耐高溫異淀粉酶基因的克隆、表達(dá)及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程和生物能源技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種耐高溫異淀粉酶基因克隆、表達(dá)及在酶生物燃料電池中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]生物燃料電池是以有機(jī)物為原料，利用細(xì)胞或酶將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為電能的一類綠色燃料電池。根據(jù)催化劑種類可分:微生物燃料電池和酶生物燃料電池，它們具有能量轉(zhuǎn)化效率高、生物相容性好、原料來(lái)源廣泛、成本低廉且環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)療、電子、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域均有重要的使用價(jià)值。但目前大部分的生物燃料電池輸出功率密度較低，極大限制了在生產(chǎn)中的應(yīng)用。微生物燃料電池由于對(duì)電子屏蔽作用明顯和較多副反應(yīng)導(dǎo)致對(duì)燃料使用效率較低，而酶生物燃料由于催化劑濃度較高并且沒(méi)有傳質(zhì)壁皇，因此有可能產(chǎn)生更高的輸出功率，在室溫和中性溶液中工作，滿足一些微型電子設(shè)備或生物傳感器的需求。另外，與甲醇燃料電池相比，糖分(淀粉或葡萄糖)驅(qū)動(dòng)的酶燃料電池因原料成本低廉，生物可降解性更強(qiáng)，更綠色環(huán)保而獲得研宄者青睞。最新研宄表明:在不消耗ATP前提下，通過(guò)人工合成的多酶催化途徑，可以實(shí)現(xiàn)淀粉水解為葡萄糖和葡萄糖徹底氧化偶聯(lián)技術(shù)，這有力推動(dòng)了高能量密度的酶燃料電池的發(fā)展，為淀粉類原料在酶燃料電池中的應(yīng)用提供了很大可能性。但針對(duì)淀粉類原料中的支鏈淀粉和麥芽糖糊精，由于存在大量糖苷鍵分支位點(diǎn)(如圖1所示)，在α-葡聚糖磷酸化酶作用下，水解為葡萄糖-1-磷酸效率偏低，造成能源浪費(fèi)和酶燃料電池能量密度的降低。針對(duì)支鏈淀粉和麥芽糖糊精，異淀粉酶或普魯蘭酶可以將支鏈淀粉和麥芽糖糊精中的α -1，6糖苷鍵水解，切下整個(gè)側(cè)枝，形成直鏈淀粉，極大提高了α -葡聚糖磷酸化酶水解支鏈淀粉的能力。但是，目前已發(fā)現(xiàn)的普魯蘭酶或異淀粉酶都存在穩(wěn)定性差，不耐熱等問(wèn)題，限制了此類酶在工業(yè)中的應(yīng)用。所以，耐高溫異淀粉酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用對(duì)提高新型淀粉燃料電池作用至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明主要目的是提供一種耐高溫異淀粉酶基因序列，同時(shí)提供該序列所表達(dá)蛋白的制備方法及該蛋白在酶生物燃料電池中的應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。
[0005]一種耐高溫異淀粉酶基因，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示，全長(zhǎng)2151bp，該基因從 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)中的tokodaii基因組中篩選獲得，其代碼為:0RF ST0928。
[0006]所述耐高溫異淀粉酶基因所編碼耐高溫異淀粉酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，包括716個(gè)氨基酸，分子量為83.lKDa，其中編碼序列17~108氨基酸為第48家族的碳水化合物結(jié)合模序(CBM);編碼序列204~545氨基酸為淀粉酶催化結(jié)構(gòu)域；編碼序列546-716為未知功能多肽；該酶在本發(fā)明申請(qǐng)之前被推定為一種糖原脫枝酶，本申請(qǐng)則經(jīng)過(guò)驗(yàn)證證明其為耐高溫異淀粉酶。
[0007]所述耐高溫異淀粉酶的制備方法，包括以下步驟:
(1)基因克隆，通過(guò)設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增或人工合成方法得到包含異淀粉酶基因全長(zhǎng)序列；
設(shè)計(jì)引物序列設(shè)計(jì)如下:
IF:5’ ACTTT AAGAA GGAGA TATAC ATatg gtttt ttcac acaag gatag accat 3’，
IR:5’ TCAGT GGTGG TGGTG GTGGT Gatat tcaat cctcc tatat accat tgcgg 3’ ；
VF:5’ ccgca atggt atata ggagg attga atatC ACCAC CACCA CCACC ACTGA 3、
VR:5，atggt ctatc cttgt gtgaa aaaac catAT GTATA TCTCC TTCTT AAAGT 3，0
[0008]其中其中IF和IR的5’端大寫(xiě)堿基屬于pET20b (+)載體上的序列，3’端小寫(xiě)堿基屬于插入基因ORF ST0928上序列；VF和VR的5’端小寫(xiě)堿基屬于插入基因ORF ST0928上序列，3’端大寫(xiě)堿基屬于pET20b (+)載體上序列，IF與VR反向互補(bǔ)，IR與VF反向互補(bǔ)；
