一種海藻酸鈉免疫磁珠及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于納米磁性材料領域和生物學領域，涉及一種納米磁性顆粒，具體為一種海藻酸鈉免疫磁珠及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]免疫微球技術(Immunomicrospheres)是以免疫學為基礎利用包被有免疫活性物質(zhì)的各種微球進行免疫學或其他生物學分析分離等方面應用的一項技術。自1956年Singer將人IgG吸附存聚苯乙烯膠乳顆粒上，首次建立檢測類風濕因子的膠乳凝集試驗以來，免疫微球技術就以其簡便，高效，實用的特點，在免疫學，微生物學，生物化學，分子遺傳學及分子生物學等各個領域嶄露頭角。
[0003]免疫磁性微球(Immunomagnetic Microspheres, IMMS)或叫做免疫磁性微珠簡稱免疫磁珠，作為新型的功能材料近年來已被廣泛研宄，其在生物醫(yī)學及臨床診斷等領域的應用引起了各國研宄者的高度重視。免疫磁性微球是免疫微球的一種，是指連有抗體或抗原的磁性微球，它通過表面的抗體或抗原特異地與靶物質(zhì)結(jié)合，從而賦予其磁響應性，在特定磁場的作用下，通過免疫磁性微球可以發(fā)生定向移動，從而實現(xiàn)其免疫學檢測，分離純化，藥物導向等方面的目的。理想的免疫磁性微球應具有靈敏性高，特異性強，重復性好以及分離檢測速度快等優(yōu)點。
[0004]免疫磁性微球是磁性微球與抗體或抗原結(jié)合的產(chǎn)物。磁性微球的范圍廣泛，包括常用的磁性高分子微球、磁性脂質(zhì)體、磁性膠束等；而磁性脂質(zhì)微球是通過適當?shù)姆椒ㄊ怪|(zhì)體與無機物結(jié)合起來形成具有一定磁性及特殊結(jié)構(gòu)的微球，其表面可比較容易的賦予多種反應性功能基團，如-0H，-COOH和-順2等，使其具有良好的生物相容性，通過與生物活性物質(zhì)中的配基偶聯(lián)，能夠識別并結(jié)合相應的抗原、抗體或核酸等，然后可在外加磁場中進行分離富集。因此，磁性脂質(zhì)微球(劉信等，磁性脂質(zhì)體的制備及應用)在細胞分離、固定化酶、靶向藥物和免疫檢測等生物學領域有著廣泛的應用前景。
[0005]但是，目前存在的免疫磁性海藻酸鈉微球還存在許多問題。首先，免疫磁性海藻酸鈉微球中抗體接枝率較低、活性較難維持。主要原因為，利用磁性海藻酸鈉微球表面存在的活性基團進行改性，溫度較高，時間較長，容易降低抗體的活性。再次，所制備的免疫磁性海藻酸鈉微球普遍穩(wěn)定性不足，容易發(fā)生團聚；樣品存放半年后，均容易發(fā)生結(jié)塊。如，博士論文(華中科技大學，李青，2007年)中的免疫磁性海藻酸鈉微球使用的是反相微乳-包埋的方法，所用的材料包含磁粉，海藻酸鈉和表面活性劑琥鉑酸二異辛脂磺酸鈉。本發(fā)明中免疫磁性海藻酸鈉微球與現(xiàn)有技術具有本質(zhì)的區(qū)別，具體如下:
(1)成分不同，本發(fā)明免疫磁性微球含有Fe3O4超順磁性納米顆粒，海藻酸鈉，脂質(zhì)體成分(卵磷脂、膽固醇、羧甲基殼聚糖十八烷基季銨鹽、DSPE-PEG-抗體)；
(2)制備方法不同，本發(fā)明主要采用脂質(zhì)體的薄膜分散法制備；
(2)免疫微球的種類不同，本發(fā)明的免疫微球?qū)儆谥|(zhì)體類的納米微球，海藻酸鈉和羧甲基殼聚糖十八烷基季銨鹽的加入可提高脂質(zhì)體微球的穩(wěn)定性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供了一種海藻酸鈉免疫磁珠及其制備方法和應用。本發(fā)明的技術方案如下:
