茄子組成型光形態(tài)建成SmCOP1蛋白及其編碼基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及茄子光信號(hào)通路中的關(guān)鍵酶及其編碼基因，具體 涉及一種前子組成型光形態(tài)建成SmCOPl(Constitutive Photomorphogenic 1)蛋白及其基 因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] C0P1在植物中是一種E3泛素連接酶。研究發(fā)現(xiàn)，C0P1調(diào)控了許多光信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄 因子的泛素化降解過程，比如，HY5、LZF1、HFR1和C0等。COP 1通過降解HY5、LZF1和HFR1來調(diào) 控?cái)M南芥幼苗下胚軸的伸長和花色素苷的積累，通過調(diào)控C0的蛋白穩(wěn)定性來調(diào)控?cái)M南芥的 光周期開花。
[0003] C0P1調(diào)控了許多光信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄因子，那么光又是如何調(diào)控C0P1的呢？研究發(fā) 現(xiàn)，C0P1的亞細(xì)胞定位受到光的調(diào)控:C0P1既可以定位于細(xì)胞質(zhì)又可以定位于細(xì)胞核，黑暗 條件下，C0P1蛋白主要定位在細(xì)胞核，照光后，C0P1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)。C0P1的這種依 賴于光的亞細(xì)胞定位對(duì)其功能的實(shí)現(xiàn)意義重大，因?yàn)镃0P1作為E3泛素連接酶，其底物轉(zhuǎn)錄 因子大多都是在細(xì)胞核發(fā)揮功能的，所以黑暗下，C0P1主要定位于細(xì)胞核，它的底物大部分 被其泛素化并隨后被26S蛋白酶體降解掉，照光后，C0P1主要定位于細(xì)胞質(zhì)，它下游的底物 才可以獲得積累并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能，調(diào)控各種光形態(tài)建成生理表型。
[0004] 目前已從很多植物中克隆得到C0P1基因，如擬南芥、水稻、蘋果、油菜等。茄子是重 要的蔬菜作物，但相關(guān)研究相對(duì)比較滯后。目前，未有任何與茄子C0P1基因及其編碼蛋白的 相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的在于填補(bǔ)茄子C0P1基因的空白。本發(fā)明提 供了一種茄子C0P1的CDNA以及氨基酸序列;進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了茄子SmCOPI基因在不 同組織器官的表達(dá)模式。本發(fā)明還提供了 SmCOPI轉(zhuǎn)入擬南芥后表型發(fā)生改變的結(jié)果。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供一種茄子組成型光形態(tài)建成SmCOPI蛋白，包括SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列。
[0008] 第二方面，本發(fā)明提供一種編碼茄子組成型光形態(tài)建成SmCOPI蛋白的基因的核酸 序列，所述基因的cDNA序列包括：
[0009] (a)如SEQ ID NO. 1所示第1~2028位所示的堿基序列；或
[0010] (b)與SEQ ID NO. 1所示第1~2028位所示的堿基序列具有至少70%的同源性的堿 基序列;或
[0011] (C)能與SEQ ID NO. 1所示第1~2028位所示的堿基序列進(jìn)行雜交的堿基序列。
[0012] 優(yōu)選地，所述cDNA序列包括SEQ ID NO. 1第1~2028位所示的核酸序列中1~90個(gè) 核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60個(gè)以內(nèi)核苷酸。
[0013] 第三方面，本發(fā)明提供一種用于擴(kuò)增所述茄子組成型光形態(tài)建成SmCOPl蛋白的基 因的引物對(duì)，所述引物對(duì)的堿基序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID N0.4所示。
[0014] 第四方面，本發(fā)明提供一種用于編碼茄子組成型光形態(tài)建成SmCOPl蛋白的基因熒 光定量PCR分析的引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)的堿基序列如SEQ ID N0.5、SEQ ID NO. 6所示。
[0015] 第五方面，本發(fā)明提供了一種茄子組成型光形態(tài)建成SmCOPl蛋白的基因在基因工 程調(diào)控植物生長狀況和花青素合成的應(yīng)用。
[0016] 優(yōu)選地，所述植物包括擬南芥。
[0017] 在本發(fā)明中，術(shù)語"SmCOPl基因編碼序列"指SEQ ID NO. 1所示的第1~2028位核苷 酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO. 1所示的第1~2028位核苷酸中，有 一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的 簡并性，所以與SEQ ID NO. 1所示的第1~2028位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列 也能編碼出SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序 列的同源性至少70 %的核苷酸序列。
