩選具有以逆時(shí)針?lè)较蜣D(zhuǎn)錄的p，G基因的克隆。所述的新質(zhì)粒命名為pAILo2(圖5)。實(shí)施例9:改進(jìn)的Cel7A纖維二糖水解酶I變體G205R的理性設(shè)計(jì)和在釀酒酵母中產(chǎn)生G205R初級(jí)文庫(kù)將所述7Hc/2odw加reese,:Cel7A纖維二糖水解酶I蛋白序列(SEQIDNO:2)與同一酶家族的其他蛋白質(zhì)相比較。序列包括來(lái)自嗜熱毛殼菌(0aetom&mAer"wp/n7w加)(WO03/000941)、i/"/w.co/a/"w/era(WO95/02675)和4且4造脈孑包菌(SWISSPROT:P38676a嗜熱毛殼菌的親近的種系發(fā)生的親緣)的Cd7A纖維二糖水解酶I。應(yīng)用ClustalX軟件版本1.81(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NIHBethesda，MD)(Thompson等，1994，NucleicAcidsRes22:4673-4680;Thompson等，1997,NucleicAcidsRes25:4876-4882),采用具有默認(rèn)的缺口罰分參數(shù)的Gonnet矩陣進(jìn)行來(lái)自嗜熱毛殼菌、/rao/e"s、7Hc/zocferwareese/矛口并丑壽造#~孑包菌的Cel7A纟千纟禽二4t水解酶I蛋白序列的多重對(duì)比。將顯示較差比對(duì)的區(qū)域進(jìn)行迭代地重比對(duì)，有時(shí)應(yīng)用替換的矩陣(Blosmn)和/或可變的缺口參數(shù)。公眾可得到的Cel7A纖維二糖水解酶I序列的同源性模型應(yīng)用自動(dòng)化的SwissModelserviceSwissModelservice(Biozentrum,Basel,Switzerland)來(lái)產(chǎn)生。來(lái)自//聽z,co/afmo/era的Cel7A纖維二糖水解酶I的同源性才莫型通過(guò)應(yīng)用theInsightII程序(Accelrys,SanDiegoCA)產(chǎn)生。程序DeepView(Guex和Peitsch,1997,Electrophoresis18:2714-2723)用于導(dǎo)入實(shí)際的突變并用于所有其他結(jié)構(gòu)操作和能量最小化。用于來(lái)自7Hc/7oA/7"fle化/的Cel7A纖維二糖水解酶I的參考結(jié)構(gòu)是PDB:7CEL(Divne等，1994,Science265:524-528;Stahlberg等，1996,264:337-349)。根據(jù)所述比較，優(yōu)先考慮7Hc/zo&7，",'ee化/纖維二糖水解酶I的潛在的突變，基于它們可產(chǎn)生新的穩(wěn)定相互作用(離子對(duì)和/或H-鍵)的可能性，也基于它們?cè)谑葻嵴婢葻崦珰ぞ?/ww/co/g/rao/era的Cel7A纖維二糖水解酶I的序列和結(jié)構(gòu)中發(fā)生的可能性，和它們?cè)谑葴卣婢植诿}孢菌中不存在的可能性。顯示的氨基酸取代中的一個(gè)是位置205的甘氨酸改變?yōu)榫彼?。將所述G205R變體進(jìn)行理性設(shè)計(jì)以導(dǎo)入與El卯和E239的離子-配對(duì)。為了產(chǎn)生所述的G205R取代，將所述7Hc/20&n加Cel7A纖維二糖水解酶I基因亞克隆入用NcoI和PacI消化的米曲霉載體pAlLo02以形成與所述基因的ATG和米曲霉alpha-淀粉酶啟動(dòng)子和黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶終止子序列的完好連接。將所述Cel7A纖維二糖水解酶I基因亞克隆入pAlLo2通過(guò)設(shè)計(jì)下面顯示的兩個(gè)引物來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述的引物允許克隆入所述NcoI和PacI位點(diǎn)。引物cTR0221.7:5'-GCAACATGTATCGGAAGTTGGC-3'(SEQIDNO:18)將與pAlLo2中的NcoI位點(diǎn)相適應(yīng)的BspLUII位點(diǎn)，摻入所述Cel7A纖維二糖水解酶I基因的5,-末端，而引物cTR0221.7a:5'-AAT丁AATTTTACAGGCACTGAG-3'(SEQIDNO:19)在所述的3'末端摻入BspLUII位點(diǎn)。所述Cel7A纖維二糖水解酶I基因的擴(kuò)增應(yīng)用lXTgo聚合酶反應(yīng)緩沖液(BoehringerMannheimCo,Indianapolis,IN)、25ngpTR0221、dATP、dGTP、dCTP和dTTP每種0.2mM、50pmole每種引物(cTR0221.7和cTR0221.7a)和1單位的Tgo聚合酶(BoehringerMannheimCo,Indianapolis,IN)來(lái)完成。所述反應(yīng)應(yīng)用MJResearchThermocycler溫育，其程序?yàn)樵?4°C、5分鐘的1個(gè)循環(huán)，然后是94。C60秒、55。C45秒和72。C2分鐘的35個(gè)循環(huán)。然后將所述反應(yīng)在72°C延伸5分鐘。將每種PCR產(chǎn)物的等分試樣應(yīng)用TAE緩沖液在0.7%瓊脂糖凝膠上跑膠，其產(chǎn)生預(yù)期的大約1545bp的條帶。將所述1545bpPCR產(chǎn)物應(yīng)用TOPOBluntPCR4CloningKit(Invitrogen,Carlsbad，CA)進(jìn)行亞克隆。將得到的質(zhì)粒用BspLUII和PacI消化并在0.7%瓊脂糖凝膠上應(yīng)用TAE緩沖液分級(jí)以產(chǎn)生預(yù)期的1.5kb編碼序列，將其切除并應(yīng)用AmiconUltra-freeDA柱(Millipore,Billerica,MA)進(jìn)行凝膠純化。后續(xù)將得到的片段連接入同樣消化的pAlLo2，以產(chǎn)生含有所述7h'c/wdermaree"/Cel7A纖維二糖水解酶I基因的表達(dá)載體，其命名為pCW026(圖6)。A人起始質(zhì)粒pCW026開始工作，應(yīng)用QuickChange定點(diǎn)突變?cè)噭┖?Stratagene,LaJolla,CA)及pCW026作為模板，通過(guò)在Cel7A纖維二糖水解酶I的編碼序列的堿基664將鳥苷突變?yōu)榘斩玫紾205R變體。用于摻入此突變的引物為下面顯示的引物G205R.1和引物G205R.la:G205R.1:5'-GAACACGGGCATTGGACGACACGGAAGCTGCTG-3'(SEQIDNO:20)G205R.la:5'-CAGCAGCTTCCGTGTCGTCCAATGCCCGTGTTC-3'(SEQIDNO:21)將得到的表達(dá)載體命名為pNP7^G20SR(圖7)。實(shí)施例10:篩選Cd7A纖維二糖水解酶I文庫(kù)將初級(jí)Cel7A纖維二糖水解酶I文庫(kù)鋪于GenetixQTrays(22x22cm培養(yǎng)皿，GeneticsLtd.,Hampshire,UnitedKingdom)中的瓊脂酵母選擇培養(yǎng)基上并在30。C溫育5天。應(yīng)用GenetixQPix(GenetixLtd.,Hampshire,UnitedKingdom),將菌落挑入含有酵母選擇培養(yǎng)基的96-孔板。將平板在30°C溫育5-8天。應(yīng)用ORCA機(jī)器人(BeckmanCoulter,Fullerton,CA)，將所述生長(zhǎng)平板轉(zhuǎn)入BiomekFx(BeckmanCoulter,Fullerton,CA)并從該生長(zhǎng)平板移出培養(yǎng)液樣品且等分為兩個(gè)96-孔聚碳酸脂v-底平板。將所述纖維二糖水解酶I底物4-曱基織酮-beta-D-乳糖苷(MUL，MarkerGeneTech.Inc.,Eugene,OR)以0.2、0.1或0.05mg每ml4-甲基織酮-beta-D-乳糖苷、0.1M琥珀酸鹽、pH5.0和0.01%Tween-20的終濃度加入每個(gè)V-底96-孔平板。將實(shí)驗(yàn)平板轉(zhuǎn)移導(dǎo)控溫的培養(yǎng)箱，其中一個(gè)平板在50。c溫育45分鐘，而另一個(gè)在預(yù)定的溫度62。C-65。C溫育45分鐘。此溫育之后，將所述平板在4°C冷卻1分鐘，然后轉(zhuǎn)移到所述的BiomekFx,其中實(shí)驗(yàn)通過(guò)加入Tris-Cl，pH9.5至0.75M的終濃度而終止。終止的反應(yīng)樣品在水中稀釋，并應(yīng)用BMGFLUOStarGalaxy焚光計(jì)(Offenburg,Germany)測(cè)定通過(guò)4-曱基織酮-beta-D-乳糖苷的Cel7A纖維二糖水解酶I水解而釋放的4-曱基織酮的熒光(360nm激發(fā)，460nm發(fā)射)。將來(lái)自在高溫處理平板的熒光的比例("高溫活性")與來(lái)自在50。C溫育的相同樣品的萸光("低溫活性")，應(yīng)用MicrosoftExcel(MicrosoftCorporation,Redmond,WA)進(jìn)行比較，以測(cè)定每個(gè)變體的相對(duì)熱活性比例?；谒龅臒峄钚员壤?，篩選實(shí)施例7和實(shí)施例9中構(gòu)建的文庫(kù)產(chǎn)生表1中列出的變體。表1顯示如通過(guò)評(píng)價(jià)64。C的活性相對(duì)于50。C的活性的熱活性比例來(lái)測(cè)定的新型Cel7A纖維二糖水解酶I變體的改進(jìn)的程度。對(duì)于初級(jí)篩選中得到的變體，改進(jìn)的變化范圍從相對(duì)于所述野生型酶提高2.60-倍至10.20-倍改進(jìn)。對(duì)于由重排得到的突變體，觀察到的改進(jìn)為熱活性比所述野生型酶高12.40-倍至19.20-倍。表l.具有改進(jìn)的熱穩(wěn)定性和熱活性的Cel7A變體。"增加倍數(shù)"表示在64。C/50。C測(cè)定的熱活性比例的相對(duì)改進(jìn)。<table>tableseeoriginaldocumentpage185</column></row><table>776-M42S8P、G205R4.60776-M52G94S、G205R楊776-M53S196P、G205R4.80776-M57S113N、S196T、P227A、T462A14.60776-M65S57N5.00776-M71T383A、T455A2.60776-M73N373H4.80776-M101S113N、S411F12.40776-M108T41I、E193K、S411F15.60776-M109N49S、S113N、P227A、P438L15.00776-M124Y247C、Y371C、S411F17.40776-M125S21P、S57N、T246I、R251K、S411F18.00776-M192K157R、G205R、T255P、S411F15.00776-M216S113N、S196T、P227A、S411F17.80776-M252S13N、S196T、P227A、T356I、T462A19.20W扁號(hào)方式應(yīng)用成熟Cel7A酶的第一個(gè)殘基作為位置1。實(shí)施例11:變體的DNA測(cè)序?yàn)榱藴y(cè)定源自實(shí)施例7和9的文庫(kù)的Cel7A纖維二糖水解酶I變體的序列，分離了質(zhì)粒DNA。將每個(gè)變體在瓊脂酵母選擇培養(yǎng)基上劃線并在30°C溫育3-5天。分離出8個(gè)菌落并接種入1ml的酵母篩選培養(yǎng)基，在30。C生長(zhǎng)5-8天。將所述瓊脂平板在30。C再生長(zhǎng)3-5天。如實(shí)施例IO中所述檢測(cè)來(lái)自每個(gè)變體的單菌落的培養(yǎng)液產(chǎn)生的纖維二糖水解酶I變體的改進(jìn)的熱活性以測(cè)定相對(duì)于野生型(wt)Cel7A纖維二糖水解酶I哪些具有改進(jìn)的熱活性比例。如Kaiser和Auer，1993，BioTechniques14:552所述，應(yīng)用大腸桿菌菌抹XL-10(StratageneInc.,LaJolla,CA)從產(chǎn)生具有改進(jìn)的熱活性的纖維二糖水解酶I變體的菌落中拯救(rescue)質(zhì)粒。應(yīng)用ABI3700測(cè)序儀(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)，應(yīng)用染料終止子化學(xué)(Giesecke等，1992,JournalofVirol.Methods38:47-60)進(jìn)行DNA測(cè)序。用于測(cè)序的質(zhì)粒DNA應(yīng)用BioRobot9604(QIAGEN,Valencia,CA)制備。每個(gè)7h'c/zo&rwaree"/Cel7A纖維二糖水解酶I變體的全部編碼序列應(yīng)用0.5pl質(zhì)粒DNA和3.2pmol的如下引物測(cè)序cTr0221.1:5'-CTTCTTGGCCACAGCTCGTG-3'(SEQIDNO:22)cTr0221.2:5'-GGCTTTGTCACCCAGTCTGC-3'(SEQIDNO:23)cTr0221.3:5'-CGTCATCCAACAACGCGAAC-3'(SEQIDNO:24)cTr0221.4:5'-TTCGAGACGTCGGGTGCCAT-3'(SEQIDNO:25)cTr0221.4:5'-CGCGGAAGCTGCTCCACCAG-3'(SEQIDNO:26)cTr022UA:5'-AATGGAGAGGCTGTTACCGC-3'(SEQIDNO:27)應(yīng)用VectorNTIContigExpress(Informax，Inc.,Bethesda，MD)編輯并匯編序列跟蹤文件。實(shí)施例12:應(yīng)用變體Cel7A纖維二糖水解酶I基因作為模板產(chǎn)生易錯(cuò)文庫(kù)將幾個(gè)改進(jìn)的變體進(jìn)行隨機(jī)突變。應(yīng)用如實(shí)施例10中所述從酵母中已經(jīng)復(fù)蘇的質(zhì)粒DNA并且如實(shí)施例7中所述進(jìn)行易-錯(cuò)PCR。此外，所述G205R變體通過(guò)應(yīng)用pNP776G205R作為易-錯(cuò)PCR中的模板來(lái)進(jìn)行突變。如下的引物用于產(chǎn)生突變的序列引物aGal—776.1:ACCATGTATCGGAAGTTGGCCG-3，(SEQIDNO:28)引物aGal—776.1a:TTACAGGCACTGAGAGTAG-3，(SEQIDNO:29)所述易-錯(cuò)PCR擴(kuò)增在0.7。/。瓊脂糖凝膠上應(yīng)用TAE緩沖液進(jìn)4亍分析，并用帶缺口的pJC106載體轉(zhuǎn)化入釀酒酵母，如實(shí)施例7中所述。從通過(guò)所述G205R模板的易-錯(cuò)擴(kuò)增產(chǎn)生的篩選文庫(kù)中得到變體76-M35、776掘0、776掘1、776掘2、776-M52和776隱M53。變體776-252源自通過(guò)變體776-M57的突變擴(kuò)增產(chǎn)生的文庫(kù)。如實(shí)施例10中所述，復(fù)蘇來(lái)自這些變體的DNA并進(jìn)行測(cè)序。實(shí)施例13:Cel7A纖維二糖水解酶I的重排文庫(kù)為了重排源自野生型Cel7A纖維二糖水解酶I和G205R模板的突變的所述Cel7A纖維二糖水解酶I變體，如實(shí)施例10所述，從所述變體中分離質(zhì)粒DNA。應(yīng)用如下引物，從所述變體中擴(kuò)增所述Cd7A纖維二糖水解酶I基因引物CiPpcrdwn:5'-CTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGA-3,(SEQIDNO:30)引物cJC106.1A:5，-GCGTACACGCGTCTGTACA-3，(SEQIDNO:31)每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)(50pl)由IXPCR緩沖液、0.2mMdNTPs、3.2pM引物aGal—776.1、3.2pM引物aGal—776.1A、大約100ngpTr0221和2.5單位的TaqDNA聚合酶組成。將所述反應(yīng)在EppendorfMastercycler5333中溫育，其程序?yàn)樵?4。C、3分鐘的1個(gè)循環(huán)，然后是94°C30秒、55°C30秒和72°C90秒的30個(gè)循環(huán)(5分鐘最終延伸)。然后應(yīng)用QIAquickPCR試劑盒根據(jù)制造商的說(shuō)明來(lái)純化PCR產(chǎn)物。為了重排所述的Cel7A纖維二糖水解酶I變體，將來(lái)自擴(kuò)增的變體基因的PCR產(chǎn)物與大約50ng用BamHI和XhoI消化的pJC016組合，并將100-200ng混合的PCR片段根據(jù)YEASTMAKER酵母轉(zhuǎn)化規(guī)程共-轉(zhuǎn)化入釀酒酵母YNG344以產(chǎn)生重排的文庫(kù)，如在實(shí)施例7中所述。于是產(chǎn)生大量的重排的文庫(kù)。包含在單文庫(kù)中的變體的總數(shù)變化范圍從2到10。這些文庫(kù)中活性變體的百分比變化范圍從87%至94%,基于實(shí)施例9中所述在4-甲基織酮-beta-D-乳糖苷實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的50。C活性。由于應(yīng)用的TaqDNA聚合酶具有低校對(duì)活性，所以重排的過(guò)程可將新的突變導(dǎo)入所述Cel7A纖維二糖水解酶I編碼序列。從所述重排的文庫(kù)中挑取菌落并如實(shí)施例9中所述進(jìn)行篩選，應(yīng)用4-甲基饊酮-beta-D-乳糖苷作為底物，應(yīng)用64。C活性與50。C活性的比較來(lái)評(píng)估每個(gè)變體的熱穩(wěn)定性和熱活性的改進(jìn)程度。所述重排文庫(kù)的篩選導(dǎo)致改進(jìn)的變體的分離，所述變體命名為776-M57、776-M101、776-M108、776-M109、776-M124、776-M125、776-M192和776-M216。如實(shí)施例IO中所述復(fù)蘇來(lái)自這些變體的DNA并進(jìn)行測(cè)序。一些所述的取代通過(guò)通過(guò)變體776-M57、776-M101、776-M108、776-M109、776-M124、776-M125、776-M192和776-M216的DNA序列來(lái)鑒定，這些變體含有預(yù)先通過(guò)測(cè)序來(lái)自易-錯(cuò)文庫(kù)的突變體而鑒定的取代。例如，776_M57含有S113N突變，所述突變也存在于所述重排文庫(kù)的一個(gè)親代(776-M4),由此親代所述的取代。同樣地，776-M101含有S411F，所述取代存在于所述重排文庫(kù)的一個(gè)親代(776-M27)，由此親代得到所述的取代。