專利名稱：一種白腐真菌的產(chǎn)酶方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專利涉及一種白腐真菌持續(xù)高效產(chǎn)酶方法，屬于環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域，能夠應(yīng)用在難降解有機(jī)廢水處理及環(huán)境修復(fù)中。

背景技術(shù)：
包括染料化工廢水在內(nèi)的難降解有機(jī)工業(yè)廢水具有色度高、鹽度高、毒性強(qiáng)、污染物含量高且成分復(fù)雜、難以降解等特點(diǎn)，是工業(yè)廢水污染治理的重點(diǎn)和難點(diǎn)，這些工業(yè)廢水如不妥善處理而排放到環(huán)境中以后，將造成嚴(yán)重的生態(tài)破壞和人類健康問題。
白腐真菌在木質(zhì)素降解酶催化作用下通過自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)染料廢水中各種有機(jī)污染物等具有廣譜、高效的降解功能。白腐真菌分泌的木質(zhì)素降解酶主要有木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)、錳過氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac)，它們是難降解有機(jī)工業(yè)廢水快速、高效處理的功能核心。如何實(shí)現(xiàn)白腐真菌木質(zhì)素降解酶的持續(xù)高效產(chǎn)出，是白腐真菌環(huán)境生物技術(shù)的工程化應(yīng)用中急需解決的問題，對(duì)建設(shè)大規(guī)模酶反應(yīng)器處理系統(tǒng)、降低工業(yè)廢水處理的運(yùn)行費(fèi)用具有重大意義。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明專利提供一種白腐真菌持續(xù)高效產(chǎn)酶的方法。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明所述的白腐真菌持續(xù)高效產(chǎn)酶方法包括保證持續(xù)產(chǎn)酶和降低產(chǎn)酶成本的玉米芯填料、孢子液制備和發(fā)酵參數(shù)控制方法。
本發(fā)明的主要內(nèi)容為利用玉米芯作為白腐真菌的生長(zhǎng)載體和補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，利用氣升式發(fā)酵設(shè)備并優(yōu)化發(fā)酵條件，實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶的持續(xù)高效產(chǎn)出，同時(shí)降低產(chǎn)酶成本。具體包括以下步驟 (1)玉米芯的前處理將玉米芯處理成尺寸為0.5cm×0.5cm×0.5cm的立方體，在115℃、0.1Mpa下滅菌15分鐘，放至于無(wú)菌室內(nèi)冷卻，后于無(wú)菌室內(nèi)將其放至裝有限氮培養(yǎng)基的搖瓶中，使每個(gè)搖瓶中玉米芯載體的數(shù)量保持在10個(gè)/100ml； (2)白腐真菌孢子液配制平板內(nèi)注入無(wú)菌水，加入白腐真菌孢子粉，經(jīng)過4層擦鏡紙過濾，濾去菌絲體，得白腐真菌孢子液； (3)將玉米芯載體和白腐真菌孢子液通入發(fā)酵罐，發(fā)酵罐內(nèi)溫度保持在37℃，進(jìn)氣量為1.0vvm，往發(fā)酵罐內(nèi)加入限氮培養(yǎng)基，實(shí)現(xiàn)白腐真菌的產(chǎn)酶方法。
本發(fā)明提供的白腐真菌的產(chǎn)酶方法，其中限氮培養(yǎng)基成分為(L-1)葡萄糖10g，酒石酸銨0.2g，苯甲醇0.54g，KH2PO4 2.56g，MgSO4·7H2O0.71g，維生素B10.001g，微量元素液70mL，10mmol/L醋酸緩沖液調(diào)節(jié)pH至4.5；其中微量元素液(L-1)的成分為氨基乙酸0.6g，MnSO4·H2O 0.5g，NaCl 1g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1g，CoCl2·H2O 0.19g，CaCl2·2H2O 1.56g，ZnSO4·7H2O 0.1g，CuSO4·5H2O 0.1g，KAl(SO4)2·12H2O 0.01g，HBO3 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.01g。
本發(fā)明專利的顯著效果為(1)木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶的持續(xù)高效產(chǎn)出；(2)產(chǎn)酶成本下降。

具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明 (1)玉米芯的前處理、尺寸、投料量和投加時(shí)間將玉米芯先用清水洗凈，后處理成尺寸為0.5cm×0.5cm×0.5cm的立方體，將其在115℃、0.1Mpa下滅菌15分鐘，放至于無(wú)菌室內(nèi)讓其冷卻，后于無(wú)菌室內(nèi)將其放至裝有限氮培養(yǎng)基的搖瓶中，使每個(gè)搖瓶中玉米芯載體的數(shù)量保持在10個(gè)/100ml。
(2)白腐真菌孢子液配制平板內(nèi)注入少量無(wú)菌水(實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌水將100mL水加入200mL或250mL三角瓶中，加棉塞，包扎，121℃、0.1Mpa下滅菌30分鐘)，以推棒刮下孢子粉，經(jīng)過4層擦鏡紙過濾，濾去菌絲體。所得濾出液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
