一種基于磁珠法純化非特異性擴(kuò)增pcr產(chǎn)物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于磁珠法純化非特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]聚合酶鏈反應(yīng)，簡(jiǎn)稱PCR。聚合酶鏈反應(yīng)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn)。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研宄，還可用于疾病的診斷或任何有DNA，RNA的地方。聚合酶鏈反應(yīng)又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。
[0003]PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因:一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體；二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有:必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物；減低酶量或調(diào)換另一來源的酶；降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)；適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93°C變性，65°C左右退火與延伸)。
[0004]然而有時(shí)改變擴(kuò)增條件，PCR產(chǎn)物中仍存在非特異性擴(kuò)增條帶。同時(shí)因?yàn)镻CR反應(yīng)體系中含有dNTP、Mg2+、DNA聚合酶等物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)對(duì)下游的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響，因此需要對(duì)獲得的非特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的純化。目前常用的非特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的回收方法基本上都是吸附柱回收法。利用磁珠法來純化非特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的方法目前未見報(bào)道。磁珠法純化DNA主要是利用交換吸附材料吸附核酸，從而將核酸和其他雜質(zhì)分離。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)單、快速的基于磁珠法純化非特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的方法。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0007]一種基于磁珠法純化非特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的方法，包括以下步驟:
[0008]I)通過瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物，當(dāng)觀察到非特異性條帶與目的性條帶分開時(shí)，用干凈的小刀將目的條帶切下，放入離心管中，然后在離心管中加入工作液A，所述目的條帶與工作液A的重量比為1:3，然后于50-70°C溫育8-15min ；
[0009]2)加入與上述離心管中的溶液等體積的工作液B，震蕩10-30s，室溫放置1-1Omin后，將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)，吸去液體，保留磁珠；
[0010]3)往上述含有磁珠的離心管中加入0.5-1.5ml工作液C，打勻后室溫靜置5-10min，將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)，吸去液體，保留磁珠；
[0011]4)往上述含有磁珠的離心管中加入30-60 μ I工作液D，將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)，吸取溶液，此溶液即為回收后的PCR產(chǎn)物，后續(xù)于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)；
[0012]所述工作液A由終濃度4-8mol/L NaClOjP終濃度0.01-0.lmol/L NaAc組成，pH=5-6 ；
[0013]所述工作液B由異丙醇和磁珠混懸液按照體積比24:1混合配制而成，其中，所述磁珠混懸液由磁珠和水按照體積比1:2混合配置而成；
[0014]所述工作液C由終濃度4.3-21.4mmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris),終濃度
2.1-4.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，終濃度42.9-85.7mmol/L Nacl和體積終濃度60-80%無水乙醇組成；
[0015]所述工作液D為5-10mmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)，pH = 7.0-9.0。
[0016]所述磁珠為硅基生物磁珠，粒徑為lum，購(gòu)買自溫州安科納米科技有限公司，產(chǎn)品編號(hào):AK1-G1000o
[0017]本發(fā)明所述終濃度是指溶液在工作液中的終濃度，例如所述工作液A由終濃度
4-8mol/L NaClO4和終濃度 0.01-0.lmol/L NaAc 組成，pH = 5-6，是指 NaClO 4在工作液 A中的濃度為4-8mol/L，NaAc在工作液A中的濃度為0.01-0.lmol/Lo
[0018]進(jìn)一步，所述工作液A由終濃度6mol/L NaClO4和終濃度0.012mol/L NaAc組成，pH = 5.2o
[0019]進(jìn)一步，所述工作液C由終濃度8.6mmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)，終濃度
3.4mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，終濃度60mmol/L Nacl和體積終濃度70%無水乙醇組成。
[0020]進(jìn)一步，所述工作液D為8mmol/L三輕甲基氨基甲燒(Tris)，pH = 8.0。
[0021]本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，通過磁珠法來純化非特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，其最大優(yōu)點(diǎn)就是自動(dòng)化，磁珠在磁場(chǎng)條件下可以發(fā)生聚集或分散，整個(gè)流程方便快捷，不需要使用到離心機(jī)等設(shè)備。本發(fā)明方法能簡(jiǎn)單、快速地純化非特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，與以往的非特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物純化方法相比，本方法不需要使用離心機(jī)等大型儀器，便于小實(shí)驗(yàn)室更好地開展分子生物學(xué)的相關(guān)研宄。
【附圖說明】
[0022]圖1為非特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果:泳道1，2，3，4是四管重復(fù)的非特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，泳道5是TAKARA公司的DL4500 marker ；
[0023]圖2為純化后的PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果:泳道I是純化后的PCR產(chǎn)物，泳道2是TAKARA公司的 DL4500 marker ο
【具體實(shí)施方式】
[0024]一種基于磁珠法純化非特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的方法，其特征在于:其包括以下步驟:
[0025]I)通過瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物，當(dāng)觀察到非特異性條帶與目的性條帶分開時(shí)，用干凈的小刀將目的條帶切下，放入離心管中，然后在離心管中加入工作液A，所述目的條帶與工作液A的重量比為1:3，然后于50-70°C溫育8-15min ；
[0026]2)加入與上述離心管中的溶液等體積的工作液B，震蕩10-30s，室溫放置1-1Omin后，將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)，吸去液體，保留磁珠；
[0027]3)往上述含有磁珠的離心管中加入0.5-1.5ml工作液C，打勻后室溫靜置
5-10min，將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)，吸去液體，保留磁珠；
[0028]4)往上述含有磁珠的離心管中加入30-60 μ I工作液D，將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)，吸取溶液，此溶液即為回收后的PCR產(chǎn)物，后續(xù)于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)；
[0029]所述工作液A由終濃度4-8mol/L NaClOjP終濃度0.01-0.lmol/L NaAc組成，pH=5-6 ；
[0030]所述工作液B由異丙醇和磁珠混懸液按照體積比24:1混合配制而成，其中，所述磁珠混懸液由磁珠和水按照體積比1:2混合配置而成；
[0031]所述工作液C由終濃度4.3-21.4mmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris),終濃度
2.1-4.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，終濃度42.9-85.7mmol/L Nacl和體積終濃度60-80%無水乙醇組成；
[0032]所述工作液D為5-10mmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)，pH = 7.0-9.0。
[0033]實(shí)施例1
[0034]一種基于磁珠法純化非特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的方法，其特征在于:其包括以下步驟:
[0035]I)通過瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物，當(dāng)觀察到非特異性條帶與目的性條帶分開時(shí)，用干凈的小刀將目的條帶切下，放入離心管中，然后在離心管中加入工作液A，所述目的條帶與工作液A的重量比為1:3，然后于60°C溫育1min ；
[0036]2)加入與上述離心管中的溶液等體積的工作液B，震蕩30s，室溫放置1min后，將離心管放在磁力架上，進(jìn)行磁珠分離，待磁珠吸附到離心管一側(cè)時(shí)，吸去液體，保留磁