其他存在于源自重排文庫(kù)的變體中的取代包括N49S、E193K、R251K、T246I、Y247C、Y371C和P438L,它們?cè)诎瑢?duì)應(yīng)的重排文庫(kù)的親代變體的已測(cè)序的變體中觀察不到。這些突變可已經(jīng)在構(gòu)建所述重排文庫(kù)時(shí)在擴(kuò)增所述變體DNA的過(guò)程中通過(guò)PCR-介導(dǎo)的突變事件導(dǎo)入。實(shí)施例14:位點(diǎn)特異性的飽和誘變?yōu)榱撕Y選在Cd7A纖維二糖水解酶i中的具體位置改進(jìn)熱活性的最佳:f又代，進(jìn)行位點(diǎn)-特異性的隨機(jī)化。氨基酸G94、S196和P227通過(guò)以NN(G/C)取代所述野生型密碼子，應(yīng)用megaprimerPCR(Landt,等，1990基因96:125-128)進(jìn)行隨機(jī)化。應(yīng)用如下引物在下述三個(gè)位置進(jìn)行隨機(jī)化在位置94隨機(jī)化引物aTrCBHI.2:5,-GCGGTAACAGCCTCTCCATTNNSTTTGTCAC-3，(SEQIDNO:32)引物aTrCBHI.2a:5'-CTGCGCAGACTGGGTGACAAASNNAATGGAGAG-3，(SEQIDNO:33)在位置196隨機(jī)化引物aTrCBHI.3:5,-CCATCTCCGAGGCTCTTACCNNSCACCCTTGC-3，(SEQIDNO:34)引物aTrCBHI.3a:5，-GGCCGACAGTCGTGCAAGGGTGSNNGGTAAGAG國(guó)3'(SEQIDNO:35)在位置227隨機(jī)化引物aTrCBHIR.l:5，-GAGGGCTGGGAGCCGTCANNSAACAACGCG-3，(SEQIDNO:36)引物aTrCBHI.lbA:5，-CCAATGCCCGTGTTCGCGTTGTTS麗TGACGGC-3，(SEQIDNO:37)每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)(50pl)由IXPCR緩沖液、0.2mMdNTPs、3.2pM的有義引物、3.2pM的反義引物、大約100ngpTr0221和2.5單位的TaqDNA聚合酶組成。所述反應(yīng)在EppendorfMastercycler5333中溫育，其程序?yàn)樵?5。C、3分鐘的1個(gè)循環(huán)，然后是95。C30秒、55。C60秒和72。C90秒的30個(gè)循環(huán)(5分鐘最終延伸)。然后應(yīng)用QIAquickPCR試劑盒根據(jù)制造商的說(shuō)明來(lái)純化PCR產(chǎn)物。每個(gè)為單位點(diǎn)突變產(chǎn)生的PCR片段作為重疊延伸擴(kuò)增反應(yīng)的megaprimer以產(chǎn)生完整的纖維二糖水解酶I基因片段用于產(chǎn)生文庫(kù)，所述的基因片段具有指示的位點(diǎn)-特異性突變。所述擴(kuò)增反應(yīng)的前5輪由1XPCR緩沖液、0.2mMdNTPs、100ng的有義(5')megaprimer、100ng的反義(3，)megaprimer和2.5單位的TaqDNA聚合酶組成。所述反應(yīng)在EppendorfMastercycler5333中溫育，其程序?yàn)樵?5°C、3分鐘的1個(gè)循環(huán)，然后是95。C30秒、55。C60秒和72。C90秒的5個(gè)循環(huán)。將50p勵(lì)l的引物aGal776.1和aGal776.1A加入此反應(yīng)以擴(kuò)增新產(chǎn)生的位點(diǎn)隨機(jī)化的片段，所述片段在前5個(gè)循環(huán)反應(yīng)中產(chǎn)生。加入所述新引物后，將所述反應(yīng)在EppendorfMastercycler5333中溫育，其程序?yàn)樵?5°C30秒、55°C60秒和72°C90秒的30個(gè)循環(huán)(5分鐘最終延伸)。然后應(yīng)用QIAquickPCR試劑盒根據(jù)制造商的說(shuō)明來(lái)純化得到的PCR片段。然后將最終的PCR片段與BamHI和XhoI-切斷(gap)的pJC106質(zhì)粒(實(shí)施例6)—起直接轉(zhuǎn)化入酵母。由于應(yīng)用的TaqDNA聚合酶具有低校對(duì)活性，飽和突變(saturationmutagenesis)的方法可將除在位置94、196和227設(shè)計(jì)的改變之外的新突變導(dǎo)入所述的編碼序列。如實(shí)施例10中所述篩選含有位點(diǎn)-特異性的隨機(jī)化的氨基酸的文庫(kù)。如表2所示，除通過(guò)篩選隨機(jī)-突變的文庫(kù)鑒定的取代之外，發(fā)現(xiàn)了許多相對(duì)于野生型改進(jìn)了在63。C/5(TC的熱活性比例的取代。例如，變體776-M3由篩選初級(jí)文庫(kù)得到，其中在位置227的脯氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼?。在此位置篩選所述位點(diǎn)-特異性的隨機(jī)化的文庫(kù)的過(guò)程中，我們鑒定了變?yōu)榱涟彼岷妥優(yōu)楦拾彼嵋约氨彼岬娜〈?。除了揭示在位?27、94和196的賦予改進(jìn)的熱穩(wěn)定性和活性的氨基酸取代之外，鑒定了能增加熱活性的第二個(gè)位點(diǎn)突變。具體的，在變體776-M273中鑒定了取代D259N,如表2所示。表2.在位置227、94和196包含取代的具有改進(jìn)的熱穩(wěn)定性的Cel7A變體。"增加倍數(shù)，，表示熱活性比例的相對(duì)改進(jìn)，在63。C/50°C測(cè)定。Cel7A變體氨基酸取代*增加倍數(shù)文庫(kù)類型野生型無(wú)1無(wú)776-M3P227A、C486W2.67初級(jí)776-M259P227L1.50在227位點(diǎn)-特異性隨機(jī)化776-M273P227G、D259N3.00在227位點(diǎn)-特異性隨機(jī)化776-M274P227A2.67在227位點(diǎn)-特異性隨機(jī)化776-M275P227L2.00在227位點(diǎn)-特異性隨機(jī)化776-M52G94S、G205R2.00初級(jí)776-M268G94A、T226A2.67在94位點(diǎn)-特異性隨機(jī)化776-M264G94R2.07在94位點(diǎn)-特異性隨機(jī)化776-M266G94Q2.17在94位點(diǎn)-特異性隨機(jī)化776-M269G94A2.03在94位點(diǎn)-特異性隨機(jī)化776-M53S196P、G205R1.50初級(jí)776掘S113N、S196T、T462An.a.初級(jí)776-M261S196P1.33在196位點(diǎn)-特異性隨機(jī)化776-M263T41I、S196F1.67在196位點(diǎn)-特異性隨機(jī)化"扁號(hào)方式應(yīng)用成熟Cel7A酶的第一個(gè)殘基作為位置1。實(shí)施例15:構(gòu)建pMJ04、pMJ06和pMJ09表達(dá)栽體通過(guò)應(yīng)用下面顯示的引物993429(反義)和993428(有義)從7Hc/2oArwa/^a^/RutC30基因組DNA中PCR擴(kuò)增所述7Hc/70ciermare"e/纖維二糖水解酶1基因(c^2"終止子來(lái)構(gòu)建表達(dá)載體pMJ04。所述反義引物設(shè)計(jì)為在5，-末端具有Pacl位點(diǎn)并在有義引物的3，-末端具有Spel位點(diǎn)。引物993429(反義)5，-AACGTTAATTAAGGAATCGTTTTGTGTTT-3，(SEQIDNO:38)引物993428(有義)5，-AGTACTAGTAGCTCCGTGGCGAAAGCCTG-3，(SEQIDNO:39)應(yīng)用DNeasyPlantMaxi試劑盒(QIAGEN,Valencia,CA)分離7Hc/zoArwareaye/RutC30基因組DNA。所述擴(kuò)增反應(yīng)(50jil)由IXThermoPol反應(yīng)緩沖液(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)、0.3mMdN丁Ps、100ng7Hc/70cfe廠wareeseZRutC30基因組DNA、0.3引物993429、0.3引物993428和2單位的Vent聚合酶(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)組成。所述反應(yīng)在EppendorfMastercyder5333中溫育，其程序?yàn)樵?4。C30秒、50。C30秒和72。C60秒的5個(gè)循環(huán)，然后是94°C30秒、65°C30秒和72。C120秒的25個(gè)循環(huán)(5分鐘最終延伸)。所述反應(yīng)產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上應(yīng)用TAE緩沖液分離，其中從所述凝膠上切除229bp產(chǎn)物條帶并應(yīng)用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN,Valencia,CA)根據(jù)制造商的說(shuō)明來(lái)純化。將得到的PCR片段用PacI和SpeI消化并應(yīng)用RapidLigationKit(Roche，Indianapolis,IN)連接入用相同的限制性內(nèi)切酶消化的pAlLo01(實(shí)施例8)以產(chǎn)生pMJ04(圖8)。通過(guò)應(yīng)用下面顯示的引物993696(反義)和993695(有義)從7Hc/w&w^reeseZRutC30基因組DNA中PCR擴(kuò)增所述7Wc/oc/ermareese/Cel7A纖維二糖水解酶1基因(c^/)啟動(dòng)子來(lái)構(gòu)建表達(dá)載體pMJ06。所述反義引物設(shè)計(jì)為在有義引物的5，-末端具有Sall位點(diǎn)并在反義引物的5，-末端具有Ncol位點(diǎn)。引物993695(有義)5，-ACTAGTCGACCGAATGTAGGATTGTT-3，(SEQIDNO:40)引物993696(反義)5,-TGACCATGGTGCGCAGTCC-3，(SEQIDNO:41)所述擴(kuò)增反應(yīng)(50pl)由IXThermoPol反應(yīng)緩沖液、0.3mMdNTPs、100ng7Hc/zocfernwreese/RutC30基因組DNA(其應(yīng)用DNeasyPlantMaxiKit制備、0.3pM引物993696、0.3jiM引物993695和2單位的Vent聚合酶組成。所述反應(yīng)在EppendorfMastercyder5333中溫育，其程序?yàn)樵?4。C30秒、55°C30秒和72°C60秒的30個(gè)循環(huán)(15分鐘最終延伸)。所述反應(yīng)產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上應(yīng)用TAE緩沖液分離，其中從所述凝膠上切除988bp產(chǎn)物條帶并應(yīng)用QIAquick凝膠提取試劑盒根據(jù)制造商的說(shuō)明來(lái)純化。將得到的PCR片段用NcoI和SalI消化并應(yīng)用RapidLigationKit連接入用相同的限制性內(nèi)切酶消化的pMJ04以產(chǎn)生pMJ06(圖9)。通過(guò)應(yīng)用下面顯示的引物993843(反義)和99344(有義)從7h'Ao血rw"reesdRutC30基因組DNA中PCR擴(kuò)增所述7Hc/zo￡/ennareesez'Cel7A纖維二糖水解酶1基因(c6W)終止子來(lái)構(gòu)建表達(dá)載體pMJ09。所述反義引物設(shè)計(jì)為在5，-末端具有Pacl和Spel位點(diǎn)并在有義引物的5，-末端具有Pvul位點(diǎn)。引物"3844(有義)5'-CGATCGTCTCCCTATGGGTCATTACC-3，(SEQIDNO:42)引物993843(反義)5'-ACTAGT丁AATTAAGCTCCGTGGCGAAAG-3，(SEQIDNO:43)所述擴(kuò)增反應(yīng)(50pl)由IXThermoPol反應(yīng)緩沖液、0.3mMdNTPs、100ng7Hc/wAr附"RutC30基因組DNA(其應(yīng)用DNeasyPlantMaxiKit提取)、0.3jiM引物993844、0.3引物993843和2單位的Vent聚合酶組成。所述反應(yīng)在EppendorfMastercycler5333中溫育，其程序?yàn)樵?4°C30秒、55。C30秒和72。C60秒的30個(gè)循環(huán)(15分鐘最終延伸)。所述反應(yīng)產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上應(yīng)用TAE緩沖液分離，其中從所述凝膠上切除473bp產(chǎn)物條帶并應(yīng)用QIAquick凝膠提取試劑盒根據(jù)制造商的說(shuō)明來(lái)純化。將得到的PCR片段用PvuI和SpeI消化并應(yīng)用RapidLigationKit連接入用PacI和SpeI消化的pMJ06以產(chǎn)生pM磨(圖10)。實(shí)施例16:構(gòu)建pCW045用于在7Wc/w^r柳"中表達(dá)變體776-M57將變體776-M57應(yīng)用In-FusionPCR克隆試劑盒(BDBiosciences,Clonetech,PaloAlto,CA)亞克卩套入戶斤述7Hc/7c^ermareese/表達(dá)載體pMJ09。所述變體的PCR擴(kuò)增應(yīng)用PlatinumPfxDNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)進(jìn)行。擴(kuò)增由1XP&擴(kuò)增緩沖液、dCTP、dATP、dTTP和dGTP每種0.3mM;1mMMgS04、1pmol引物IF-F1、1pmol引物IF-R1、50-100ng的DNA模板776-57和1單位的Pfic聚合酶。所述反應(yīng)應(yīng)用MJResearchThermocycler溫育，其程序?yàn)樵?5。C、3分鐘的1個(gè)循環(huán)，然后是95。C15秒、55。C30秒和68。C2分鐘的30個(gè)循環(huán)。然后將所述反應(yīng)在72°C溫育7分鐘延伸。引物IF-Fl:'5，-CGCGGACTGCGCACCATGTATCGGAAGTTG-3，(SEQIDNO:44)引物IF-R1:5,-CGCCACGGAGCTTAATTACAGGCACTGAGA-3，(SEQIDNO:45)每種PCR產(chǎn)物的等分試樣應(yīng)用TAE緩沖液，如前所述在0.7%瓊脂糖凝膠上跑膠，以產(chǎn)生預(yù)期的大約1.575kb的條帶。PCR反應(yīng)應(yīng)用MinElutePCR純化試劑盒進(jìn)行純化并將所述的DNA洗脫至50pi的EB緩沖液。每種純化的PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量通過(guò)在應(yīng)用TAE緩沖液的0.7%瓊脂糖凝膠上的觀察估計(jì)為125ng每微升。用PacI消化并在NcoI位點(diǎn)鈍化的質(zhì)粒pMJ09應(yīng)用QiaquickMinieluteColumnKit(QIAGEN,Valencia,CA)來(lái)純化。所述質(zhì)粒具有100ng每微升的濃度。所述濃度通過(guò)在應(yīng)用TAE緩沖液的0.7%瓊脂糖凝膠上的觀察來(lái)確認(rèn)?？寺∩鲜?76-M57PCR產(chǎn)物和消化的pMJ09載體通過(guò)應(yīng)用In-FusionPCR克隆試劑盒(BDBiosciences,Clonetech,PaloAlto,CA)來(lái)完成。得到的含有變體776-M57的7h'c/zoAmwee化/表達(dá)載體命名為pCW045(圖11)。實(shí)施例17:在TWc/io^wmMMe/中表達(dá)Cel7A纖維二糖水解酶I作為單獨(dú)的纖維二糖水解酶I為了在天然宿主中表達(dá)后評(píng)估所述的776-M57變體作為單獨(dú)的纖維二糖水解酶(cellobhiohydrolase)I，構(gòu)建7/c/w^/*wawase/菌抹，其中所述的纖維二糖水解酶ICei7A基因cM/已經(jīng)被破壞。應(yīng)用來(lái)自大腸桿菌的潮霉素抗性基因(/2尸/7)作為可選擇的標(biāo)記來(lái)構(gòu)建破壞盒(dismptioncassette)。所述一h標(biāo)記兩翼為同源的AW序列以靶向天然的cM/基因。擴(kuò)增所述基因組的c^z/基因應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法及PWO聚合酶(RocheAppliedScience,Manheim,Germany)來(lái)完成。所述反應(yīng)在EppendorfMastercyder5333中溫育。擴(kuò)增由IXPWO擴(kuò)增緩沖液、dCTP、dATP、dTTP和dGTP每種0.3mM、1mMMgS04、下述引物c6/z/N-term和c6/z/C-term每種1pmol和50-100ngDNA模板組成。擴(kuò)增應(yīng)用在95。C初始變性2分鐘，然后是變性1分鐘、在55。C退火2分鐘和在68°C延伸2分鐘的35個(gè)循環(huán)。引物N-term:5，-GCCTTCGGCCTTTGGGTGTA-3，(SEQIDNO:46)虧I物c6/z/C-term:5，-GAGCGGCGATTCTACGGGTT-3，(SEQIDNO:47)所述2.3kbPCR片l殳應(yīng)用ZeroBluntTOPOPCR克隆試劑盒(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)克隆并在大腸桿菌Top10纟田月包(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)中增殖。得到的構(gòu)建體為5.8kb質(zhì)粒，其命名為pSTMOl(圖12)。所述/^/7基因從所述的PHT1質(zhì)粒(Cummings等，1999,CumGenet.36:371-382)應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法及PWO聚合酶來(lái)擴(kuò)增。所述反應(yīng)在EppendorfMastercycler5333中溫育。擴(kuò)增由IXPWO擴(kuò)增緩沖液、dCTP、dATP、dTTP和dGTP每種0.3mM、1mMMgS04、下述引物hphN-term和hphC-term每種1pmol和50-100ngDNA模板組成。擴(kuò)增應(yīng)用在95°C初始變性2分鐘，然后是變性l分鐘、在55。C退火2分鐘和在68°C延伸2分鐘的35個(gè)循環(huán)。