(2)載體構(gòu)建，分別以異淀粉酶基因和市售載體上的序列為模板，采用文獻(xiàn)You等(DNACloning and Assembly Methods, Humana Press，2014，183-192)提供的簡(jiǎn)單克隆方法，進(jìn)行重疊延伸PCR得到重組表達(dá)質(zhì)粒；
(3)異淀粉酶表達(dá)與純化，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入萬(wàn).coliRosetta (DE3)中，挑選陽(yáng)性重組子培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收獲細(xì)胞，超聲破碎后，使用鎳柱將帶有His標(biāo)簽的異淀粉酶純化出來(lái)。
[0009]所述耐高溫異淀粉酶，最適反應(yīng)條件為:以500 μ L反應(yīng)體系為例，含40 mM乙酸緩沖液(pH 5.5)，添加有0.5 mM MgCl2,85°C催化反應(yīng)。
[0010]所述耐高溫異淀粉酶可用于酶生物燃料電池中，所述酶生物燃料電池為單極室無(wú)隔膜類型，結(jié)構(gòu)包括:反應(yīng)容器、離子交換膜和反應(yīng)物；
所述反應(yīng)物包括:淀粉、耐高溫異淀粉酶、α-葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖變位酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、二氫硫辛酸脫氫酶、HEPES緩沖液、NaCl、NAD+、Mg2+、Mn2+和電子穿梭體(AQDS)；
具體為:淀粉、0.012%耐高溫異淀粉酶(質(zhì)量體積比)、7U α -葡聚糖磷酸化酶(a GP)、3U磷酸葡萄糖變位酶(PGM)、1.5U 6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)、5.4 U 二氫硫辛酸脫氫酶(DI)、50 mM pH 7.2 的HEPES緩沖液、0.3 M NaCl,4 mM NAD+,5 mM Mg2+、0.25 mM Mn2+、1.7 mM電子穿梭體(AQDS)。
[0011]發(fā)明人從KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)于最適生長(zhǎng)溫度在80°C的耐高溫古生菌Sulfolobus的基因組進(jìn)行篩選后發(fā)現(xiàn)，其開(kāi)放閱讀框ORF ST0928序列，理論推測(cè)其具有糖原脫枝酶活性，但目前還沒(méi)有任何相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)其生化性質(zhì)進(jìn)行過(guò)詳細(xì)描述。發(fā)明人采用基因工程方法，通過(guò)將ORF ST0928序列進(jìn)一步轉(zhuǎn)化整合進(jìn)入大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，得到一種新的耐高溫異淀粉酶重組蛋白，檢測(cè)結(jié)果表明，該耐高溫異淀粉酶熱穩(wěn)定性優(yōu)良，在90°C條件下半衰期可達(dá)200min，用于糖燃料電池時(shí)，有望取得優(yōu)良效果。具體而言，該耐高溫異淀粉酶的優(yōu)勢(shì)在于:(I) ORF ST0928基因編碼的異淀粉酶耐高溫、酶活力穩(wěn)定，具有很強(qiáng)工業(yè)應(yīng)用潛力；(2)該耐高溫異淀粉酶用于糖燃料電池時(shí)，可使淀粉類物質(zhì)徹底水解為葡萄糖，從而提高能量轉(zhuǎn)化效率，拓展生物燃料電池的應(yīng)用范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為異淀粉酶作用原理圖；
圖2為表達(dá)載體pET20b-StIA構(gòu)建圖；
圖3為目的蛋白即耐高溫異淀粉酶電泳檢測(cè)結(jié)果；
圖4為糖燃料電池構(gòu)造原理圖，其中#1為異淀粉酶；#2為α -葡聚糖磷酸化酶;#3為磷酸葡萄糖變位酶；#4為6-磷酸葡萄糖脫氫酶；#5為二氫硫辛酸脫氫酶；AQDS為電子穿梭體；
圖5為糖燃料電池實(shí)物圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋說(shuō)明。
[0014]實(shí)施例1
本發(fā)明所提供的耐高溫異淀粉酶基因，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示，全長(zhǎng)2151bp，該基因從 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)中的 SwJ/bJo/ws?ο左ο?/aii基因組中篩選獲得，其代碼為:0RF ST0928。
[0015]所述耐高溫異淀粉酶基因所編碼耐高溫異淀粉酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，包括716個(gè)氨基酸，分子量為83.lKDa，其中編碼序列17~108氨基酸為第48家族的碳水化合物結(jié)合模序(CBM);編碼序列204~545氨基酸為淀粉酶催化結(jié)構(gòu)域；編碼序列546-716為未知功能多肽；該酶在本發(fā)明申請(qǐng)之前被推定為一種糖原脫枝酶，本申請(qǐng)則經(jīng)過(guò)驗(yàn)證證明其為耐高溫異淀粉酶。