一種海藻酸鈉免疫磁珠，核殼型結(jié)構(gòu)，內(nèi)核為磁性材料Fe3O4，中間層為脂質(zhì)體和海藻酸鈉的混合材料，最外層為包被在中間層上的抗體。
[0007]海藻酸鈉免疫磁珠各層的組成比例如下:
海藻酸鈉:質(zhì)量含量為0.0%-50.0% ；
脂質(zhì)體:質(zhì)量含量為0.0%-50.0% ；
磁性材料:質(zhì)量含量為0.0%-50.0% ；
抗體:質(zhì)量含量為0.0%-30.0%。
[0008]所述磁珠的粒徑為10nm-10000nm。
[0009]所述抗體為單克隆抗體。
[0010]所述海藻酸鈉免疫磁珠的成分包括海藻酸鈉、卵磷脂、膽固醇和磁性納米顆粒；其中，海藻酸鈉的質(zhì)量含量為10.0%-60.0%，卵磷脂的質(zhì)量含量為10.0%-30.0%，膽固醇的質(zhì)量含量為5.0%-30.0%，磁性納米顆粒為5.0%-30.0%。
[0011]本發(fā)明海藻酸鈉免疫磁珠的制備方法，包括以下步驟:
(I)使用海藻酸鈉與抗體反應制備抗體前體物海藻酸鈉-抗體。
[0012](2)用薄膜分散法制備海藻酸鈉磁性脂質(zhì)體:具體為將卵磷脂、膽固醇和油溶性磁性納米顆?；旌先苡谟拖嗦确轮?，孵育20-60分鐘，放入茄形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成脂質(zhì)膜；
(3)將形成的脂質(zhì)膜與含有海藻酸鈉和抗體前體物海藻酸鈉-抗體的水溶液混合水化，并超聲，即可得海藻酸鈉免疫磁珠。
[0013]上述步驟(I)中將含有海藻酸鈉的水溶液與單克隆抗體混合，加入縮合劑反應
0.5至48小時，透析除去未反應的縮合劑；所述海藻酸鈉與縮合劑的質(zhì)量比為1-5:1-20 ；所述的海藻酸鈉與抗體混合的質(zhì)量比為100:1-20;所述縮合劑選自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N, N’-羰基二咪唑、二環(huán)己基碳二亞胺、4-二甲氨基吡啶、N-羥基琥珀酰亞胺中的一種或兩種。
[0014]本發(fā)明將磁性脂質(zhì)體與海藻酸鈉復合制備免疫磁珠的中間層，海藻酸鈉的加入可提高磁性脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，同時可提供反應的官能團羧基；在海藻酸鈉免疫磁珠免疫磁珠的抗體修飾過程中，采用先制備抗體前體物海藻酸鈉一抗體，再與脂質(zhì)成分復合的方法，前體物的使用可較高的維持抗體的活性。
[0015]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下有益效果:
本發(fā)明海藻酸鈉免疫磁珠具有很好的生物相容性，通過與生物活性物質(zhì)中的配基偶聯(lián)，能夠識別并結(jié)合相應的抗原、抗體或核酸等，在外加磁場中分離富集迅速，可用于生物材料檢測和分離純化，在細胞分離、固定化酶、靶向藥物和免疫檢測等生物學領域有著廣泛的應用前景。如制備的抗-EpCAM抗體修飾的海藻酸鈉免疫磁珠可進行外周血中腫瘤(乳腺癌)細胞的抓捕和富集，然后將富集的腫瘤細胞進行免疫染色分析計數(shù)，就可以指導臨床進行個體化用藥方案的評估。
【具體實施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0017]實施例1制備海藻酸鈉免疫磁珠
(I)將5.0mg海藻酸鈉與1.0mg抗-EpCAM單克隆抗體混合，加入濃度為2.0mg/mL的縮合劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽5.0mL中反應24小時，8000-10000分子量透析袋透析除去未反應的縮合劑；凍干后得抗