引物hphN-term:5'-GCCGCGGCACGCGCCACACGGAAAAT-3，(SEQIDNO:48)引物hphC-term:5,-GACCGGTCGCAAAATGACAAATAGAAG-3,(SEQIDNO:49)為了產(chǎn)生所述的WW破壞盒，將pSTMOl用MluI和BstEII消化以在所述c6W編碼序列中產(chǎn)生1.1kb缺口。然后應(yīng)用T4DNA聚合酶(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)來(lái)填充并在消化的質(zhì)粒中產(chǎn)生鈍端。將所述T4反應(yīng)在15°C溫育20分鐘，然后在65°C熱失活15分鐘。將全部的反應(yīng)混合物在應(yīng)用TAE緩沖液的1%瓊脂糖凝膠上分級(jí)，切除主要的條帶并應(yīng)用Qiaquick凝膠提取試劑盒從該凝膠洗脫。然后將1.7kbhph基因應(yīng)用RapidDNALigationKit插入有缺口的pSTMOl載體并轉(zhuǎn)化入OneShot大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)。所得的質(zhì)粒命名為pSMK03(圖13)。應(yīng)用pSMK03作為模板，應(yīng)用hph基因側(cè)接的PCR引物擴(kuò)增cbhIDNA。從pSMK03應(yīng)用下列引物擴(kuò)增2.7kb片段引物pSMK03-Fl:5，-GCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTG-3，(SEQIDNO:50)引物pSMK03-Rl:5，-AGCAGGCCGCATCTCCAGTGAAAG-3，(SEQIDNO:51)所述擴(kuò)增應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法及PWO聚合酶來(lái)進(jìn)行。所述反應(yīng)在EppendorfMastercycler5333中溫育。擴(kuò)增由IXPWO擴(kuò)增緩沖液、dCTP、dATP、dTTP和dGTP每種0.3mM、1mMMgS04、下述引物KON-term和KOC-term每種1mol和50-100ngDNA模板組成。擴(kuò)增應(yīng)用在95。C初始變性2分鐘，然后是變性l分鐘、在55°C退火2分鐘和在68。C延伸2分鐘的35個(gè)循環(huán)。所得的DNA片段含有639kb的cbhl啟動(dòng)子/基因序列、1.7kb的/z編碼區(qū)和659個(gè)堿基的cbhl基因/終止子序列。制備7Hc/wde/'mare^sdRutC30的原生質(zhì)體用于通過(guò)下列的方法進(jìn)4亍轉(zhuǎn)化。用5X10個(gè)分生孢子接種含有25mlYPD培養(yǎng)基的搖瓶。在34。C(150ipm)培育過(guò)夜(大約18小時(shí))之后，通過(guò)經(jīng)無(wú)菌的Mimcloth(Calbiochem,SanDiego，CA)過(guò)濾來(lái)收集菌絲體并轉(zhuǎn)移至25ml的1M山梨醇中的20mg/mlGucanex(NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)禾口1.6mg/m殼多糖酶(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。消化通常在34。C輕微振蕩(80-100rpm)的條件下進(jìn)行25-40分鐘。然后將所述原生質(zhì)體通過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾并以水凍的1M山梨醇洗滌，然后在400xg離心8分鐘。將原生質(zhì)體用25ml1M山梨醇洗滌兩次并用25ml1M山梨醇、50mMTris-HClpH8.0、50mMCaCl2洗滌兩次。然后將原生質(zhì)體應(yīng)用血球計(jì)數(shù)器(haemacytometer)計(jì)數(shù)并以1X108個(gè)原生質(zhì)體/ml的濃度重懸于由7份1M山梨醇、50mMTris-HC1pH8.0、50mMCaCl2和2份50%PEG-4000、50mMTris-HClpH8.0、50mMCaCl2組成的溶液。原生質(zhì)體或者立即應(yīng)用或者在-80。C貯存在控速制冷器(NalgeNuncInternational,Rochester,NY)中直到轉(zhuǎn)化。應(yīng)用混合并在冰上保溫5分鐘的5嗎線性DNA和5)il肝素(5mg/ml)來(lái)進(jìn)行所述原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。然后加入100微升的原生質(zhì)體并將所述混合物在冰上保溫15分鐘。然后加入500微升的50%PEG-4000、50mMTris-HClpH8.0、50mMCaCl2并在室溫溫育15分鐘。將100毫升50%PEG-4000、50mMTris-HClpH8.0、50mMCaCl2加入所述混合物并在34。C溫育20分鐘。在34。C溫育之后，加入2ml的M山梨醇、50mMTris-HClpH8.0、50mMCaCl2。將所述內(nèi)容物在將350pi的原生質(zhì)體混合物鋪于PDA平板之前進(jìn)行輕微地混合。在PDA培養(yǎng)基中以100嗎/ml潮霉素B(RocheAppliedScience,Manheim,Germany)覆蓋之前將所述平板在29。C溫育大約18小時(shí)。3天內(nèi)的潮霉素覆蓋出現(xiàn)轉(zhuǎn)化體。然后將轉(zhuǎn)化體次培養(yǎng)至含有100叱/ml潮霉素B的PDA平板。然后將在所述第二平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體用于接種到纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基(CM)。篩選纖維二糖水解酶I通過(guò)如下方法破壞的菌抹。將轉(zhuǎn)化體在纖維素酶-誘導(dǎo)培養(yǎng)基中在24-孔組織培養(yǎng)平板內(nèi)(Coming,Acton,MA)在34。C生長(zhǎng)3天。將IO微升的培養(yǎng)液加入加1%beta-巰基乙醇的10pi2X樣品緩沖液，并在8-16%Tris-甘氨酸丙烯酰胺凝膠(NUPAGENovexGelsInvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)上應(yīng)用NuPAGEMESSDS電泳緩沖液(而PAGENovexGelsInvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)跑膠?；诶w維二糖水解酶ICel7A蛋白條帶相比于親代菌抹的缺失來(lái)選擇可能的敲除體。為了證實(shí)所述c6/z/基因在已經(jīng)通過(guò)SDS-PAGE分析選擇的候選菌抹中的缺失，進(jìn)行Southern分析以評(píng)價(jià)所述cWz/基因是否已被破壞。菌絲體在含有25mYPD培養(yǎng)基的搖瓶中過(guò)夜生長(zhǎng)。然后收獲、過(guò)濾并應(yīng)用研缽和扦及液氮磨碎所述菌絲體。應(yīng)用DNeasyPlantMaxi試劑盒分離基因組DNA。將1微克DNA用HindIII或NdeI消化并在TAE緩沖液中的0.8%瓊脂糖凝膠上跑膠。通過(guò)以0.25MHC1處理用將所述DNA在所述凝膠中碎裂，用0.5MNaOH、1.5MNaCl變性，并用lMTris、pH8.0中和；1.5MNaCl用于后續(xù)在10XSSC中轉(zhuǎn)移至NytranPlusmembrane(Schleicher&SchuellBioscience,GmbH,Dassel,Germany)。所述的DNA與所述的膜UV-交聯(lián)并在60°C于20mlDIGEasyHyb(RocheAppliedScience,Manheim,Germany)子貞雜交1小時(shí)。制備兩個(gè)探針用于Southern分析。1.7kb潮霉素探針從pSMK03應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和下列引物進(jìn)行擴(kuò)增引物cpht-p:5'-GCACGCGCCACACGGAAAAT-3，(SEQIDNO:52)引物cpht-t:5，-CGCAAAATGACAAATAGAAG-3，(SEQIDNO:53)此外，2.1kb纖維二糖水解酶I探針從pSTM0應(yīng)用引物pSMK03-Fl和pSMK03-Rl通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。探針以PCRDIGProbeSynthesisKit(RocheAppliedScience,Manheim,Germany)制備。所述PCRDIGProbeSynthesismix和含鎂的PCR緩沖液以IX應(yīng)用。將ExpandHighFidelity聚合酶(RocheAppliedScience,Manheim,Germany)以每個(gè)反應(yīng)0.75jil力口入。每個(gè)反應(yīng)應(yīng)用1pmol每種引物和50-100ngDNA模板。應(yīng)用之前將所述探針通過(guò)煮沸5分鐘變性然后加入所述的雜交緩沖液。將變形的探針直接加入所述DIGEasyHyb緩沖液并在65。C雜交過(guò)夜。雜交后洗滌(兩次在2XSSC中，一次在0.4XSSC中，60°C,每次10分鐘)之后，應(yīng)用DIG才企測(cè)系統(tǒng)和CPD-Star(RocheAppliedScience,Manheim,Germany)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。所述DIG-標(biāo)記的DNA分子量標(biāo)記III試劑盒(RocheAppliedScience,Manheim，Germany)用作標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)i己的來(lái)源。Southern分析顯示單整合入特異性的轉(zhuǎn)化體的WW基因的存在。此纖維二糖水解酶I基因缺失菌株命名為7>/c/2o^r/^^ew/SaMe013。將在所述c6W啟動(dòng)子之后含有所述纖維二糖水解酶I變體776-M57的質(zhì)粒pCW045,通過(guò)PEG-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Penttila等，1987,基因61:155-164)導(dǎo)入7Hc/zocfermae化/SaMeO13。所述質(zhì)粒包含所述構(gòu)巢曲霉awc/S基因以使轉(zhuǎn)化體能在以乙酰胺作為單一氮源生長(zhǎng)。將7>/c/20^wmree化/RutC30在27。C和90rpm在25ml添加10mM尿香的YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)17小時(shí)。應(yīng)用Millipore，sVacuumDrivenDisposableFiltrationSystem(Millipore,Bedford,MA)通過(guò)過(guò)濾收集菌絲體并用去離子水洗滌兩次及用1.2M山梨醇洗滌兩次。通過(guò)將洗滌的菌絲體懸于含有15mgGlucanex每ml和0.36單位殼多糖酶每ml的20ml1.2M山梨醇并在34。C及90rpm輕微振蕩的條件下溫育15-25分鐘來(lái)產(chǎn)生原生質(zhì)體。通過(guò)在400xg離心7分鐘收集原生質(zhì)體并用冰凍的1.2M山梨醇洗滌兩次。應(yīng)用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)所述的原生質(zhì)體并重懸于STC至1X1()S原生質(zhì)體每ml的終濃度。多余的原生質(zhì)體在-8(TC貯存于CryorC冷凍容器(Nalgene,Rochester,NY)中。將大約1jigPmeI消化的pCW045加入100(il原生質(zhì)體溶液并輕微地混合，然后是260^的PEG緩沖液，混合并在室溫溫育30分鐘。然后加入STC(3ml),混合并將所述轉(zhuǎn)化溶液應(yīng)用構(gòu)巢曲霉aw^S選擇鋪于COVE平板上。將所述平板在28。C溫育5-7天。將轉(zhuǎn)化體在COVE2加尿苷平板上進(jìn)行次培養(yǎng)并在28。C生長(zhǎng)7天。將所述7Hcfe^w"wree"/轉(zhuǎn)化體在以所述轉(zhuǎn)化體的孢子接種的含有25mlpH6.0的纖維素酶-誘導(dǎo)培養(yǎng)基的125ml帶擋板的搖瓶中培養(yǎng)并在28。C和200rpm溫育7天。將7Hc/zo&rware^e/RutC30作為對(duì)照進(jìn)行操作。在第7天取出培養(yǎng)液樣品。應(yīng)用CriterionTris-HCl(8-16。/。聚丙烯酰胺)凝膠(BioRad,Hercules,CA)及CriterionSDS-PAGESystem(BioRad,Hercules,CA)進(jìn)行SDS-PAGE。將5pi的7天上清懸浮于5^的2X樣品緩沖液(BioRad，Hercules,CA)并在1。/。beta-巰基乙醇存在下加熱5分鐘。將所述上清樣品上樣于聚丙烯酰胺凝膠并以IXTris/甘氨酸/SDS作為電泳緩沖液(BioRad，Hercules,CA)進(jìn)行電泳。將得到的凝膠用Bio-SafeCoomassieStain(BioRad，Hercules,CA)染色。評(píng)價(jià)候選轉(zhuǎn)化體以顯然等于所述7Hc/o^r"wre"e/親代菌抹中觀察到的水平的水平表達(dá)所述變體Cel7A纖維二糖水解酶I776-M57的能力。在此基礎(chǔ)上選擇單一轉(zhuǎn)化體用于在發(fā)酵中進(jìn)行較大規(guī)模生產(chǎn)。應(yīng)用表達(dá)纖維二糖水解酶I變體776-M57的菌抹進(jìn)行發(fā)酵，并將rn'c/wderw"陽(yáng)e化/RutC30(宿主菌才朱)作為對(duì)照進(jìn)行才喿作。將7/c/wdfe/vware&se/RutC30的孢子接種入含有100ml木霉接種物培養(yǎng)基的500ml搖瓶。將所述搖瓶置于定軌振蕩器(orbitalshaker)在28。C振蕩大約48小時(shí)，此時(shí)將50ml的培養(yǎng)物接種入2升發(fā)酵容器中的1.8升的木霉發(fā)酵培養(yǎng)基。所述發(fā)酵在pH5.0、28°C、及在l.OVVM通氣量和1100攪拌的25%的最小溶氧的條件下運(yùn)行。在18小時(shí)將木霉補(bǔ)料培養(yǎng)基加入所述的發(fā)酵容器，以3.6g/小時(shí)的補(bǔ)料速率進(jìn)行33小時(shí)，然后為7.2g/小時(shí)。所述發(fā)酵運(yùn)行165小時(shí)，此時(shí)將最終的發(fā)酵液離心并將所迷上清貯存在-20'C。實(shí)施例18:在煙曲霉的基因組序列中鑒定糖基水解酶家族GH3A基因應(yīng)用來(lái)自棘孢曲霉的beta-糖苷酶蛋白序列(登記號(hào)No.P48825)作為查詢物，進(jìn)行所述煙曲霉部分基因組序列(TheInstituteforGenomicResearch,Rockville,MD)的tblastn搜索(Altschul等，1997,NucleicAcidsRes.25:3389-3402)?；谠诎被崴脚c所述查詢序列的高度相似性，將幾個(gè)基因鑒定為推定的家族GH3A同源物。選擇在氨基酸水平與所述查詢序列具有大于70%同一性的大約3000bp的一個(gè)基因組區(qū)用于進(jìn)一步研究。實(shí)施例19:煙曲霉基因組DNA提取將煙曲霉在250ml的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，在帶擋板的搖瓶中，在37。C和240rpm生長(zhǎng)。菌絲體通過(guò)過(guò)濾來(lái)收獲，在TE緩沖液(10mMTris-1mMEDTA)中洗滌兩次和冷凍在液氮中。冷凍的菌絲體通過(guò)研缽和扦研磨成細(xì)粉，將所述細(xì)粉重懸于含有10mMTris、100mMEDTA、1%TritonX-100、0.5M鹽酸胍(guanidine-HCl)和200mMNaCl的pH8.0緩沖液。將無(wú)Dnase的RNaseA以20mg/升的濃度加入并將所述的裂解物在37。C溫育30分鐘。細(xì)胞碎片通過(guò)離心去除，并通過(guò)應(yīng)用QiagenMaxi500柱(QIAGENInc.,Valencia,CA)分離DNA。所述的柱子在10ml的QBT中平衡，以30ml的QC洗滌并以15ml的QF洗脫(所有的緩沖液來(lái)自QIAGENInc.,Valencia,CA)。DNA在異丙醇中沉淀，在70%乙醇中洗滌，并通過(guò)離心回收。所述的DNA重懸于丁E緩沖液中。實(shí)施例20:克隆家族GH3Abeta-糖苷酶基因和構(gòu)建米曲霉表達(dá)栽體設(shè)計(jì)下面顯示的兩個(gè)合成的寡核苷酸引物，以從實(shí)施例19中制備的基因組DNA中，PCR擴(kuò)增編碼推定的家族GH3Abeta-葡糖香酶的煙曲霉基因。應(yīng)用InFusionCloningKit(BDBiosciences,PaloAlto,CA)將所述的片段直接克隆到表達(dá)載體pAILo2(實(shí)施例8;圖5)。正向引物5，-ACTGGATTTACCATGAGATTCGGTTGGCTCG-3，(SEQIDNO:54)反向引物5，-AGTCACCTCTAGTTACTAGTAGACACGGGGC-3，(SEQIDNO:55)粗體字母代表編碼序列。所剩余的序列與pAILo2(圖5)的插入位點(diǎn)同源。將50皮摩爾的每種上迷引物用于PCR反應(yīng)，所述反應(yīng)中含有100ng的煙曲霉基因組DNA、1x尸^c擴(kuò)增緩沖液(Invitrogen,Carlsbad,CA)、1.5的10mMdATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物、2.5單位的Platinum尸/cDNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)、1pi的50mMMgS04和2.5|il的10xpCRx增強(qiáng)劑溶液(Invitrogen,Carlsbad,CA),其終體積為50(il。所述的擴(kuò)增條件為一個(gè)循環(huán)，在94。C進(jìn)行2分鐘；和30個(gè)循環(huán)，每個(gè)在94。C進(jìn)行15秒、在55。C進(jìn)行30秒和在68。C進(jìn)行3分鐘。然后加熱塊進(jìn)行4"C保溫(soak)循環(huán)。