養(yǎng)48h，在長出菌落的平板上篩選出水解圈與菌落直徑比值最大者挑至斜面保存，純化后配制成菌懸液，經梯度稀釋后(10 LlO 5)取20mL菌懸液與ImL硫酸二乙酯原液充分混合，并于30°C震蕩處理40min，將處理過的菌液涂布于氯化鋰平板。
[0041](3)高產菌種的初篩
[0042]將上述涂布均勻的平板，置30°C培養(yǎng)48h，在長出菌落的平板上初篩出水解圈與菌落直徑比值較大者挑至斜面保存，純化后獲得三株菌901-11，901-15，901-18 ；
[0043](4)搖瓶發(fā)酵復篩
[0044]將獲得的三株菌901-11,901-15，901-18在含有30mL馬鈴薯液體培養(yǎng)基的250mL搖瓶中進行搖瓶發(fā)酵，種子接種量10% (V/V)，300C、100r/min培養(yǎng)72h，離心取發(fā)酵上清液制得粗酶液。
[0045]所述的氯化鋰平板:淀粉I %，蛋白胨I %，(NH)2SO40.4 %, K2HPO40.8 %,CaCl20.2%，氯化鋰 0.9%,瓊脂 2%。
[0046]實施例2:酶活性的測定
[0047](I)酶活單位的定義:lmL粗酶液,于65°C、ρΗ5.5條件下，Imin液化Img可溶性淀粉，即為I個酶活力單位，以U/mL表示。
[0048](2)采用DNS法測定901-11,901-15，901-18的淀粉酶活性，得知，901-18具有穩(wěn)定最高酶活性。
[0049]實施例3:酶學性質的測定
[0050](I)溫度對酶活性的影響以及酶的熱穩(wěn)定性
[0051]相同反應體系，于40-80°C下分別測定該淀粉酶酶活力，結果表明該酶在50_75°C之間均表現(xiàn)較高酶活性，說明該酶的溫度適應范圍較寬。且熱穩(wěn)定實驗表明，該酶在70°C保溫3h后，于65°C，pH5.5條件下仍然具有80%以上酶活定，溫度高于75°C，酶活損失嚴重。
[0052](2) pH對酶活性的影響
[0053]相同反應體系，在pH3_8.5下分別測該酶酶活，結果表明該酶在pH4.5-7時均具有70%以上的酶活，且pH5.5時達到最大值。
[0054]實施例4:一種變溫調節(jié)生產耐高溫α -淀粉酶的方法，包括如下步驟:
[0055](I)菌種活化
[0056]將保存完好的里氏木霉901-18的斜面菌種接種于馬鈴薯斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)48h進行菌種活化，如此活化3次；
[0057](2)液體種子擴大培養(yǎng)
[0058]①一級種子培養(yǎng):將步驟(I)活化后的斜面菌種制成的孢子懸液接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，接種后孢子濃度達到15個/mL，搖床120r/min，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間1h ；
[0059]②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0060]③三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000 _升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉式搖床100r/min，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間10_15h ；
[0061]④一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度30°C，攪拌速度150r/min，通風量(V/V)l:1.5，罐壓
0.05Mpa,培養(yǎng)時間15h ；
[0062]所一級、二級、三級種子培養(yǎng)基重量組成為:
[0063]酵母粉0.4%，葡萄糖1.2%，蛋白胨0.4%，牛肉膏0.6%，磷酸氫二鉀1.1%，海藻糖2%，硫酸鈣lg，氯化鎂2g，檸檬酸鈉2g，不足部分純凈水補足，pH值5.5，123°C滅菌40mino
[0064]所述種子罐培養(yǎng)基重量組成為:
[0065]麥芽糊精10 %，酵母粉0.6 %，海藻糖2 %，蛋白胨0.3 %，玉米漿0.3 %，磷酸氫二鉀1.1 %，硫酸鎂0.08%，檸檬酸鈉0.3%，不足部分純凈水補足，pH值5.5，123°C滅菌40mino
[0066](3)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0067]將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度30°C，攪拌速度150r/min，通風量(V/V) 1:2，培養(yǎng)時間12h ;然后以2°C /h降溫速率緩慢降溫至12°C，恒溫培養(yǎng)18h ;繼續(xù)以2°C /h降溫速率緩慢降溫至4°C，此時，將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)25h ;最后以2°C /h升溫速率緩慢升溫至12°C，恒溫培養(yǎng)18h ;繼續(xù)以2°C /h升溫速率緩慢升溫至30°C，恒溫培養(yǎng)18h ；
