一株高產(chǎn)耐高溫真菌α-淀粉酶的里氏木霉的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株高產(chǎn)耐高溫真菌α -淀粉酶的里氏木霉。
【背景技術(shù)】
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[0002]α-淀粉酶全稱為ct-l，4-葡聚糖水解酶(EC3.2.1.1)，作用于淀粉時(shí)，可從分子內(nèi)部切開(kāi)ct -1,4-糖苷鍵而生成糊精和還原糖，由于產(chǎn)物的末端葡萄糖殘基Cl碳原子為α-構(gòu)型，故得名為α-淀粉酶。
[0003]常見(jiàn)的Ct-淀粉酶有二種:細(xì)菌α-淀粉酶、真菌α -淀粉酶和麥芽α -淀粉酶。細(xì)菌Ct-淀粉酶是由細(xì)菌如枯草桿菌、地衣芽孢桿菌等產(chǎn)生的，細(xì)菌α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性較強(qiáng)。
[0004]真菌α -淀粉酶最早于1896年由日本的高峰讓吉從米曲霉中提取，并作為消化劑使用。50年代以來(lái)，真菌α-淀粉酶的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，開(kāi)始應(yīng)用于淀粉制糖、釀造、面包、果蔬飲料、醫(yī)藥和飼料等領(lǐng)域。用于淀粉制糖可以生產(chǎn)出以麥芽三糖為主的新型糖漿；與葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶合用，可以制備異麥芽低聚糖；在傳統(tǒng)的飴糖、黃酒生產(chǎn)中使用此酶，可以簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，提高原料利用率，節(jié)省糧食，降低生產(chǎn)成本；用于面包制作可以縮短發(fā)酵周期，制成的面包氣孔分布均勻，體積大，保鮮期長(zhǎng)，還可替代以往常用的面包添加劑溴酸鉀；用于醫(yī)藥可作為消化劑，代替動(dòng)物中提取的酶；用于果蔬飲料可以消除渾濁，提高收率；用于飼料可以提高飼料利用率。因此，真菌α-淀粉酶的應(yīng)用具有廣闊的市場(chǎng)前景。
[0005]但真菌α -淀粉酶的最適作用溫度在55°C左右，當(dāng)溫度高于60°C便會(huì)逐漸失活，且熱穩(wěn)定相對(duì)較低，不適用于較高溫度的反應(yīng)過(guò)程，因此其應(yīng)用與發(fā)展受到一定程度的限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0006]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一株高產(chǎn)耐高溫真菌α-淀粉酶的里氏木霉。
[0007]本發(fā)明提供的高產(chǎn)耐高溫真菌α-淀粉酶的里氏木霉具體為里氏木霉901-18Trichoderma reesei901_18。該菌株已于2013年11月24日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC，地址為:中國(guó).武漢.武漢大學(xué))，保藏號(hào)CCTCC N0:M2013602o
[0008]所述菌株特點(diǎn)如下:
[0009]該菌株在PDA固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，形成的菌落特征為菌落呈棉絮狀，菌落呈淡綠色，菌落扁平，高0.2-0.8mm,菌落邊緣白色，整齊；生長(zhǎng)速度快，48h菌落直徑達(dá)
1.5-8.5mm, 72h達(dá)30_55mm ;菌絲白色，有隔膜，菌絲壁光滑，直徑在2_5 μ m。分生孢子梗從菌絲的短側(cè)枝發(fā)生，側(cè)枝上對(duì)生。
[0010]所述里氏木霉901_18Trichoderma reesei901_18由一株分離自津市市河堤食用菌培植基地土壤樣本的里氏木霉菌株經(jīng)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變篩選獲得，具體篩選步驟如下:
[0011](I)將出發(fā)菌株接種到馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上，連續(xù)傳代三次，活化菌種，加入無(wú)菌水振蕩洗下成熟的孢子，攪拌分散孢子得孢子懸浮液，將攪拌好的孢子懸浮液置于紫外燈下，垂直距離30cm攪拌照射200s，上述紫外照射都必須在避光的條件下進(jìn)行。
[0012]將經(jīng)過(guò)照射的懸液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板，并以未經(jīng)紫外照射的菌液稀釋涂平板做對(duì)照。將上述涂布均勻的平板，用黑色的布或報(bào)紙包好，置30°C培養(yǎng)48h，在長(zhǎng)出的菌落中篩選出水解圈最大者挑至斜面保存，純化后配制成菌懸液，經(jīng)梯度稀釋后與硫酸二乙酯原液充分混合，并于30°C震蕩處理40min，將處理過(guò)的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板。
[0013](2)高產(chǎn)菌種的初篩
[0014]將上述涂布均勻的平板，置30°C培養(yǎng)48h，篩出水解圈較大者挑至斜面保存，純化后獲得三株菌 901-11,901-15, 901-18。
[0015](3)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩
[0016]將獲得的三株菌901-11,901-15，901-18在含有30mL馬鈴薯液體培養(yǎng)基的250mL搖瓶中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，種子接種量10% (V/V)，300C、150r/min培養(yǎng)72h，離心取發(fā)酵上清液制得粗酶液。