所述的反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)用40mMTris堿-20mM乙酸鈉-1mMEDTA二鈉(TAE)緩沖液，在1.0%瓊脂糖凝膠上分離，其中從所述凝膠上切除3kb產(chǎn)物條帶，并應(yīng)用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN,Valencia,CA),根據(jù)制造商的說(shuō)明進(jìn)行純化。然后將所述的片段應(yīng)用InfosionCloningKit克隆到pAILo2表達(dá)載體中。所述的載體用限制性內(nèi)切酶yVcoI和尸acI(應(yīng)用制造商詳述的條件)進(jìn)行消化。所述的片段通過(guò)凝膠電泳和Qiaquick凝膠純化進(jìn)行純化。所述的基因片段和切割載體在反應(yīng)中連接在一起，得到表達(dá)質(zhì)粒pEJG97(圖14),其中家族GH3Abeta-葡糖苷酶基因的轉(zhuǎn)錄在NA2-tpi啟動(dòng)子的控制之下。所述反應(yīng)(50pl)由1xInFusion緩沖液(BDBiosciences,PaloAlto，CA)、1xBSA(BDBiosciences,PaloAlto,CA)、1pi的Inftision酶(1:10稀釋)(BDBiosciences,PaloAlto,CA)、150ng用iVcoI和尸acI消化的pAlLo2和50ng的煙曲霉beta-葡糖苷酶純化的PCR產(chǎn)物組成。所述的反應(yīng)在室溫溫育30分鐘。1jil的所述反應(yīng)用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL10SolopacGold細(xì)胞(Stratagene,LaJolla，CA)。含有所述的pEJG97質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體通過(guò)限制消化所述質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，并且應(yīng)用BioRobot9600(QIAGEN,Inc.，Valencia,CA)制備質(zhì)粒DNA。實(shí)施例21:表征編碼家族GH3Abeta-葡糖苷酶的煙曲霉基因組序列來(lái)自pEJG97的煙曲霉beta-葡糖苷酶基因的DNA測(cè)序，應(yīng)用染#+-終止子化學(xué)(Giesecke等，1992,JournalofVirologyMethods38:47-60)和引物步移(primerwalking沐略以Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XL自動(dòng)DNA測(cè)序4義(Perkin-Emer/AppliedBiosystems，Inc.,FosterCity,CA)進(jìn)4亍。<子細(xì)檢查核苷酸序列數(shù)據(jù)的質(zhì)量并借助于PHRED/PHRAP軟件(UniversityofWashington,Seattle,WA)將所有序列進(jìn)行相互比較?；谂c來(lái)自棘孢曲霉、黑曲霉和川地曲霉(A^erg///^^wc/c/2/0的同源基因的相似性，構(gòu)建煙曲霉序列的基因模型。所述的核苷酸序列(SEQIDNO:56)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:57)在圖15中顯示。所述的基因組片段編碼863個(gè)氨基酸的多肽，其被62、55、58、63、58、58、63和51bp的8個(gè)內(nèi)含子中斷。所迷基因的。/oG+C含量為54.3%。應(yīng)用SignalP軟件程序(Nidsen等，1997,戶rofe&五wg/ween力g10:1-6)，預(yù)測(cè)了19個(gè)殘基的信號(hào)肽。預(yù)測(cè)的成熟蛋白包含844個(gè)氨基酸，具有91.7kDa的分子量。應(yīng)用ClustalW方法(Higgins,1989,C4BI055:15l-153)測(cè)定beta-葡糖苷酶序列的比較比對(duì)(comparativealignment),應(yīng)用具有同一性表和下述多個(gè)比對(duì)參數(shù)的LASERGENEMEGALIGN丁M軟件(DNASTAR，Inc.,Madison,WI)進(jìn)行確定缺口罰10分和缺口長(zhǎng)度罰10分。配對(duì)比對(duì)參數(shù)為Ktuple=l,缺口罰分=3，窗口(window"5和對(duì)角線(diagonal一5。所述的比對(duì)顯示，所述煙曲霉beta-葡糖苷酵基因的推導(dǎo)的氨基酸序列，與棘孢曲霉(登錄號(hào)P48825)、黑曲霉(登錄號(hào)O00089)和川地曲霉(登錄號(hào)P87076)beta-葡糖苷酶的推導(dǎo)的氨基酸序列，分享78%、76%和76%的同一性。實(shí)施例22:在米曲霉JAL250中表達(dá)煙曲霉家族GH3Abeta-糖苷酶基因米曲霉Jal250原生質(zhì)體根據(jù)Christensen等，1988，所o/rec/z"o/ogy6:1419-1422的方法制備。5嗎的pEJG97(以及pAILo2作為載體對(duì)照)用于轉(zhuǎn)化米曲霉JAL250。用pEJG97轉(zhuǎn)化米曲霉Jal250得到大約100個(gè)轉(zhuǎn)化體。將10個(gè)轉(zhuǎn)化體分離到單獨(dú)的PDA平板。10個(gè)轉(zhuǎn)化體中的5個(gè)匯合的PDA平板，用5ml的0.01%Tween20洗滌，并單獨(dú)地接種到125ml玻璃搖瓶?jī)?nèi)的25mlMDU2BP培養(yǎng)基中，并在34°C、250rpm溫育。溫育5天后，來(lái)自每個(gè)培養(yǎng)物的0.5pl上清，應(yīng)用8-16%丁1^-甘氨酸SDS-PAGE凝膠(Invitrogen,Carlsbad,CA),根據(jù)制造商的說(shuō)明進(jìn)行分析。所述培養(yǎng)物的SDS-PAGE圖樣顯示，轉(zhuǎn)化子中一個(gè)(命名為轉(zhuǎn)化體l)具有大約130kDa的主條帶。(在PDA上生長(zhǎng)的)轉(zhuǎn)化體1的匯合的平板用10ml的0.01%Tween20洗滌并接種入含有400mlMDU2BP培養(yǎng)基的2升Fernbach以產(chǎn)生培養(yǎng)液用于表征所述的酶。所述搖瓶在第5天收獲并應(yīng)用0.22)LimGPExpressplusMembrane(Millipore,Bedford,MA)過(guò)濾。pEJG97在米曲霉中的單轉(zhuǎn)化體在發(fā)酵罐中生長(zhǎng)。將米曲霉的孢子接種入500ml搖瓶，其中含有100ml的接種培養(yǎng)基。將所述搖瓶置于定軌振蕩器在34。C振蕩大約24小時(shí)，此時(shí)將50ml的培養(yǎng)物接種入2升發(fā)酵容器中的1.8升發(fā)酵培養(yǎng)基。所述發(fā)酵在pH7.0、34°C、及在1.0VVM通氣量和1100攪拌的25%的最小溶氧的條件下運(yùn)行。在溶氧尖峰(spike)時(shí)將補(bǔ)料培養(yǎng)基以4g/小時(shí)的補(bǔ)料速率加入所述的發(fā)酵容器。所述發(fā)酵運(yùn)行164小時(shí)，此時(shí)將最終的發(fā)酵液離心并將所述上清貯存在-20'C。實(shí)施例23:表征煙曲霉beta-葡糖苷酶如實(shí)施例22中所述得到的煙曲霉beta-葡糖苷酶的3ml等分試樣，應(yīng)用BioRadEcono-Pac10DG脫鹽柱(BioRad，Hercules,CA)脫鹽，得到100mM檸檬酸鈉pH5.0中大約4ml脫鹽的培養(yǎng)液。然后將所述脫鹽的培養(yǎng)液應(yīng)用AmiconCentriconPlus-20(Biomax-5,5kDa截流，PES膜)濃縮至大約180pi并以100mM檸檬酸鈉pH5.0稀釋到大約500^il的終體積。所述脫鹽的、濃縮的培養(yǎng)液的BCA分析(Smith等，1985，Anal.Biochem.150:76-85)顯示1.00mg蛋白每ml的濃度。也將第二份等分試樣脫鹽以得到更多的材料，其產(chǎn)生相似的結(jié)果。濃縮的脫鹽的樣品的SDS-PAGE(BioRadCriterion7.5%Tris-HCl)顯示大約130kD的主條帶。從所述凝膠上切除該130kD的主條帶并進(jìn)行N-末端氨基酸測(cè)序。評(píng)價(jià)來(lái)自脫鹽的/濃縮的培養(yǎng)液的煙曲霉beta-糖苷酶在50°、65°和70。C的熱穩(wěn)定性。在50°和65。C的測(cè)試條件為100mM檸檬酸鈉pH5.0、0.01%Tween-20、4mM對(duì)-硝基苯基-beta-D-吡喃葡萄糖苷、[蛋白質(zhì)]MumGH3A=6.9Xl(T6mg/ml,在50。和65。C溫育。在0.5、1、2、3、3.75和24小時(shí)取出等分試樣。向每一個(gè)等分試樣加入1M碳酸鈉pH10.0并由405nm的吸光度測(cè)定對(duì)-硝基苯基陰離子濃度。在70。C，所述測(cè)試條件為100mM檸檬酸鈉(pH5.0)、0.01%Tween-20、4mM對(duì)-硝基苯基-beta-D-吡喃葡萄糖苷、[蛋白質(zhì)]=5.6Xl(T6mg/ml。在0.25、0.5、1、2、4和5小時(shí)取出等分試樣。向每一個(gè)等分試樣加入1M碳酸鈉pH10.0并由405nm的吸光度測(cè)定對(duì)-硝基苯基陰離子濃度。注意上述每種蛋白質(zhì)濃度是指試驗(yàn)中的總蛋白質(zhì)濃度，因?yàn)樗鼈冏鳛榕囵B(yǎng)液全部進(jìn)行分析而不是純化的酶。所述結(jié)果顯示于圖16和17中。熱穩(wěn)定性定義為給定時(shí)間間隔的線性反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，具有合理的轉(zhuǎn)化為對(duì)-賄基苯基陰離子的轉(zhuǎn)化百分比(<15%)。所述煙曲霉beta-糖苷酶看起來(lái)在50。C至少24小時(shí)是穩(wěn)定的，雖然在4小時(shí)和24小時(shí)之間沒(méi)有時(shí)間點(diǎn)。在65°C它看起來(lái)至少3.75小時(shí)是穩(wěn)定的，但之后穩(wěn)定性逐漸降低，在24小時(shí)65%轉(zhuǎn)化為對(duì)-硝基苯基陰離子。此轉(zhuǎn)化率是很高的，所以一些觀察到的速率下降除了可能的熱失活之外，可能由于底物耗盡和/或產(chǎn)物抑制。在70。C它看起來(lái)1小時(shí)是穩(wěn)定的，至2小時(shí)是比較穩(wěn)定的。如實(shí)施例22所述得到的含有來(lái)自煙曲霉的家族GH3Abeta-糖苷酶的培養(yǎng)液，首先進(jìn)行脫鹽(BioRadEcono-Pac10DG柱)并濃縮(CentriconPlus-20,Biomax-5,5kD截流)至0.92mg/ml的濃度(BCA分析)。然后，以0.037和0.0092ng/ml總蛋白用100mM杵檬酸鈉pH5.0中的10mM纖維二糖加0.01%Tween-20在65。C溫育。在0.5、1、2、3、4、6和19小時(shí)取出等分試樣。將等分試樣煮沸6分鐘以終止所述反應(yīng)，并且應(yīng)用Trinder分析(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO)和外部葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物測(cè)定葡萄糖濃度。結(jié)果在圖18中顯示。在65。C、較小蛋白上樣量(0.0092嗎/ml)的條件下，所述beta-糖苷酶6小時(shí)時(shí)看起來(lái)保持其活性的90%,而至19小時(shí)保持其活性的65%。在65°C所述beta-糖芬酶直到6小時(shí)看起來(lái)是比較穩(wěn)定的。實(shí)施例24:Cel7A變體776-M57與木霉屬纖維素酶結(jié)合的實(shí)驗(yàn)預(yù)處理的玉米秸稈(PCS)從美國(guó)能源部國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室(NationalRenewableEnergyLaboratory)(NREL)獲得。PCS中水-不溶性的固體包括56.5%纖維素、4.6%半纖維素和28.4。/。木質(zhì)素(lignin)。預(yù)處理?xiàng)l件為玉米秸稈、1.4%(重量/體積)硫酸、165。C、107p.s丄、進(jìn)行8分鐘。在分析前，用大量蒸餾的去離子水在玻璃過(guò)濾器上洗滌PCS。然后應(yīng)用咖啡磨碎機(jī)(coffeegrinder)磨碎PCS以減小粒度，然后進(jìn)一步用水在22pmMillipore過(guò)濾器(6PExpressMembrane,Stericup,Millipore,Billerica,MA)上洗滌。將洗滌的PCS在去離子水中重懸以形成20mg/ml懸浮液并貯存在4°C。將7Hc/zo(ierware&e/發(fā)酵液過(guò)濾(0.4Jim月莫，Stericup,Millipore,Billerica,MA),并通過(guò)BCA分析(PierceBiotech.,Inc.，Rockford,IL)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。在所述PCS測(cè)定中應(yīng)用來(lái)自煙曲霉的熱穩(wěn)定的beta-糖苷酶。所述煙曲霉beta-糖苷酶如實(shí)施例22中所述制備。將異源表達(dá)的煙曲霉beta-糖苷酶的發(fā)酵液進(jìn)行過(guò)濾(0.4fim膜，Stericup,Millipore,Billerica,MA)，并通過(guò)BCA分析(Pierce,Biotech.，Inc.,Rockford,IL)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。PCS測(cè)定在1.0ml的體積中進(jìn)行。測(cè)定包括lOmgPCS每ml、50mM乙酸鈉緩沖液(pH5.0)、8.5mg總發(fā)酵液蛋白質(zhì)每克纖維素和0.27mg煙曲霉beta-糖苷酶發(fā)酵液。實(shí)驗(yàn)在55。C和60°C密封試管中(ImmunoWareMicrotubes,PiereceBiotech.,Inc.,Rockford，IL)保持5天，并間歇地倒轉(zhuǎn)試管。大約每24小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)(timepoints),從所述PCS反應(yīng)中取樣。從所述試管中將10微升等分試樣移入90^的堿猝滅(quench)法混合物(0.102MNa2C03加0.058MNaHC03)。將所述的堿猝滅樣品稀釋至起始濃度的八分之一或十六分之一。樣品中通過(guò)降解PCS產(chǎn)生的還原糖的濃度通過(guò)對(duì)-羥基苯曱酸酰肼(PHBAH)實(shí)驗(yàn)(Lever,1972,AnalBiochem47:273-279),應(yīng)用石威猝滅法混合物中的2份1.25%PHBAH加入3份摔滅實(shí)驗(yàn)溶液進(jìn)行測(cè)定。然后將此溶液在95。C加熱10分鐘，然后將樣品稀釋入水中，應(yīng)用UltraMarkPlateReader(Bio-Rad,Hercules,CA)在405nm測(cè)定吸光度。將405nm的吸光度應(yīng)用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)化為葡萄糖等同物。最后，應(yīng)用纖維素的初始濃度和纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖中的增重(weightgain)因子計(jì)算纖維素轉(zhuǎn)化的程度。纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖的程度(RS收率，％)應(yīng)用如下的公式進(jìn)行計(jì)算RS收率(％)=RS(mg/ml)*100*162/(5.65(mg/ml)*180)=RS(mg/ml)*100/(5.65(mg/ml)*1.111)圖19顯示通過(guò)所述親代7Hc/2o&rma^esez'菌林，和表達(dá)變體776-M57的菌抹代替野生型Cel7A纖維二糖水解酶I的PCS水解的時(shí)間過(guò)程曲線。顯然含有所述變體的菌林在這些條件下勝過(guò)(outerforms)所述的親代。生物材料保藏依據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款，下述的生物材料已經(jīng)保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心，北方區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter),1815UniversityStreet,Peoria,Illinois,61604，給出了下述的保藏號(hào)<table>tableseeoriginaldocumentpage205</column></row><table>該菌抹于下述條件下保藏確保在本專利申請(qǐng)未決期間，由專利與商標(biāo)委員依據(jù)37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122授權(quán)的人能夠獲得該培養(yǎng)物。所述保藏物為所保藏菌抹的基本上純的培養(yǎng)物。在提交了該主題申請(qǐng)的副本，或其后續(xù)文本的國(guó)家，依據(jù)該外國(guó)專利法律的要求，可以獲得該保藏物。然而，應(yīng)當(dāng)理解，保藏物的獲得并不構(gòu)成對(duì)實(shí)施本發(fā)明的許可，實(shí)施本發(fā)明是對(duì)政府行為所授予的專利權(quán)的侵犯。在此描述并要求的本發(fā)明不局限于在此公開的具體實(shí)施方案的范圍內(nèi)，因?yàn)檫@些實(shí)施方案旨在作為本發(fā)明的某些方面的說(shuō)明。任何等同的實(shí)施方案確定地包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上，除去在這里顯示和描述的那些之外，對(duì)本發(fā)明前述的說(shuō)明書的各種更改，對(duì)于本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員是顯而易見的。這樣的更改也確定地落在附加的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在有沖突的情況下，以包含定義的本公開為準(zhǔn)。在此引用各種參考文獻(xiàn)，其公開整體地并入作為參考。權(quán)利要求1.親代糖苷水解酶的分離的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代，其中所述的變體具有糖苷水解酶活性。2.