一種有效擴(kuò)增cik且提高其特異性殺瘤能力的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種有效擴(kuò)增CIK細(xì)胞且提高其特異性殺瘤 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是繼屯、血管疾病之后的危害人類(lèi)健康的第二號(hào)殺手，近年來(lái)，腫瘤的發(fā) 生率和死亡率呈逐年上升的趨勢(shì)，且腫瘤發(fā)病成年輕化趨勢(shì)。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)等 學(xué)科的快速發(fā)展，腫瘤的生物免疫治療已成為繼手術(shù)、放療、化療之后的第四種療法。其中， 腫瘤過(guò)繼性免疫細(xì)胞治療成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，其是指將人體外擴(kuò)增的具有抗腫瘤活性的 免疫細(xì)胞回輸至患者體內(nèi)，從而直接或間接激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答W殺傷腫瘤細(xì)胞的一種細(xì)胞 療法。它具有個(gè)體性、安全性、祀向性和高效性等優(yōu)勢(shì)。
[0003] 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞(Cytokine-Induced Killer cells，CIK)屬于腫瘤過(guò) 繼性免疫細(xì)胞治療中的一種，由美國(guó)斯坦福大學(xué)的Schmi化Wolf于1991年首次報(bào)道，他們 發(fā)現(xiàn)人外周血單個(gè)核細(xì)胞于多種細(xì)胞因子(如IFN-丫、抗CD3McAb、比-Ια和比-2)作用一段 時(shí)間后，被定向誘導(dǎo)并大量增殖成為可同時(shí)表達(dá)CD3和CD56兩種膜蛋白分子，且兼具有Τ 淋己細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和ΝΚ細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)的異質(zhì)細(xì)胞群。CIK細(xì)胞具有 體外增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣、不良反應(yīng)少、對(duì)多重耐藥腫瘤細(xì)胞同樣敏感、可提 高患者免疫功能等特點(diǎn)，是臨床應(yīng)用中的一類(lèi)較為理想的效應(yīng)細(xì)胞，被認(rèn)為是腫瘤過(guò)繼免 疫治療的希望。
[0004] 然而，此類(lèi)效應(yīng)細(xì)胞在人正常外周血中數(shù)量極少，僅占1 %~5%。目前，人們雖能 通過(guò)常規(guī)的CIK制備方法獲得一定數(shù)量的CIK細(xì)胞，但獲得的CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒性和增殖 倍數(shù)均不夠理想。由此可見(jiàn)，如何獲得數(shù)量足夠、細(xì)胞毒性強(qiáng)的效應(yīng)細(xì)胞是保證治療效果的 必備條件。此外，CIK細(xì)胞的一個(gè)特點(diǎn)是殺瘤譜廣，意味著它的特異性殺瘤能力較差，就某種 特定的腫瘤而言，如表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)陽(yáng)性腫瘤，如何提高其特異性殺傷EGFR陽(yáng)性 腫瘤細(xì)胞的能力是提升CIK細(xì)胞治療效果所不得不考慮的又一個(gè)現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。EGFR對(duì)腫瘤的 生長(zhǎng)、發(fā)展及腫瘤干細(xì)胞的維持都有著非常重要的作用，且在多種實(shí)體瘤中存在過(guò)表達(dá)或 異常表達(dá)，因此在本專(zhuān)利研究中可作為一個(gè)重要的祀標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的在于提供一種有效擴(kuò)增CIK且提高其特異性殺瘤能力的方法，解決 了目前獲得的CIK細(xì)胞的增殖倍數(shù)不夠理想;CIK誘導(dǎo)過(guò)程中需持續(xù)補(bǔ)充各種細(xì)胞因子，較 為繁瑣;CIK細(xì)胞廣譜殺瘤的特點(diǎn)所導(dǎo)致其特異性殺瘤能力弱等缺點(diǎn)。