[0016]所述耐高溫異淀粉酶的制備方法，包括以下步驟:
(I)基因克隆，通過(guò)設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增或人工合成方法得到包含異淀粉酶基因全長(zhǎng)序列；具體步驟如下:
A.設(shè)計(jì)引物，以KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)公布的11i/aii基因組中的序列片段ORFST0928和市售pET20b (+)載體為模板，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物如下:
IF:5’ ACTTT AAGAA GGAGA TATAC ATatg gtttt ttcac acaag gatag accat 3，，
IR:5’ TCAGT GGTGG TGGTG GTGGT Gatat tcaat cctcc tatat accat tgcgg 3’ ；
VF:5’ ccgca atggt atata ggagg attga atatC ACCAC CACCA CCACC ACTGA 3、
VR:5，atggt ctatc cttgt gtgaa aaaac catAT GTATA TCTCC TTCTT AAAGT 3，0
[0017]其中其中IF和IR的5’端大寫(xiě)堿基屬于pET20b (+)載體上的序列，3’端小寫(xiě)堿基屬于插入基因ORF ST0928上序列；VF和VR的5’端小寫(xiě)堿基屬于插入基因ORF ST0928上序列，3’端大寫(xiě)堿基屬于pET20b (+)載體上序列，IF與VR反向互補(bǔ)，IR與VF反向互補(bǔ)。
[0018]B.\>丄Sulfolobus 1Aot/aii基因組為模板，步驟A所設(shè)計(jì)IR、IF序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，
反應(yīng)體系為:高保真DNA聚合酶(按說(shuō)明書(shū)用量，0.02U/yL) ;dNTP各200 μ Μ;引物各0.5 μ M ;模板 0.05ng/ μ L0
[0019]擴(kuò)增條件為:98°C預(yù)變性30s，25個(gè)循環(huán)(98°C變性10 s，60°C退火10 s，72°C延伸)，最后一步72°C延伸10 min。
[0020]取3 μ L擴(kuò)增產(chǎn)物使用0.8%的瓊脂糖凝膠純化，純化產(chǎn)物送華大基因進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所得基因序列與SEQ ID N0.1所示核苷酸序列相同，即ORFST0928 序列。
[0021]用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)回收產(chǎn)物用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行含量測(cè)定，備用。
[0022](2)載體構(gòu)建，構(gòu)建過(guò)程參考圖2所示，分別以異淀粉酶基因和市售pET20b (+)載體上的序列為模板，米用文獻(xiàn)You等(DNA Cloning and Assembly Methods,Humana Press，2014，183-192)提供的簡(jiǎn)單克隆方法，進(jìn)行重疊延伸PCR得到重組表達(dá)質(zhì)粒；具體步驟如下:
C.以市售pET20b (+)載體為模板，步驟A所設(shè)計(jì)VR、VF序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，
反應(yīng)體系:高保真DNA聚合酶(按說(shuō)明書(shū)用量，0.02U/μ L) ;dNTP各200 μΜ;引物各0.5“]?;模板0.05叩/^1^1\6〇 buffer ο
[0023]擴(kuò)增條件為:98°C預(yù)變性30s，30個(gè)循環(huán)(98°C變性15 s，55°C退火15 s，72°C延伸 3kb/min)，最后一步 72°C延伸 5 min。
[0024]擴(kuò)增產(chǎn)物純化、測(cè)序，得到如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，即ORF ST0928序列，使用PCR產(chǎn)物回收試劑盒進(jìn)行回收，最后使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行含量測(cè)定，備用。
[0025]D.重疊延伸PCR得到重組表達(dá)質(zhì)粒，
具體為，按照文獻(xiàn)You et al.2014提供的方法，將步驟(I)中PCR擴(kuò)增回收得到的ORFST0928序列產(chǎn)物與步驟C中PCR擴(kuò)增回收產(chǎn)物混合，進(jìn)行重疊延伸PCR。
[0026]混合反應(yīng)體系設(shè)置如下:5倍的GC緩沖液，10 μ L ；dNTP (各10 μ M)，I μ L ；DNA載體片段(步驟C所回收產(chǎn)物)，4 ng/yL (16 μ L);插入片段(步驟I所回收產(chǎn)物)，4 ng/μ L(5 μ L);水添加到49.5 μ L，高保真DNA聚合酶，0.5 μ L (1.0單位/50 μ L)。
[0027]反應(yīng)條件為:98