權(quán)利要求1的變體，其中所述親代糖苷水解酶是(a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸1至513具有至少70%的同一性；或(b)由核苷酸序列編碼的多肽，所述核苷酸序列在低嚴(yán)緊性條件下與SEQIDNO:1的核苷酸52至1539或其互補(bǔ)鏈雜交。3.權(quán)利要求2的變體，其中所述親代糖苷水解酶包含氨基酸序列，其與SEQIDNO:2的氨基酸1至513具有至少70%的同一性。4.權(quán)利要求2的變體，其中所述親代糖苷水解酶包含氨基酸序列，其與SEQIDNO:2的氨基酸1至513具有至少75%的同一性。5.權(quán)利要求2的變體，其中所述親代糖苷水解酶包含氨基酸序列，其與SEQIDNO:2的氨基酸1至513具有至少80%的同一性。6.權(quán)利要求2的變體，其中所述親代糖苷水解酶包含氨基酸序列，其與SEQIDNO:2的氨基酸1至513具有至少85%的同一性。7.權(quán)利要求2的變體，其中所述親代糖苷水解酶包含氨基酸序列，其與SEQIDNO:2的氨基酸1至513具有至少90%的同一性。8.權(quán)利要求2的變體，其中所述親代糖普水解酶包含氨基酸序列，其與SEQIDNO:2的氨基酸1至513具有至少95%的同一性。9.權(quán)利要求1的變體，其中所述親代糖苷水解酶包含SEQIDNO:2的氨基酸l至513。10.權(quán)利要求1的變體，其中所述親代糖苷水解酶由SEQIDNO:2的氨基酸1至513，或其具有糖苷水解酶活性的片段組成。11.權(quán)利要求2的變體，其中所述親代糖苷水解酶由核芬酸序列編碼，所述的核苷酸序列在低嚴(yán)緊性條件下與SEQIDNO:1的核苦酸52至1539雜交。12.權(quán)利要求.2的變體，其中所述親代糖苷水解酶由核苦酸序列編碼，所述的核苷酸序列在中嚴(yán)緊性條件下與SEQIDNO:1的核苷酸52至1539雜交。13.權(quán)利要求2的變體，其中所述親代糖苷水解酶由核苷酸序列編碼，所述的核香酸序列在中-高嚴(yán)緊性條件下與SEQIDNO:1的核苷酸52至1539雜交。14.權(quán)利要求2的變體，其中所述親代糖苷水解酶由核苷酸序列編碼，所述的核苷酸序列在高嚴(yán)緊性條件下與SEQIDNO:1的核苷酸52至1539雜交。15.權(quán)利要求1的變體，其中所述親代糖苷水解酶是野生型糖苷水解酶。16.權(quán)利要求1的變體，其中所述親代糖苷水解酶是枝頂孢霉屬、傘菌屬、鏈格孑包屬、曲霉屬、Botryospaeria、Chaetomidium、麥角屬、旋孑包腔菌屬、Coprinopsis、Coptotermes、Cryphonectria、黑耳屬、鐮孑包屬、赤霉屬、Holomastigotoides、腐質(zhì)霉屬、耙菌屬、Lentinula、Leptospaeria、Melanocarpus、務(wù);K孑包菌屬、青零屬、Phanerochaete、Poitrasia、尸化wobr/c/zo"yw//2a、4主丁貞孑包屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子嚢菌屬、772/e/m;/a、木霉屬、長(zhǎng)毛盤菌屬、輪枝孢屬、Volvariella或Xylaria糖苦水解酶。17.權(quán)利要求16的變體，其中所述的木霉屬糖苷水解酶是7Hc/2^/ermare^e/糖芬水解酶。18.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21的位置包含取代。19.權(quán)利要求18的變體，其中所述的取代是Pro。20.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94的位置包含取代。21.權(quán)利要求20的變體，其中所述的取代是Ser、Ala、Arg或GIn。22.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157的位置包含取代。23.權(quán)利要求22的變體，其中所述的取代是Arg。24.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205的位置包含取代。25.權(quán)利要求24的變體，其中所述的取代是Arg。26.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置206的位置包含取代。27.權(quán)利要求26的變體，其中所述的取代是Tyr。28.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDN0:2的氨基酸1至513的位置247的位置包含取代。29.權(quán)利要求28的變體，其中所述的取代是Cys。30.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置337的位置包含取代。31.權(quán)利要求30的變體，其中所述的取代是Val。32.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置350的位置包含取代。33.權(quán)利要求32的變體，其中所述的取代是Ser。34.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置373的位置包含取代。35.權(quán)利要求34的變體，其中所述的取代是His。36.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置383的位置包含取代。37.權(quán)利要求36的變體，其中所述的取代是Ala。38.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置438的位置包含取代。39.權(quán)利要求38的變體，其中所述的取代是Leu。40.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置455的位置包含取代。41.權(quán)利要求40的變體，其中所述的取代是Ala。42.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置467的位置包含取代。43.權(quán)利要求42的變體，其中所述的取代是Ser。44.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置486的位置包含取代。45.權(quán)利要求44的變體，其中所述的取代是Trp。46.權(quán)利要求1的變體，其進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8的位置包含取代。47.權(quán)利要求46的變體，其中所述的取代是Pro。48.權(quán)利要求1的變體，其進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置22的位置包含取代。49.權(quán)利要求48的變體，其中所述的取代是Asp。50.權(quán)利要求1的變體，其進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41的位置包含取代。51.權(quán)利要求50的變體，其中所述的取代是Ile。52.權(quán)利要求1的變體，其進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49的位置包含取代。53.權(quán)利要求52的變體，其中所述的取代是Ser。54.權(quán)利要求1的變體，其進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57的位置包含取代。55.權(quán)利要求54的變體，其中所述的取代是Asn。56.權(quán)利要求1的變體，其進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113的位置包含取代。57.權(quán)利要求56的變體，其中所述的取代是Asn。58.權(quán)利要求1的變體，其進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置193的位置包含取代。59.權(quán)利要求58的變體，其中所述的取代是Lys。60.權(quán)利要求1的變體，其進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196的位置包含取代。61.權(quán)利要求60的變體，其中所述的取代是Pro、Thr或Phe。62.權(quán)利要求1的變體，其進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置226的位置包含取代。63.權(quán)利要求62的變體，其中所述的取代是Ala。64.權(quán)利要求1的變體，其進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227的位置包含取代。65.權(quán)利要求64的變體，其中所述的取代是Ala、Leu或Gly。66.權(quán)利要求1的變體，其進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246的位置包含取代。67.權(quán)利要求66的變體，其中所述的取代Ile。68.權(quán)利要求1的變體，其進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置251的位置包含取代。69.權(quán)利要求68的變體，其中所述的取代是Lys。70.權(quán)利要求1的變體，其進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置255的位置包含取代。71.權(quán)利要求70的變體，其中所述的取代是Pro。72.權(quán)利要求1的變體，其進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置259的位置包含取代。73.權(quán)利要求72的變體，其中所述的取代是Asn。74.權(quán)利要求1的變體，其進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置301的位置包含取代。75.權(quán)利要求74的變體，其中所述的取代是Ser。76.權(quán)利要求1的變體，其進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置356的位置包含取代。77.權(quán)利要求76的變體，其中所述的取代是Ile。78.權(quán)利要求1的變體，其進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置371的位置包含取代。79.權(quán)利要求78的變體，其中所述的取代是Cys。80.權(quán)利要求1的變體，其進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置411的位置包含取代。81.權(quán)利要求80的變體，其中所述的取代是Phe。82.權(quán)利要求1的變體，其進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置462的位置包含取代。83.權(quán)利要求82的變體，其中所述的取代是Ala。84.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和486的位置包含取代。85.權(quán)利要求84的變體，其包含所述的取代P227A+C486W。86.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置301和337的位置包含取代。87.權(quán)利要求86的變體，其包含所述的取代Asn301Ser+Glu337Val。88.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和350的位置包含取代。89.權(quán)利要求88的變體，其包含所述的取代Serl96Pro(或Serl96Thr或Serl96Phe)+Thr350Ser。90.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置22和467的位置包含取代。91.權(quán)利要求卯的變體，其包含所述的取代Gly22Asp+Gly467Ser。92.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和57的位置包含取代。93.權(quán)利要求92的變體，其包含所述的取代Ser21Pro+Ser57Asn。94.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和411的位置包含取代。95.權(quán)利要求94的變體，其包含所述的取代Gly205Arg+Ser411Phe。96.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和227的位置包含取代。97.權(quán)利要求96的變體，其包含所述的取代Gly205Arg+Pro227Ala(或Pro227Leu或Pro227Gly)。98.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和206的位置包含取代。99.權(quán)利要求98的變體，其包含所述的取代Gly205Arg+His206Tyr。100.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8和205的位置包含取代。101.權(quán)利要求100的變體，其包含所述的取代Ser8Pro+Gly205Arg。102.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94和205的位置包含取代。103.權(quán)利要求102的變體，其包含所述的取代Gly94Ser(或Gly94Ala或Gly94Arg或Gly94Gln)+Gly205Arg。104.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和205的位置包含取代。105.權(quán)利要求104的變體，其包含所述的取代Serl96Pro+Gly205Arg。106.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置383和455的位置包含取代。107.權(quán)利要求106的變體，其包含所述的取代Thr383Ala+Thr455Ala。108.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和411的位置包含取代。109.權(quán)利要求108的變體，其包含所述的取代Serll3Asn+Ser411Phe。110.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和259的位置包含取代。111.權(quán)利要求110的變體，其包含所述的取代Pro227Ala(或Pro227Leu或Pro227Gly)+Asp259Asn。112.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94和226的位置包含取代。113.權(quán)利要求112的變體，其包含所述的取代Gly94Ser(或Gly94Ala或Gly94Arg或Gly94Gln)+Thr226Ala。114.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41和196的位置包含取代。115.權(quán)利要求114的變體，其包含所述的取代Thr41Ile+Serl96Thr(或Serl96Pro或Serl96Phe)。116.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和462的位置包含取代。117.權(quán)利要求116的變體，其包含所述的取代Serll3Asn+Serl96Thr(或Serl96Pro或Serl96Phe)+Thr462Ala。118.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、205和255的位置包含取代。119.權(quán)利要求118的變體，其包含所述的取代Lysl57Arg+Gly205Arg十Thr255Pro。120.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41、193和411的位置包含取代。121.權(quán)利要求120的變體，其包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的所述的取代Thr41Ile+Glul93Lys+Ser411Phe。122.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247、371和411的位置包含取代。123.權(quán)利要求122的變體，其包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的所述的取代Tyr247Cys+Tyr371Cys+Ser411Phe。124.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227和462的位置包含取代。125.權(quán)利要求124的變體，其包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的所述的取代Serl13Asn+Serl96Thr(或Serl96Pro或Serl96Phe)+Pro227Ala+Thr462Ala。126.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、113、227和438的位置包含取代。127.權(quán)利要求126的變體，其包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的所述的取代Asn49Ser+Serl13Asn+Pro227Ala(或Pro227Leu或Pro227Gly)+Pro438Leu。128.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、205、255和411的位置包含取代。129.權(quán)利要求128的變體，其包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的所述的取代Lysl57Arg+Gly205Arg+Thr255Pro+Ser411Phe。130.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227和411的位置包含取代。131.權(quán)利要求130的變體，其包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的所述的取代Serll3Asn+Serl96Thr(或Serl96Pro或Serl96Phe)+Pro227Ala(或Pro227Leu或Pro227Gly)+Ser411Phe。