菌體計(jì)數(shù)步驟1)取清潔干燥的血球計(jì)數(shù)扳，在計(jì)數(shù)室上面加蓋玻片。2)取菌液搖勻，用滴管由蓋玻片邊緣滴一小滴，則菌液自行滲入，計(jì)數(shù)室不得有氣泡。3)樣品濃度要求每小格有5-10個(gè)菌體為宜。4)計(jì)數(shù)時(shí)，按對(duì)角線取左上、左下、右上、右下及中央方格(即80小格)。5)每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)2-3次，取平均數(shù)，按公式計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)/(mL)＝(80小格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)/80)×400×10000×稀釋倍數(shù)。發(fā)酵參數(shù)的控制通過調(diào)節(jié)溫度控制閥，使發(fā)酵罐內(nèi)溫度保持在37℃；通過調(diào)節(jié)進(jìn)氣閥門，使進(jìn)氣量為1.0vvm；通過前期檢測(cè)到的酶活變化曲線定期往發(fā)酵罐內(nèi)加入一定的限氮培養(yǎng)基，使黃孢原毛平革菌在發(fā)酵罐內(nèi)能持續(xù)高效的產(chǎn)酶。
蒸汽進(jìn)入發(fā)酵罐進(jìn)行加熱和消毒；使發(fā)酵罐溫度維持在115℃，罐壓維持在0.1Mpa，保溫15分鐘；停止蒸汽進(jìn)入，發(fā)酵罐自然冷卻至38℃；將無(wú)菌空氣通入發(fā)酵罐以提供發(fā)酵所需的氧氣；加入限氮培養(yǎng)基15L至發(fā)酵罐中。將白腐真菌孢子和玉米芯填料放入發(fā)酵罐；發(fā)酵過程中需要檢測(cè)酶活和總糖含量及其變化規(guī)律；當(dāng)發(fā)酵液中酶活達(dá)到峰值時(shí)，可以排出粗酶液，或經(jīng)提純制成酶制劑產(chǎn)品。培養(yǎng)液采用限氮培養(yǎng)基，其成分為(L-1)葡萄糖10g，酒石酸銨0.2g，苯甲醇0.54g，KH2PO4 2.56g，MgSO4·7H2O 0.71g，維生素B1 0.001g，微量元素液70mL，10mmol/L醋酸緩沖液調(diào)節(jié)pH至4.5。其中微量元素液(L-1)的成分為氨基乙酸0.6g，MnSO4·H2O 0.5g，NaCl 1g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1g，CoCl2·H2O 0.19g，CaCl2·2H2O 1.56g，ZnSO4·7H2O0.1g，CuSO4·5H2O 0.1g，KAl(SO4)2·12H2O 0.01g，HBO3 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.01g。
權(quán)利要求
1、一種白腐真菌的產(chǎn)酶方法，以玉米芯作為菌體的生長(zhǎng)載體和產(chǎn)酶的補(bǔ)充基質(zhì)，其特征在于
(1)玉米芯的前處理將玉米芯處理成尺寸為0.5cm×0.5cm×0.5cm的立方體，在115℃、0.1Mpa下滅菌15分鐘，放至于無(wú)菌室內(nèi)冷卻，后于無(wú)菌室內(nèi)將其放至裝有限氮培養(yǎng)基的搖瓶中，使每個(gè)搖瓶中玉米芯載體的數(shù)量保持在10個(gè)/100ml；
(2)白腐真菌孢子液配制平板內(nèi)注入無(wú)菌水，加入白腐真菌孢子粉，經(jīng)過4層擦鏡紙過濾，濾去菌絲體，得白腐真菌孢子液；
(3)將玉米芯載體和白腐真菌孢子液通入發(fā)酵罐，發(fā)酵罐內(nèi)溫度保持在37℃，進(jìn)氣量為1.0vvm，往發(fā)酵罐內(nèi)加入限氮培養(yǎng)基，實(shí)現(xiàn)白腐真菌的產(chǎn)酶方法。
2.如權(quán)利要求1所述的白腐真菌的產(chǎn)酶方法，其特征在于限氮培養(yǎng)基成分為(L-1)葡萄糖10g，酒石酸銨0.2g，苯甲醇0.54g，KH2PO4 2.56g，MgSO4·7H2O 0.71g，維生素B1 0.001g，微量元素液70mL，10mmol/L醋酸緩沖液調(diào)節(jié)pH至4.5；其中微量元素液(L-1)的成分為氨基乙酸0.6g，MnSO4·H2O 0.5g，NaCl 1g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1g，CoCl2·H2O0.19g，CaCl2·2H2O 1.56g，ZnSO4·7H2O 0.1g，CuSO4·5H2O 0.1g，KAl(SO4)2·12H2O 0.01g，HBO3 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.01g。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種白腐真菌持續(xù)高效產(chǎn)酶方法，屬于環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域，能夠應(yīng)用在難降解有機(jī)廢水處理及環(huán)境修復(fù)中。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明所述的白腐真菌持續(xù)高效產(chǎn)酶方法利用玉米芯作為白腐真菌的生長(zhǎng)載體和補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，利用氣升式發(fā)酵設(shè)備并優(yōu)化發(fā)酵條件，實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶的持續(xù)高效產(chǎn)出，同時(shí)降低產(chǎn)酶成本。
文檔編號(hào)C02F3/00GK101260389SQ200810036038
公開日2008年9月10日 申請(qǐng)日期2008年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月15日
發(fā)明者黃民生, 尚 高, 芳 陶 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)