[0018] 該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的茄子SmCOPl相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 1所 示序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于）：通常為1~90個(gè)核苷酸的缺失、插入 和/或取代，以及在5'和/或3'端添加為60個(gè)以內(nèi)核苷酸。
[0019] 在本發(fā)明中，可用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法分析茄子SmCOPl基因產(chǎn)物的表達(dá)模式， 即分析茄子SmCOPl基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
[0020] 此外，根據(jù)本發(fā)明的茄子Sm⑶P1核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或 表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選茄子SmCOPl相關(guān)同源基因或同源蛋白。
[0021] 為了得到與茄子SmCOPl相關(guān)基因的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選茄子CDNA文庫，這些 探針是在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下，用 32P對(duì)茄子SmCOPl相關(guān)的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。適 合于篩選的cDNA文庫是來自茄子的文庫。構(gòu)建來自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫的方 法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自 Clontech, Stratagene，PaloAlto，Cal ·。這種篩選方法可以識(shí)別與前子SmCOPl相關(guān)的基因 家族的核苷酸序列。
[0022] 本發(fā)明的茄子Sm⑶P1相關(guān)核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組 法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其 是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所 制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR 擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0023] 當(dāng)獲得了有關(guān)序列后，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其 克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
[0024] 此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
[0025] 光信號(hào)能調(diào)控許多次生代謝途徑，例如花青素的合成。茄子是廣泛種植的蔬菜作 物，紫色茄子的果皮含有豐富的花青素。近年來的研究結(jié)果表明，紫色茄子的抗氧化保健作 用在常見蔬菜作物中是最好的。
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
[0027] 1、將SmCOPl基因在擬南芥突變株copl-4中表達(dá)，茄子C0P1基因具有與擬南芥C0P1 基因相似的功能。
[0028] 2、本發(fā)明針對(duì)目前茄子研究基礎(chǔ)薄弱的現(xiàn)狀，克隆光信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因 SmCOPl基因，為今后利用基因工程技術(shù)改良植物品質(zhì)，獲得具有高抗氧化性的藥物或食物 提供理論依據(jù)，具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0029]通過閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：
[0030] 圖1為本發(fā)明的茄子C0P1蛋白與番茄C0P1蛋白的氨基酸序列同源比較(FASTA)結(jié) 果，其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出；
[0031] 圖2為本發(fā)明的茄子C0P1基因在不同組織的表達(dá)情況；
[0032] 圖3為轉(zhuǎn)SmCOPl基因植株的RT-PCR檢測；
[0033]圖4為轉(zhuǎn)SmCOPl基因?qū)M南芥突變株copl-4的表型恢復(fù)情況；
[0034]圖5為轉(zhuǎn)SmCOPl基因?qū)M南芥突變株copl-4的花青素合成的調(diào)控情況。
【具體實(shí)施方式】
[0035]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù) 人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。