132.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、57、246、251和411的位置包含取代。133.權(quán)利要求132的變體，其包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的所述的取代Ser21Pro+Ser57Asn+Thr246Ile+Arg251Lys+Ser411Phe。134.權(quán)利要求1的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227、356和462的位置包含取代。135.權(quán)利要求134的變體，其包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的所述的耳又代Serll3Asn+Serl96Thr(或Serl96Pro或Serl96Phe)+Pro227Ala136.權(quán)利要求1的變體，其包含選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W的一個(gè)或多個(gè)取代，并任選進(jìn)一步包含選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A的一個(gè)或多個(gè)取代。137.權(quán)利要求1的變體，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的親代糖苷水解酶的氨基酸1至513具有至少70%的同一性。138.權(quán)利要求1的變體，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的親代糖苷水解酶的氨基酸1至513具有至少75%的同一性。139.權(quán)利要求1的變體，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的親代糖苷水解酶的氨基酸1至513具有至少80%的同一性。140.權(quán)利要求1的變體，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的親代糖苷水解酶的氨基酸1至513具有至少85%的同一性。141.權(quán)利要求1的變體，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的親代糖苦水解酶的氨基酸1至513具有至少90%的同一性。142.權(quán)利要求1的變體，其具有氨基酸序列，所述氨基S吏序列與SEQIDNO:2的親代糖香水解酶的氨基酸1至513具有至少95%的同一性。143.權(quán)利要求1-142中任一項(xiàng)的變體，其中取代的數(shù)目為33,更優(yōu)選32,還更優(yōu)選31,還更優(yōu)選30，還更優(yōu)選29，還更優(yōu)選28，還更優(yōu)選27,還更優(yōu)選26，還更優(yōu)選25，還更優(yōu)選24,還更優(yōu)選23,還更優(yōu)選22,還更優(yōu)選21,還更優(yōu)選20，還更優(yōu)選19,還更優(yōu)選18,還更優(yōu)選17,還更優(yōu)選16,還更優(yōu)選15,還更優(yōu)選14,還更優(yōu)選13,還更優(yōu)選12,還更優(yōu)選ll,還更優(yōu)選10,還更優(yōu)選9，還更優(yōu)選8，還更優(yōu)選7，還更優(yōu)選6，還更優(yōu)選5，還更優(yōu)選4，還更優(yōu)選3，還更優(yōu)選2和最優(yōu)選1。144.權(quán)利要求1-143中任一項(xiàng)的變體，其與所述親代糖苷水解酶相比具w有改進(jìn)的性質(zhì)，其中所述改進(jìn)的性質(zhì)選自依賴于-溫度的活性圖鐠、熱穩(wěn)定性、pH活性、pH穩(wěn)定性和底物特異性、產(chǎn)物特異性，和化學(xué)穩(wěn)定性。145.權(quán)利要求144的變體，其中所述變體糖苷水解酶的熱活性比所述野生型變體高至少2,5-倍，優(yōu)選至少2-倍，更優(yōu)選至少5-倍，最優(yōu)選至少7-倍，并且還最優(yōu)選至少20-倍。146.權(quán)利要求l的變體，其由NRRLB-30658、NRRLB-30659、NRRLB-30661、NRRLB-30662、NRRLB-30663、NRRLB-30664、NRRLB-30665、NRRLB-30666、NRRLB-30674、NRRLB-30675、NRRLB-30676、NRRLB-30677、NRRLB-30678、NRRLB掘79、NRRLB-30680、NRRLB-30681、NRRLB-30682或NRRLB-30762中包含的核香酸序列編碼。147.分離的核苷酸序列，其編碼權(quán)利要求1-146中任一項(xiàng)的變體。148.核酸構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求147的核香酸序列。149.表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求147的核普酸序列。150.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求147的核苦酸序列。151.產(chǎn)生變體的方法，其包括(a)在適于產(chǎn)生所述變體的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求150的宿主細(xì)胞；和(b)從所述培養(yǎng)基中回收所述變體。152.具有糖苷水解酶活性的分離的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDN0:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的一個(gè)或多個(gè)位置不同于SEQIDNO:2,并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代。153.權(quán)利要求152的多肽，其是是枝頂孢霉屬、傘菌屬、鏈格孢屬、曲霉屬、Bo^yo^paen.a、Chaetomidium、麥角屬、旋孑包腔菌屬、Coprinopsis、Coptotermes、Cryphonectria、，蘿、耳屬、鐮孑包屬、赤霉屬、Holomastigotoides、腐質(zhì)霉屬、把菌屬、Lentinula、Leptospaeria、Melanocarpus、脈孢菌屬、青霉屬、Phanerochaete、Poitrasia、i^ew<ic)Wc/w"_ymp/2o、才主頂孑包屬、^果節(jié)菌屬、嗜熱子嚢菌屬、77^e/av/a、木霉屬、長(zhǎng)毛盤菌屬、4侖枝孢屬、Volvariella或Xylaria糖香水解酶。154.權(quán)利要求153的多肽，其中所述木霉屬糖苷水解酶是Zh'c/7o^ma麼se〖糖普7j^解酶。155.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21的位置不同于SEQIDNO:2。156.權(quán)利要求155的多肽，其中所述的不同是Pro。157.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94的位置不同于SEQIDNO:2。158.權(quán)利要求157的多肽，其中所述的不同是Ser、Ala、Arg或Gln。159.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157的位置不同于SEQIDNO:2。160.權(quán)利要求159的多肽，其中所述的不同是Arg。161.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205的位置不同于SEQIDNO:2。162.權(quán)利要求161的多肽，其中所述的不同是Arg。163.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置206的位置不同于SEQIDNO:2。164.權(quán)利要求163的多肽，其中所述的不同是Tyr。165.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247的位置不同于SEQIDNO:2。166.權(quán)利要求165的多肽，其中所述的不同是Cys。167.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置337的位置不同于SEQIDNO:2。168.權(quán)利要求167的多肽，其中所述的不同是Val。169.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置350的位置不同于SEQIDNO:2。170.權(quán)利要求169的多肽，其中所述的不同是Ser。171.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置373的位置不同于SEQIDNO:2。172.權(quán)利要求171的多肽，其中所述的不同是His。173.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置383的位置不同于SEQIDNO:2。174.權(quán)利要求173的多肽，其中所述的不同是Ala。175.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置438的位置不同于SEQIDNO:2。176.權(quán)利要求175的多肽，其中所述的不同是Leu。177.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置455的位置不同于SEQIDNO:2。178.權(quán)利要求177的多肽，其中所述的不同是Ala。179.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置467的位置不同于SEQIDNO:2。180.權(quán)利要求179的多肽，其中所述的不同是Ser。181.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置486的位置不同于SEQIDNO:2。182.權(quán)利要求181的多肽，其中所述的不同是Trp。183.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8的位置不同于SEQIDNO:2。184.權(quán)利要求183的多肽，其中所述的不同是Pro。185.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置22的位置不同于SEQIDNO:2。186.權(quán)利要求185的多肽，其中所述的不同是Asp。187.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41的位置不同于SEQIDNO:2。188.權(quán)利要求187的多肽，其中所述的不同是Ile。189.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49的位置不同于SEQIDNO:2。190.權(quán)利要求189的多肽，其中所述的不同是Ser。191.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57的位置不同于SEQIDNO:2。192.權(quán)利要求191的多肽，其中所述的不同是Asn。193.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113的位置不同于SEQIDNO:2。194.權(quán)利要求193的多肽，其中所述的不同是Asn。195.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置193的位置不同于SEQIDNO:2。196.權(quán)利要求195的多肽，其中所述的不同是Lys。197.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196的位置不同于SEQIDNO:2。198.權(quán)利要求197的多肽，其中所述的不同是Pro、Thr或Phe。199.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置226的位置不同于SEQIDNO:2。200.權(quán)利要求199的多肽，其中所述的不同是Ala。201.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227的位置不同于SEQIDNO:2。202.權(quán)利要求201的多肽，其中所述的不同是Ala、Leu或Gly。203.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246的位置不同于SEQIDNO:2。204.權(quán)利要求203的多肽，其中所述的不同Ile。205.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置251的位置不同于SEQIDNO:2。206.權(quán)利要求205的多肽，其中所述的不同是Lys。207.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置255的位置不同于SEQIDNO:2。208.權(quán)利要求207的多肽，其中所述的不同是Pro。209.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置259的位置不同于SEQIDNO:2。210.權(quán)利要求209的多肽，其中所述的不同是Asn。211.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置301的位置不同于SEQIDNO:2。212.權(quán)利要求211的多肽，其中所述的不同是Ser。213.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置356的位置不同于SEQIDNO:2。214.權(quán)利要求213的多肽，其中所述的不同是Ile。215.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置371的位置不同于SEQIDNO:2。216.權(quán)利要求215的多肽，其中所述的不同是Cys。217.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置411的位置不同于SEQIDNO:2。218.權(quán)利要求217的多肽，其中所述的不同是Phe。219.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置462的位置不同于SEQIDNO:2。220.權(quán)利要求219的多肽，其中所述的不同是Ala。221.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和486的位置不同于SEQIDNO:2。222.權(quán)利要求221的多肽，其中所述的不同是P227A+C486W。223.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置301和337的位置不同于SEQIDNO:2。224.權(quán)利要求223的多肽，其中所述的不同是Asn301Ser+Glu337Val。225.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和350的位置不同于SEQIDNO:2。226.權(quán)利要求225的多肽，其中所述的不同是Serl96Pro(或Serl96Thr或Serl96Phe)+Thr350Ser。227.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置22和467的位置不同于SEQIDNO:2。228.權(quán)利要求227的多肽，其中所述的不同是Gly22Asp+Gly467Ser。229.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和57的位置不同于SEQIDNO:2。230.權(quán)利要求229的多肽，其中所述的不同是Ser21Pro+Ser57Asn。231.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和411的位置不同于SEQIDNO:2。232.權(quán)利要求231的多肽，其中所述的不同是Gly205Arg+Ser411Phe。233.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和227的位置不同于SEQIDNO:2。234.權(quán)利要求233的多肽，其中所述的不同是Gly205Arg+Pro227Ala(或Pro227Leu或Pro227Gly)。235.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和206的位置不同于SEQIDNO:2。236.權(quán)利要求235的多肽，其中所述的不同是Gly205Arg+His206Tyr。237.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8和205的位置不同于SEQIDNO:2。238.權(quán)利要求237的多肽，其中所述的不同是Ser8Pro;Gly205Arg。239.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94和205的位置不同于SEQIDNO:2。240.權(quán)利要求239的多肽，其中所述的不同是Gly94Ser(或Gly94Ala或Gly94Arg或Gy94Gln)+Gly205Arg。241.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和205的位置不同于SEQIDNO:2。242.權(quán)利要求的多肽241,其中所述的不同是Serl96Pro+Gly205Arg。243.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置383和455的位置不同于SEQIDNO:2。244.權(quán)利要求243，其中所述的不同是Thr383Ala+Thr455Ala。245.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和411的位置不同于SEQIDNO:2。246.權(quán)利要求245的多肽，其中所述的不同是Serll3Asn+Ser411Phe。247.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和259的位置不同于SEQIDNO:2。