[0068]溶解氧控制:通過調整攪拌轉速及通風量，控制溶解氧20% ；
[0069]PH控制:通過補氨水或稀磷酸，控制發(fā)酵過程中pH值保持在5.5 ；
[0070]補料控制:當發(fā)酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時，開始添加補料培養(yǎng)基，補料量以維持發(fā)酵液還原糖含量為2mg/ml-5mg/ml ；
[0071]放罐標準:70%菌體衰老自溶,酶活力增長緩慢。
[0072]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精100g，玉米粉55g，豆餅粉20g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米漿3g，硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉3g，消泡劑0.5g,純凈水 100mL, pH 值 5.5，121°C 滅菌 20min ；
[0073]所述補料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精25%，玉米粉15%，豆粉20%，不足部分純凈水補足，pH值5.5,123°C滅菌40min。
[0074](4)發(fā)酵液經過濾、濃縮、調配、精濾、干燥得耐高溫真菌α -淀粉酶。
[0075]經上述制備方法得到的真菌α -淀粉酶液體酶活力為15000u/ml。
【主權項】
1.一株高產耐高溫真菌a-淀粉酶的里氏木霉，其特征在于，所述里氏木霉具體為里氏木霉 901-18Trichoderma reesei 901-18，保藏編號為 CCTCC NO:M 2013602。2.如權利要求1所述的一株高產耐高溫真菌α-淀粉酶的里氏木霉，其特征在于，所述里氏木霉能夠生產耐高溫真菌ct -淀粉酶。3.如權利要求1所述的一株高產耐高溫真菌α-淀粉酶的里氏木霉，其特征在于，所述里氏木霉生產耐高溫真菌α-淀粉酶的方法為: 將菌株901-18經過三級種子發(fā)酵和一級種子罐發(fā)酵后進入發(fā)酵罐發(fā)酵階段； 將發(fā)酵菌種的一級種子罐發(fā)酵液以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度27-30°C，攪拌速度120-180r/m，通風量(V/V) 1:1-3，培養(yǎng)時間10_15h ;然后以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至2_5°C，此時，繼續(xù)將一級種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至10_15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至27_30°C，恒溫培養(yǎng)15_20h ； 補料控制:當發(fā)酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時,開始添加補料培養(yǎng)基,補料量以維持發(fā)酵液還原糖含量為2mg/ml-5mg/ml ； 放罐標準:60-80%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢； 發(fā)酵液經過濾、濃縮、調配、精濾、干燥得耐高溫真菌ct -淀粉酶。
【專利摘要】本發(fā)明公布了一株高產耐高溫真菌α-淀粉酶的里氏木霉。本發(fā)明以里氏木霉為出發(fā)菌株，經紫外-氯化鋰-硫酸二乙酯復合誘變，得到高耐高溫真菌α-淀粉酶的里氏木霉突變菌株。所述里氏木霉901-18？Trichoderma？reesei？901-18于2013年11月24日保藏于中中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號為CCTCC？NO:M？2013602。該菌株所產的耐高溫真菌α-淀粉酶酶活力高達12000-15000u/ml，適用溫度范圍為50-75℃，pH4.5-7.0,特別適合反應溫度高、液化工藝與糖化工藝并存的工業(yè)化需求。CCTCC NO:M201360220131124
【IPC分類】C12N9/30, C12N1/14, C12R1/885
【公開號】CN105524839
【申請?zhí)枴緾N201410514080
【發(fā)明人】李洪兵, 李海清, 張錦杰, 朱永明, 胡永明, 陳香
【申請人】湖南新鴻鷹生物工程有限公司
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2014年9月29日