[0017](4)酶活測(cè)定
[0018]酶活單位的定義:lmL粗酶液,于65°C、ρΗ5.5條件下，Imin液化Img可溶性淀粉，即為I個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。
[0019]經(jīng)測(cè)定,菌株901-18，為穩(wěn)定的最高產(chǎn)菌株。
[0020]培養(yǎng)特征:該菌株產(chǎn)真菌α -淀粉酶的最適pH3.0-6.5 ;最適溫度為27?30°C。
[0021]將所得的901-18菌株經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后可得耐高溫、熱穩(wěn)定性好且酶活高的真菌α-淀粉酶，具體如下:
[0022]采用變溫調(diào)節(jié)的方法生產(chǎn)真菌α -淀粉酶，其發(fā)酵罐培養(yǎng)階段包括如下步驟:
[0023]將種子液以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度27?30°C，攪拌速度120_180r/m，通風(fēng)量(V/V) 1:1-3，培養(yǎng)時(shí)間10-15h ;然后以l-2°c /h降溫速率緩慢降溫至10_15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至2-5°C，此時(shí)，將一級(jí)種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以1-2°C /h升溫速率緩慢升溫至10_15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至27?30°C，恒溫培養(yǎng)15_20h ；
[0024]補(bǔ)料控制:當(dāng)發(fā)酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時(shí),開(kāi)始添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料量以維持發(fā)酵液還原糖含量為2mg/ml-5mg/ml ；
[0025]放罐標(biāo)準(zhǔn):60-80 %菌體衰老自溶,酶活力增長(zhǎng)緩慢。
[0026]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50_150g，玉米粉50_60g，豆餅粉15_25g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米漿l_5g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，檸檬酸鈉 l-5g,消泡劑 0.Ι-lg,純凈水 100mL, pH 值 5-6.5，121。。滅菌 20min ；
[0027]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15-25 %，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH值5-6.5，121-123°C滅菌30_40min。
[0028]發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾、濃縮、調(diào)配、精濾、干燥得真菌α -淀粉酶，其酶學(xué)性質(zhì)如下:
[0029](I)該酶溫度適用范圍較寬，為50_75°C之間，最適作用溫度在65°C，70°C下保存3h仍具有80%以上酶活。
[0030](2)該酶最適反應(yīng)pH值為5.5，在pH值4.5-7.0之間酶活保持在70%以上。
[0031](3)酶活:由本發(fā)明所提供的突變株901-18制備的耐高溫ct-淀粉酶酶活力可達(dá)12000-15000U/ml，相較出發(fā)菌株酶活提高3.6倍。
[0032]有益效果:
[0033]1、本發(fā)明使用紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變的方法獲得了一株高產(chǎn)真菌α -淀粉酶的里氏木霉菌株，該菌株變溫發(fā)酵生產(chǎn)條件下所產(chǎn)酶具有耐高溫、熱穩(wěn)定性好，活力高的特點(diǎn)。
[0034]2、有該菌株生產(chǎn)所得的耐高溫真菌α -淀粉酶酶活力高達(dá)12000-15000U/ml，是原始菌株的3.6倍；該酶溫度適應(yīng)范圍較寬，在50-75°C之間，耐溫度高，特別適合反應(yīng)溫度高、液化工藝與糖化工藝并存的工業(yè)化需求。
【具體實(shí)施方式】
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[0035]下面通過(guò)具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說(shuō)明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書(shū)所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0036]實(shí)施例1:紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變篩選
[0037](I)孢子懸液的制備
[0038]將活化后的出發(fā)菌株斜面中加入1mL無(wú)菌水，充分震蕩制成孢子懸液。
[0039](2)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變
[0040]將3mL孢子懸液置于無(wú)菌平板中，在距離為30cm，功率15w的紫外燈下攪拌照射200s。將經(jīng)過(guò)照射的孢子懸液經(jīng)梯度稀釋后(11-1O5)涂布于氯化鋰平板，并以未經(jīng)紫外照射的孢子懸液稀釋涂平板做對(duì)照。將上述涂布均勻的平板，用黑色的布或報(bào)紙包好，置30°C培