[0036]下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的 條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0037] 實(shí)施例1、茄子SmCOPl基因的克隆 [0038] 1.植物材料的獲得
[0039] 本實(shí)驗(yàn)所用的植物材料為茄子優(yōu)良種質(zhì)資源藍(lán)山禾線茄。實(shí)驗(yàn)材料栽培于上海市 閔行區(qū)浦江鎮(zhèn)航天育種基地的人工塑料大棚中。在自然條件下育苗，生長并結(jié)實(shí)。采集茄子 的葉片用于提取RNA。
[0040] 2.RNA 的提取
[0041] 采用TRIzol法提取總RNA(TRIzol購自生工生物工程(上海)股份有限公司）。用甲 醛變性膠電泳鑒定RNA的完整性，然后在分光光度計(jì)（Thermo Scientific NAN0DR0P lOOOSpectrophotometer)上測定RNA的純度及濃度。
[0042] 3.基因的全長克隆
[0043] 基于Genbank中⑶P1基因的保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)簡并引物。將提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 (Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit:寶生物工程（大連）有限公司），以第 一鏈cDNA為模板，利用引物
[0044] FI (SEQ ID ^.3):57 -ATGGTRGARAGTTCARTKGGAGGG-37
[0045] R1(SEQ ID NO.4)：57-TCAMGCWGCAAGKACYARCACTTTTATAG-37
[0046] 進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到預(yù)期長度后回收并連接到pMD-19T(寶生物工程(大連)有限公 司）載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，利用α互補(bǔ)及菌落PCR篩選陽性克隆，送至英濰捷基（上海） 貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序，得cDNA序列SEQ ID Ν0.1。
[0047] 實(shí)施例2、茄子C0P1基因的序列信息與同源性分析
[0048] 本發(fā)明新的茄子⑶P1基因全長⑶S開放讀框序列為2028bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO. 1。根據(jù)CDS開放讀碼框序列推導(dǎo)出前子C0P1的氨基酸序列，共675個(gè)氨基酸殘基，分子量 為76257.1道爾頓，理論等電點(diǎn)(pi)為6.87,詳細(xì)序列見SEQ ID N0.2所示序列。
[0049] 將茄子C0P1的⑶S開放讀框序列及其編碼蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+ SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與番前 C0P1基因（NM_001247118.1)在核苷酸水平上具有94.30 % -致性;在氨基酸水平上，它們兩 者之間相似性高達(dá)95.72%，如圖1所示(Query:茄子C0P1的氨基酸序列；Sbjet:番茄C0P1的 氨基酸序列）。由此可見，茄子C0P1基因與番茄C0P1基因無論從核酸還是蛋白水平上都存在 較高的同源性。
[0050] 實(shí)施例3、茄子C0P1基因在不同組織中的表達(dá)
[00511 1.植物材料的獲得
[0052] 在果實(shí)成熟期分別采集茄子根、莖、葉、花、果皮、果肉，將樣品分別用鋁鉑紙包好 后立刻投入液氮中，接著轉(zhuǎn)入_80°C超低溫冰箱中貯存待用。
[0053] 2.RNA 的提取
[0054] 采用TRIzol法提取總RNA(TRIzol購自生工生物工程(上海)股份有限公司）。用普 通瓊脂糖凝膠電泳(膠濃度1.2 % ; 0.5 X TBE電泳緩沖液；150v，15min)檢測完整性。電泳條 帶中最大rRNA亮度應(yīng)為第二條rRNA亮度的1.5-2.0倍，否則表示rRNA樣品的降解。純度較好 的RNA，A 26Q/A28Q以及A26Q/A23Q約為2 · 0左右。用分光光度計(jì)測定0D值并計(jì)算RNA含量。
[0055] 3.CDNA 的獲得
[0056] 以500ng的總RNA為模板，按照寶生物公司TaKaRa PrimeScript? RT reagent Kit Perfect Real Time試劑盒操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA備用。
[0057] 4.設(shè)計(jì)特異性引物以進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析基因在不同組織中的表達(dá)量。根 據(jù)已經(jīng)獲得的茄子C0P1基因序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)用于Real-time PCR中SmCOPl基 因定量分析的特異性引物，
[0058] C0P1-F(SEQ ID N0.5)：57-AGTTTGGTGCACGAAGCAGGAAG-37
[0059] C0P1-R(SEQ ID N0.6)：57-TGTGAACGGGCTGGCT