248.權(quán)利要求247的多肽，其中所述的不同是Pro227Ala(或Pro227Leu或Pro227Gly)+Asp259Asn。249.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SF,QIDNO:2的氨基酸1至513的位置94和226的位置不同于SEQIDNO:2。250.權(quán)利要求249的多肽，其中所述的不同是Gly94Ser(或Gly94Ala或Gly94Arg或Gly94Gln)+Thr226Ala。251.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸I至513的位置41和196的位置不同于SEQIDNO:2。252.權(quán)利要求251的多肽，其中所述的不同是Thr41Ile+Serl96Thr(或Serl96Pro或Serl96Phe)。253.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和462的位置不同于SEQIDNO:2。254.權(quán)利要求253的多肽，其中所述的不同是Serl13Asn+Serl96Thr(或Serl96Pro或Serl96Phe)+Thr462Ala。255.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、205和255的位置不同于SEQIDNO:2。256.權(quán)利要求255的多肽，其中所述的不同是1^157八^+0^205八巧+Thr255Pro。257.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置41、193和411的位置不同于SEQIDNO:2。258.權(quán)利要求257的多肽，其中所述的不同是SEQIDNO:2的氨基酸1至513的Thr41Ile+Glul93Lys+Ser411Phe。259.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247、371和411的位置不同于SEQIDNO:2。260.權(quán)利要求259的多肽，其中所述的不同是SEQIDNO:2的氨基酸1至513的Tyr247Cys+Tyr371Cys+Ser411Phe。261.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227和462的位置不同于SEQIDNO:2。262.權(quán)利要求261的多肽，其中所述的不同是SEQIDNO:2的氨基酸1至513的Serll3Asn+Serl96Thr(或Serl96Pro或Serl96Phe)+Pro227Ala+Thr462Ala。263.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、113、227和438的位置不同于SEQIDNO:2。264.權(quán)利要求263的多肽，其中所述的不同是SEQIDNO:2的氨基酸1至513的Asn49Ser+Serll3Asn+Pro227Ala(或Pro227Leu或Pro227Gly)+Pro438Leu。265.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、205、255和411的位置不同于SEQIDNO:2。266.權(quán)利要求265的多肽，其中所述的不同是SEQIDNO:2的氨基酸1至513的Lysl57Arg+Gly205Arg+Thr255Pro+Ser411Phe。267.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227和411的位置不同于SEQIDNO:2。268.權(quán)利要求267的多肽，其中所述的不同是SEQIDNO:2的氨基酸1至513的Serl13Asn+Serl96Thr(或Serl96Pro或Serl96Phe)+Pro227Ala(或Pro227Leu或Pro227Gly)+Ser411Phe。269.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置21、57、246、251和411的位置不同于SEQIDNO:2。270.權(quán)利要求269的多肽，其中所述的不同是SEQIDNO:2的氨基酸1至513的Ser21Pro+Ser57Asn+Thr246Ile+Arg251Lys+Ser411Phe。271.權(quán)利要求152的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227、356和462的位置不同于SEQIDNO:2。272.權(quán)利要求271的多肽，其中所述的不同是SEQIDNO:2的氨基酸1至513的Serll3Asn+Serl96Thr(或Serl96Pro或Serl96Phe)+Pro227Ala(或Pro227Leu或Pro227Gly)+Thr356Ile+Thr462Ala。273.權(quán)利要求152的多肽，其包含一個(gè)或多個(gè)不同，所述的不同選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W,并任選地進(jìn)一步相差一個(gè)或多個(gè)不同，所述的不同選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、SI13N、S196丁、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A。274.權(quán)利要求152-273中任一項(xiàng)的多肽，其中不同的總數(shù)為33,更優(yōu)選32，還更優(yōu)選31，還更優(yōu)選30，還更優(yōu)選29,還更優(yōu)選28，還更優(yōu)選27，還更優(yōu)選26,還更優(yōu)選25，還更優(yōu)選24，還更優(yōu)選23,還更優(yōu)選22,還更優(yōu)選21,還更優(yōu)選20,還更優(yōu)選19,還更優(yōu)選18,還更優(yōu)選17，還更優(yōu)選16，還更優(yōu)選15,還更優(yōu)選14，還更優(yōu)選13，還更優(yōu)選12,還更優(yōu)選H，還更優(yōu)選10,還更優(yōu)選9，還更優(yōu)選8，還更優(yōu)選7，還更優(yōu)選6，還更優(yōu)選5,還更優(yōu)選4，還更優(yōu)選3，還更優(yōu)選2并最優(yōu)選1。275.權(quán)利要求152-274中任一項(xiàng)的多肽，其與所述親代糖苷水解酶相比具有改進(jìn)的性質(zhì)，其中所述改進(jìn)的性質(zhì)選自依賴于-溫度的活性圖譜、熱穩(wěn)定性、pH活性、pH穩(wěn)定性和底物特異性、產(chǎn)物特異性，和化學(xué)穩(wěn)定性。276.權(quán)利要求275的多肽，其中所述多肽糖苷水解酶的熱活性比所述野生型多肽高至少2.5-倍，優(yōu)選至少2-倍，更優(yōu)選至少5-倍，最優(yōu)選至少7-倍，并且還最優(yōu)選至少20-倍。277.權(quán)利要求152的多肽，其由NRRLB-30658、NRRLB-30659、NRRLB-30661、NRRLB國(guó)30662、NRRLB-30663、NRRLB-30664、NRRLB-30665、NRRLB-30666、NRRLB-30674、NRRLB-30675、NRRLB腸30676、NRRLB-30677、NRRLB-30678、NRRLB-30679、NRRLB-30680、NRRLB-30681、NRRLB-30682或NRRLB-30762中包含的核香酸序列編碼。278.分離的核苷酸序列，其編碼權(quán)利要求152-277中任一項(xiàng)的多肽。279.核酸構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求278的核苷酸序列。280.表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求278的核苷酸序列。281.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求278的核苷酸序列。282.產(chǎn)生多肽的方法，其包括(a)在適于產(chǎn)生所述變體的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求281的宿主細(xì)胞；和(b)從所述培養(yǎng)基中回收所述變體。283.獲得親代糖苷水解酶的變體的方法，其包括(a)在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的一個(gè)或多個(gè)位置將取代導(dǎo)入所述的親代糖苷水解酶，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置導(dǎo)入取代，其中所述的變體具有糖苷水解酶活性；和(b)回收所述的變體。284.權(quán)利要求283的方法，其中所述親代糖苷水解酶是(a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸1至513具有至少70%的同一性；或(b)由核苷酸序列編碼的多肽，所述核苷酸序列在低嚴(yán)緊性條件下與SEQIDNO:1的核苷酸52至1539或其互補(bǔ)M;雜交。285.權(quán)利要求284的方法，其中所述親代糖苷水解酶包含氨基酸序列，其與SEQIDNO:2的氨基酸1至513具有至少70%的同一性。286.權(quán)利要求284的方法，其中所述親代糖苦水解酶包含氨基酸序列，其與SEQIDN0:2的氨基酸1至513具有至少75。/。的同一性。287.權(quán)利要求284的方法，其中所述親代糖苷水解酶包含氨基酸序列，其與SEQIDNO:2的氨基酸1至513具有至少80°/。的同一性。288.權(quán)利要求284的方法，其中所述親代糖苷水解酶包含氨基酸序列，其與SEQIDNO:2的氨基酸1至513具有至少85%的同一性。289.權(quán)利要求284的方法，其中所述親代糖苦水解酶包含氨基酸序列，其與SEQIDNO:2的氨基酸1至513具有至少90%的同一性。290.權(quán)利要求284的方法，其中所述親代糖苷水解酶包含氨基酸序列，其與SEQIDNO:2的氨基酸1至513具有至少95%的同一性。291.權(quán)利要求283的方法，其中所述親代糖苷水解酶包含SEQIDNO:2的氨基酸l至513。292.權(quán)利要求283的方法，其中所述親代糖苷水解酶由SEQIDNO:2的氨基酸1至513，或其具有糖苷水解酶活性的片段組成。293.權(quán)利要求284的方法，其中所述親代糖苷水解酶由核香酸序列編碼，所述的核苦酸序列在低嚴(yán)緊性條件下與SEQIDNO:1的核苷酸52至1539雜六294.權(quán)利要求284的方法，其中所述親代糖苷水解酶由核苷酸序列編碼，所述的核苷酸序列在中嚴(yán)緊性條件下與SEQIDNO:1的核苷酸52至1539雜交。295.權(quán)利要求284的方法，其中所述親代糖苦水解酶由核苷酸序列編碼，所述的核苷酸序列在中-高嚴(yán)緊性條件下與SEQIDNO:1的核苷酸52至1539雜交。296.權(quán)利要求284的方法，其中所述親代糖苷水解酶由核苷酸序列編碼，所述的核苦酸序列在高嚴(yán)緊性條件下與SEQIDNO:1的核苷酸52至1539雜交。297.權(quán)利要求283的方法，其中所述親代糖苷水解酶是野生型糖苷水解酶。298.權(quán)利要求283的方法，其中所述親代糖苷水解酶是枝頂孢霉屬、傘菌屬、鏈才各孢屬、曲霉屬、5W/7ospaeWa、Chaetomidium、麥角屬、旋孑包月空菌屬、Coprinopsis、Coptotermes、Cryphonectria、黑耳屬、嫌孑包屬、赤審屬、Holomastigotoides、腐質(zhì)霉屬、耙菌屬、Lentinula、Leptospaeria、Melanocarpus、脈孑包菌屬、青霉屬、Phanerochaete、Poitrasia、/^ez^on'c/zo"戸//w;、柱丁貞孑包屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子嚢菌屬、Thielavia、木霉屬、長(zhǎng)毛盤菌屬、輪枝孢屬、Volvariella或Xylaria糖芬水解酶。299.權(quán)利要求298的方法，其中所述的木霉屬糖苷水解酶是7Wc/2oJermareesei糖苷水解酶。300.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21的位置包含取代。301.權(quán)利要求300的方法，其中所述的取代是Pro。302.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94的位置包含取代。303.權(quán)利要求302的方法，其中所述的取代是Ser、Ala、Arg或Gln。304.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157的位置包含取代。305.權(quán)利要求304的方法，其中所述的取代是Arg。306.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205的位置包含取代。307.權(quán)利要求306的方法，其中所述的取代是Arg。308.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置206的位置包含取代。309.權(quán)利要求308的方法，其中所述的取代是Tyr。310.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247的位置包含取代。311.權(quán)利要求310的方法，其中所述的取代是Cys。312.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置337的位置包含取代。313.權(quán)利要求312的方法，其中所述的取代是Val。314.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置350的位置包含取代。315.權(quán)利要求314的方法，其中所述的取代是Ser。316.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置373的位置包含取代。317.權(quán)利要求316的方法，其中所述的取代是His。318.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置383的位置包含取代。319.權(quán)利要求318的方法，其中所述的取代是Ala。320.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置438的位置包含取代。321.權(quán)利要求320的方法，其中所述的取代是Leu。322.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置455的位置包含取代。323.權(quán)利要求322的方法，其中所述的取代是Ala。324.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置467的位置包含取代。325.權(quán)利要求324的方法，其中所述的取代是Ser。326.權(quán)利要求283的方法，其.中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置486的位置包含取代。327.權(quán)利要求326的方法，其中所述的取代是Trp。328.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8的位置包含取代。329.權(quán)利要求328的方法，其中所述的取代是Pro。330.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置22的位置包含取代。331.權(quán)利要求330的方法，其中所述的取代是Asp。332.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41的位置包含取代。333.權(quán)利要求332的方法，其中所述的取代是Ile。334.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49的位置包含取代。335.權(quán)利要求334的方法，其中所述的取代是Ser。336.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置57的位置包含取代。337.權(quán)利要求336的方法，其中所述的取代是Asn。338.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113的位置包含取代。339.權(quán)利要求338的方法，其中所述的取代是Asn。340.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置193的位置包含取代。341.權(quán)利要求340的方法，其中所述的取代是Lys。342.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196的位置包含取代。343.權(quán)利要求342的方法，其中所述的取代是Pro、Thr或Phe。344.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置226的位置包含取代。345.權(quán)利要求344的方法，其中所述的取代是Ala。346.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227的位置包含取代。347.權(quán)利要求346的方法，其中所述的取代是Ala、Leu或Gly。348.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置246的位置包含取代。349.權(quán)利要求348的方法，其中所述的取代Ile。350.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置251的位置包含取代。351.權(quán)利要求350的方法，其中所述的取代是Lys。352.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置255的位置包含取代。353.權(quán)利要求352的方法，其中所述的取代是Pro。354.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置259的位置包含取代。355.權(quán)利要求354的方法，其中所述的取代是Asn。356.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置301的位置包含取代。357.權(quán)利要求356的方法，其中所述的取代是Ser。