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 用Ficoll淋己細(xì)胞分離液分離獲得單個(gè)核細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)至Τ175培養(yǎng)瓶中，加入 CD3mAb、CD28mAb、IFN- 丫、比-2、IL-15，第4天補(bǔ)加 IL-巧日IL-15，第6天分瓶培養(yǎng)，第8、9天分 別將瓶中的細(xì)胞轉(zhuǎn)至1.化細(xì)胞培養(yǎng)袋內(nèi)，補(bǔ)加化-2和IL-15，第11天將細(xì)胞分袋培養(yǎng)，補(bǔ)加 比-2和化-15,繼續(xù)誘導(dǎo)擴(kuò)增，第15-21天內(nèi)收獲細(xì)胞。將收獲的細(xì)胞用一種抗EGFRX抗CDS 雙功能抗體常溫下解育30-40分鐘后，用生理鹽水洗涂后收集細(xì)胞，即可制成特異性殺傷 EGFR陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的CIK細(xì)胞制劑。
[0007]無(wú)菌采集健康人或患者外周血60ml，2小時(shí)內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室制備，在潔凈區(qū)進(jìn)行 PBMC的分離和CIK的體外培養(yǎng)。全血經(jīng)微生物免疫檢測(cè)合格后方可進(jìn)行后續(xù)分離培養(yǎng)操 作。
[000引 1.單核細(xì)胞(PBMC)分離 (a) 取500ul外周血用血細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)、活性檢測(cè)：將外周血與生理鹽水等體積混 合，之后加入40ml Ficoll淋己細(xì)胞分離液離屯、分離單核細(xì)胞;離屯、參數(shù)：16(K)rpm、20攝 氏度、20分鐘； (b) 取白膜，加入生理鹽水至總體積80ml，離屯、洗涂?jī)纱?；離屯、參數(shù)：200化pm、20攝氏 度、8分鐘； (C)細(xì)胞用無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞 得率。
[0009] 2. CIK誘導(dǎo)培養(yǎng) (1)分離的PBMC計(jì)數(shù)后，按8-10 X105個(gè)/ml密度接種于T175培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加終濃度 400-600ng/ml CD3mAb、1400-1600 ng/ml CD28mAb、4000-4800IU/ml IFN-丫、4000-4800IU/ml a-2、140-160ng/ml 比-15,補(bǔ)充無(wú)血清培養(yǎng)基至50ml。
[0010] (2)第3天，細(xì)胞計(jì)數(shù)，加入600-1000IU/ml Ik2、20-30ng/ml比-15的新鮮培養(yǎng)液 50ml 〇
[0011] (3)第4天，細(xì)胞計(jì)數(shù)，加入600-1000IU/ml化-2、20-30ng/ml比-15的新鮮培養(yǎng)液 50ml 〇
[0012] (4)第6天分瓶培養(yǎng)，細(xì)胞計(jì)數(shù)，將原培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液混勻后按體積比1.4:1分 別轉(zhuǎn)移至兩新T175培養(yǎng)瓶中，分別標(biāo)記為a.b和c.d，兩瓶分別補(bǔ)加600-1000IU/ml IL-2、 20-30ng/ml比-15的新鮮培養(yǎng)液至240ml; 巧)第8天裝袋培養(yǎng)，細(xì)胞計(jì)數(shù)，將a. b培養(yǎng)瓶中細(xì)胞懸液裝入1.化細(xì)胞培養(yǎng)袋(袋a)中， 補(bǔ)加600-1000IU/ml a-2、20-30ng/ml比-15的新鮮培養(yǎng)液至終體積1000ml。
[0013] (6)第9天裝袋培養(yǎng)，細(xì)胞計(jì)數(shù)，將c.d培養(yǎng)瓶中細(xì)胞懸液裝入1.化細(xì)胞培養(yǎng)袋(袋 C)中，補(bǔ)加600-1000IU/ml a-2、20-30ng/ml比-15的新鮮培養(yǎng)液至終體積1000ml。