358.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置356的位置包含取代。359.權(quán)利要求358的方法，其中所述的取代是Ile。360.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變，進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置371的位置包含取代。361.權(quán)利要求360的方法，其中所述的取代是Cys。362.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置411的位置包含取代。363.權(quán)利要求362的方法，其中所述的取代是Phe。364.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置462的位置包含取代。365.權(quán)利要求364的方法，其中所述的取代是Ala。366.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和486的位置包含取代。367.權(quán)利要求366的方法，其中所述的變體包含取代P227A+C486W。368.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置301和337的位置包含取代。369.權(quán)利要求368的方法，其中所述的變體包含耳又代Asn301Ser+Glu337Val。370.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和350的位置包含取代。371.權(quán)利要求370的方法，其中所述的變體包含取代Serl96Pro(或Serl96Thr或Serl96Phe)+Thr350Ser。372.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置22和467的位置包含取代。373.權(quán)利要求372的方法，其中所述的變體包含取代Gly22Asp+Gly467Ser。374.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置21和57的位置包含取代。375.權(quán)利要求374的方法，其中所述的變體包含取代Ser21Pro+Ser57Asn。376.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和411的位置包含取代。377.權(quán)利要求376的方法，其中所述的變體包含取代Gly205Arg+Ser411Phe。378.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和227的位置包含取代。379.權(quán)利要求378的方法，其中所述的變體包含耳又代Gly205Arg+Pro227Ala(或Pro227Leu或Pro227Gly)。380.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置205和206的位置包含取代。381.權(quán)利要求380的方法，其中所述的變體包含取代Gly205Arg+His206Tyr。382.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置8和205的位置包含取代。383.權(quán)利要求382的方法，其中所述的變體包含取代Ser8Pro+Gly205Arg。384.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94和205的位置包含取代。385.權(quán)利要求384的方法，其中所述的變體包含取代Gly94Ser(或Gly94Ala或Gly94Arg或Gly94Gln)+Gly205Arg。386.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置196和205的位置包含取代。387.權(quán)利要求386的方法，其中所述的變體包含取代Serl96Pro+Gly205Arg。388.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置383和455的位置包含取代。389.權(quán)利要求388的方法，其中所述的變體包含耳又代Thr383Ala+Thr455Ala。390.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113和411的位置包含取代。391.權(quán)利要求390的方法，其中所述的變體包含耳又代Serll3Asn+Ser411Phe。392.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置227和259的位置包含取代。393.權(quán)利要求392的方法，其中所述的變體包含耳又代Pro227Ala(或Pro227Leu或Pro227Gly)+Asp259Asn。394.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置94和226的位置包含取代。395.權(quán)利要求394的方法，其中所述的變體包含取代Gly94Ser(或Gly94Ala或Gly94Arg或Gly94Gln)+Thr226Ala。396.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41和196的位置包含取代。397.權(quán)利要求396的方法，其中所述的變體包含取代Thr41Ile+Serl96Thr(或Serl96Pro或Serl96Phe)。398.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196和462的位置包含取代。399.權(quán)利要求398的方法，其中所述的變體包含取代Serll3Asn+Serl96Thr(或Serl96Pro或Serl96Phe)+Thr462Ala。400.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、205和255的位置包含取代。401.權(quán)利要求400的方法，其中所述的變體包含取代Lysl57Arg+Gly205Arg+Thr255Pro。402.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置41、193和411的位置包含耳又代。403.權(quán)利要求402的方法，其中所述的變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代Thr41Ile+Glul93Lys+Ser411Phe。404.;f又利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置247、371和411的位置包含取代。405.權(quán)利要求404的方法，其中所述的變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代Tyr247Cys+Tyr371Cys+Ser411Phe。406.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227和462的位置包含取代。407.權(quán)利要求406的方法，其中所述的變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代Serll3Asn+Serl96丁hrC或Serl96Pro或Serl96Phe;)+Pro227Ala+Thr462Ala。408.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置49、113、227和438的位置包含取代。409.權(quán)利要求408的方法，其中所述的變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代Asn49Ser+Serll3Asn+Pro227Ala(或Pro227Leu或Pro227Gly)+Pro438Leu。410.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置157、205、255和411的位置包含取代。411.權(quán)利要求410的方法，其中所述的變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代Lysl57Arg+Gly205Arg+Thr255Pro+Ser411Phe。412.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227和411的位置包含取代。413.權(quán)利要求412的方法，其中所述的變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代Serll3Asn+Serl96Thr(或Serl96Pro或Serl96Phe)+Pro227AIa(或Pro227Leu或Pro227Gly)+Ser411Phe。414.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸l至513的位置21、57、246、251和411的位置包含取代。415.權(quán)利要求414的方法，其中所述的變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代Ser21Pro+Ser57Asn+Thr246Ile+Arg251Lys十Ser411Phe。416.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸1至513的位置113、196、227、356和462的位置包含取代。417.權(quán)利要求416的方法，其中所述的變體包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513的取代Serll3Asn+Serl96Thr(或Serl96Pro或Serl96Phe)+Pro227Ala(或Pro227Leu或Pro227Gly)+Thr356Ile+Thr462Ala。418.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體包含一個(gè)或多個(gè)取代，所述取代選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S21P、G94S、G94A、G94R、G94Q、K157R、E193K、S196P、S196F、G205R、H206Y、P227L、P227G、T246I、Y247C、D259N、R251K、N301S、E337V、T350S、N373H、T383A、P438L、T455A、G467S和C486W,并任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)取代，所述取代選自SEQIDNO:2的氨基酸1至513的S8P、G22D、T41I、N49S、S57N、S113N、S196T、T226A、P227A、T255P、T356I、Y371C、S411F和T462A。419.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體具有氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的親代糖苷水解酶的氨基酸1至513具有至少70%的同一性。420.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體具有氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的親代糖苷水解酶的氨基酸1至513具有至少75%的同一性。421.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體具有氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的親代糖苷水解酶的氨基酸1至513具有至少80%的同一性。422.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體具有氨基S吏序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的親代糖苷水解酶的氨基酸1至513具有至少85%的同一性。423.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體具有氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的親代糖苷水解酶的氨基酸1至513具有至少卯％的同一性。424.權(quán)利要求283的方法，其中所述的變體具有氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的親代糖苷水解酶的氨基酸1至513具有至少95%的同一性。425.權(quán)利要求283-424中任一項(xiàng)的方法，其中取代的總數(shù)為33，更優(yōu)選32，還更優(yōu)選31，還更優(yōu)選30,還更優(yōu)選29,還更優(yōu)選28，還更優(yōu)選27，還更優(yōu)選26,還更優(yōu)選25,還更優(yōu)選24,還更優(yōu)選23,還更優(yōu)選22，還更優(yōu)選21，還更優(yōu)選20,還更優(yōu)選19,還更優(yōu)選18，還更優(yōu)選17,還更優(yōu)選16,還更優(yōu)選15,還更優(yōu)選14,還更優(yōu)選13，還更優(yōu)選12,還更優(yōu)選ll,還更優(yōu)選10,還更優(yōu)選9，還更優(yōu)選8，還更優(yōu)選7，還更優(yōu)選6，還更優(yōu)選5,還更優(yōu)選4，還更優(yōu)選3，還更優(yōu)選2并最優(yōu)選1。426.權(quán)利要求283-424中任一項(xiàng)的方法，其與所述親代糖苷水解酶相比具有改進(jìn)的性質(zhì)，其中所述改進(jìn)的性質(zhì)選自依賴于-溫度的活性圖譜、熱穩(wěn)定性、pH活性、pH穩(wěn)定性和底物特異性、產(chǎn)物特異性，和化學(xué)穩(wěn)定性。427.權(quán)利要求426的方法，其中所述變體糖苷水解酶的熱活性比所述野生型變體高至少2.5-倍，優(yōu)選至少2-倍，更優(yōu)選至少5-倍，最優(yōu)選至少7-倍，并且還最優(yōu)選至少20-倍。428.權(quán)利要求283的方法，其由NRRLB-30658、NRRLB-30659、NRRLB-30661、NRRLB-30662、NRRLB隱30663、NRRLB國(guó)30664、NRRLB陽(yáng)30665、NRRLB匿30666、NRRLB-30674、NRRLB-30675、NRRLB畫30676、NRRLB-30677、NRRLB-30678、NRRLB-30679、NRRLB-30680、NRRLB陽(yáng)30681、NRRLB-30682或NRRLB-30762中包含的核苷酸序列編碼。429.具有纖維二糖水解酶活性的分離的多肽，其包含SEQIDNO:2的氨基酸1至513。430.分離的核苷酸序列，其編碼權(quán)利要求429的多肽。431.權(quán)利要求430的核苷酸序列，其包含于pAJ052中，所述的pAJ052包含于大腸桿菌NRRLB-30683。432.表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求430的核苷酸序列。433.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求430的核苷酸序列。434.產(chǎn)生具有纖維二糖水解酶活性的多肽的方法，其包括(a)在適于表達(dá)所述多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求433的宿主細(xì)胞；和(b)從所述培養(yǎng)基中回收所述多肽。435.權(quán)利要求429的產(chǎn)生具有纖維二糖水解酶活性的多肽的方法，其包括(a)在適于表達(dá)所述多肽的條件下培養(yǎng)菌抹，其中所述菌抹以其野生型形式能夠產(chǎn)生所述的多肽；和(b)從所述培養(yǎng)基中回收所述多肽。436.洗滌劑組合物，其包含權(quán)利要求1-146中任一項(xiàng)的變體和表面活性劑。437.降解含-纖維素和半纖維素的生物質(zhì)的方法，其包括用有效量的權(quán)利要求i_i46中任一項(xiàng)的變體處理所述的生物質(zhì)，和回收所降解的生物質(zhì)。438.權(quán)利要求437的方法，其進(jìn)一步包括用有效量的內(nèi)-l,4-beta-葡聚糖酶和外—1，4—beta-D-葡聚糖酶處理所述的生物質(zhì)。439.降解含-纖維素和半纖維素的生物質(zhì)的方法，其包括用權(quán)利要求150或281的宿主細(xì)胞處理所述的生物質(zhì)，和回收所降解的生物質(zhì)。440.權(quán)利要求439的方法，其進(jìn)一步包括用有效量的內(nèi)-l，4-beta-葡聚糖酶和外-l,4-beta-D-葡聚糖酶處理所述的生物質(zhì)。441.包含權(quán)利要求147或278的核苷酸序列的植物。全文摘要本發(fā)明涉及親代糖苷水解酶的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2的氨基酸1至513的位置21、94、157、205、206、247、337、350、373、383、438、455、467和486的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代，并任選地進(jìn)一步在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代，在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2的氨基酸1至513的位置8、22、41、49、57、113、193、196、226、227、246、251、255、259、301、356、371、411和462的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代，其中所述的變體具有糖苷水解酶活性。本發(fā)明也涉及編碼所述變體糖苷水解酶的核苷酸序列并涉及包含所述核苷酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞。文檔編號(hào)C12N5/10GK101410514SQ200480031516公開日2009年4月15日申請(qǐng)日期2004年8月25日優(yōu)先權(quán)日2003年8月25日發(fā)明者喬爾·徹里,保羅·哈里斯,奧布里·瓊斯,瓊·伊,科尼·沃德,薩拉·泰特申請(qǐng)人:諾維信股份有限公司