[0014] (7)第11天分袋培養(yǎng)，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將原培養(yǎng)袋(袋a和袋C)中的細(xì)胞懸液分別按 1.4:1比例分至兩新培養(yǎng)袋(袋b和袋d)中，四個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)袋分別補(bǔ)加600-1000IU/ml IL-2、 20-30ng/ml比-15的新鮮培養(yǎng)液至終體積1000ml。
[001引（8)第15、17、19、21天，細(xì)胞計(jì)數(shù)，檢測(cè)細(xì)胞活性，收獲細(xì)胞(袋3、袋6、袋(3、袋(1)。所 收獲的細(xì)胞分別用抗EGFRX抗CD3雙功能抗體在常溫下解育30-40分鐘后，用生理鹽水洗涂 細(xì)胞備用。
[0016] 3. CIK細(xì)胞對(duì)EGFR陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的體外殺傷率 (1)將抗EGFR X抗CD3雙功能抗體處理組與未處理組CIK細(xì)胞與祀細(xì)胞，按5:1、10:1、 20:1、比例加入96孔培養(yǎng)板，同時(shí)設(shè)效應(yīng)細(xì)胞組、祀細(xì)胞組和空白組，每組設(shè)3個(gè)平行孔，置 于37°C，5% C〇2,培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0017] (2)2化后，每孔取出10化1上清，再加入10μ1 CCK8,繼續(xù)解育4-化。
[001引（3)在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇450nm波長(zhǎng)測(cè)各孔0D值。
[0019] (4)平行孔平均0D值計(jì)算結(jié)果： 殺傷活性（％ ) = 1 -(實(shí)驗(yàn)組0D值一效應(yīng)組0D值/祀細(xì)胞組0D值）X 100 %。
[0020] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于： 現(xiàn)有技術(shù)缺陷:最終獲得的CIK細(xì)胞的增殖倍數(shù)不夠理想;CIK誘導(dǎo)過(guò)程中需持續(xù)補(bǔ)充 各種細(xì)胞因子，較為繁瑣;其殺瘤譜廣的特點(diǎn)必然導(dǎo)致其缺乏特異性殺瘤的能力(針對(duì)特定 腫瘤的殺傷能力較差）。
[0021 ] 本發(fā)明在傳統(tǒng)CIK誘導(dǎo)培養(yǎng)液中新增添IL-15及CD28mAb兩種因子（CD3mAb在 CD28mAb的協(xié)同作用下，其刺激活性明顯提高。比-2在IL-15的協(xié)同作用下，其刺激活性也 可明顯提高。），且在培養(yǎng)工藝上設(shè)計(jì)分瓶、轉(zhuǎn)袋、分袋等步驟，高效擴(kuò)增CIK細(xì)胞數(shù)。
[0022] 本發(fā)明在分離獲得單個(gè)核細(xì)胞后，一次性補(bǔ)加 CD3單克隆抗體(CD3mAb)、CD28單 克隆抗體(CD28mAb)、干擾素-丫（IFN-丫）、白介素-2(比-2)、白介素-15 (比-15)，后續(xù)培養(yǎng) 過(guò)程中補(bǔ)液除添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基外，只需添加 IL-2和IL-15即可，省去較為繁瑣的操作。
[0023] 本發(fā)明將誘導(dǎo)培養(yǎng)15-21天收獲的細(xì)胞用一種抗EGFRX抗CD3雙功能抗體在常溫 下解育30-40分鐘后，用生理鹽水洗涂后收集細(xì)胞，制成特異性殺傷EGFR陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的 CIK細(xì)胞制劑。
[0024] CIK細(xì)胞培養(yǎng)體系:無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基、CD3單克隆抗體(CD3mAb)、CD28單克隆抗體 (CD28mAb)、干擾素-丫（IFN-丫）、白介素-2(比-2)、白介素-15 (比-15)。
[0025] CIK細(xì)胞培養(yǎng)工藝:首次加入上述因子后，后續(xù)補(bǔ)液只需加無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基、比-2和IL