重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種在大腸桿菌以包涵體形式表達重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(recombinant?human?bone?morphogenetic?protein-2，rhBMP-2)的制備方法，其包括如下主要步驟：高壓勻漿破碎菌體細胞、漂洗包涵體和調節(jié)不同pH值、尿素變性溶解所述包涵體蛋白、所述包涵體蛋白質的控速復性、離心、超濾膜濃縮、過濾除菌、冷凍干燥制成成品等步驟。本發(fā)明的制備方法利用在漂洗過程中通過數次調節(jié)不同pH值和控制尿素濃度改變速度進行復性、并且通過超濾膜技術即可制備純度高、活性高的rhBMP-2。同時可以省略層析步驟，通過現代超濾膜技術即可滿足產品質量要求，大大縮短了工時、降低了生產成本。本發(fā)明可高效、簡便、低成本地獲得rhBMP-2純品。
【專利說明】重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及從大腸桿菌表達的胞內包涵體形式的蛋白質制備高純度重組人骨形 態(tài)發(fā)生-2的方法，屬于蛋白質生物化學工程領域。

【背景技術】
[0002] 骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP)為 Urist 于 1963 年發(fā)現 (Marshall R. Urist m R. Bone formation by autoinduction. Science,1965,150:893), 能夠誘導動物或人體間充質細胞分化為骨、軟骨、韌帶、肌腱和神經組織。BMP最初被認 為是軟骨和骨形成的蛋白質調節(jié)劑（Marshall R. Urist m. The substratum for bone morphogenesis. Dev Biol (Suppl), 1971, 4:125)，但他們隨后表現出與各種組織和器官的 胚胎發(fā)育和形態(tài)發(fā)生有關的性質。同時BMP也表現出調節(jié)各種細胞的生長、分化和趨藥 性的作用，包括間充質細胞、上皮細胞、造血細胞和神經細胞。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)是轉化生長因子β超家族成員之一，具有誘導未分 化的間充質干細胞向成軟骨細胞和成骨細胞定向分化與增殖的能力，促進成骨細胞分 化成熟，參與骨和軟骨的生長發(fā)育及其重建過程，進而加速骨缺損的修復。研究表明， ΒΜΡ-2主要對未分化間充質細胞和骨系細胞起到募集和分化作用（Riley e A，Lane J M,Urist Μ R，et al. Bone morphogenetic protein-2:Biology and application. Clinic Orthop，1996, 324:39)。在骨形成早期，BMP-2不僅可使未分化間質細胞向骨形成中心募集， 并分化為骨系細胞，而且可使成纖維細胞、成肌細胞及骨髓的基細胞逆轉分化為骨系細胞。 其主要過程是：增加或抑制這些細胞內的某些特異性蛋白的分泌，使成纖維細胞分化為成 骨細胞，成肌細胞快速分化為肥大的軟骨細胞，并促進基質鈣化。對于成骨細胞，BMP-2則 可使之維持其特有細胞表型，并誘導成骨細胞標志物的增高，促進細胞外基質鈣化。在骨形 成后期，BMP-2還作為一種破骨細胞分化因子與其它支持破骨細胞分化因子直接或間接刺 激破骨細胞分化，參與骨的重建（Kaffagiri t，Yamaguch A，et al. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblast into theosteoblast lineage. J-Cell-Biol, 1994,127:1755 ;Kanatani t, Yamaguch A, Ikeda T, et al. The non-osteogenic mouse pluripotent cell line, c3H10Ti/2, is induce todifferentiate into osteoblastic cell by recombinant human bone morphogenetic protein-2. Biochem-Biophys-Res-Commun, 1990, 192(1):295 ；Long m ff,Robinson J A, Ashcraft E A, et al. Regulation of human bone marrow-deriyedosteogenitor ceels by osteogenic growth factors. J Clin Invest, 1995, 95:881)qBMP-2在體內以前體形式 合成，經蛋白酶切去除信號肽和前肽，得到由114個氨基酸殘基組成的成熟肽。成熟肽通過 7對二硫鍵將其保守結構正確折疊。成熟的BMP-2以二聚體形式才具有生物活性。
[0003] 目前，人們利用基因重組技術已經表達出人類基因重組BMP-2 (rh BMP-2)，并且在 常位和異位成功地誘導出新骨（胡蘊玉.骨誘導及BMP的研究現狀與展望.中華骨科雜志， 1996,34(10) :579)。BMP-2在臨床中的應用展示廣闊的前景（金巖，司曉輝，楊連甲等.骨 形態(tài)形成蛋白在下頜骨骨折中的表達及mRNA水平分析.中華創(chuàng)傷，1996,12 (6) :353)。本 重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (rhBMP-2)單體含全部114個氨基酸殘基，單體分子量12. 9KD，它 的同二聚體具有與天然骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2相當的生物活性。
[0004] 目前，利用大腸桿菌表達重組人BMP-2,有兩種不同的技術途徑，一種是生產分泌 型的重組人生長激素，一種則是生產胞內型。經無數次實踐驗證，生產分泌型的重組人生長 激素，雖然步驟簡單，但其表達量很低，成本也極其高，不能滿足市場的需要。重組胞內型的 人生長激素蛋白，其表達量非常大，但復性效果往往不好，復性后的蛋白質折疊不好，穩(wěn)定 性差，蛋白活性低。
[0005] 基于現有技術存在的問題，本發(fā)明提供了一種改良的重組人生長激素的制備的方 法，較容易獲得大量的高純度和活性高的蛋白。


【發(fā)明內容】

[0006] 基于現有技術存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種，從大腸桿菌表達的胞內包 涵體形式的蛋白質制備高純度重組人BMP-2的方法，所述方法包括：高壓勻漿破碎菌體細 胞、漂洗包涵體和調節(jié)不同pH值、變性溶解所述包涵體蛋白、所述包涵體蛋白控速復性、離 心、超濾膜濃縮、過濾除菌、冷凍干燥制成成品步驟。
[0007] 在本發(fā)明的一個方面，所述漂洗包涵體和調節(jié)不同pH值步驟是用含有0. 1-5 %的 去污劑的去離子水和調節(jié)pH至2-10,漂洗包涵體3-5次；所述去污劑為曲拉通X-100。
[0008] 在本發(fā)明的又一個方面，所述包涵體蛋白尿素控速復性步驟為：添加水或緩沖液 降低尿素濃度來實施的。所述尿素復性該包涵體蛋白步驟是通過控制添加水或緩沖液的流 速來實現的；所述控制添加水或緩沖液的流速為l-l〇〇mL/分鐘，優(yōu)選為2-20mL/分鐘，最優(yōu) 選為5mL/分鐘。
[0009] 在本發(fā)明的再一個方面，所述超濾膜濃縮的步驟是用截留分子量為10000道爾 頓-35000道爾頓的超濾膜進行反復超濾濃縮。
[0010] 在本發(fā)明的一個具體方面，本發(fā)明提供了從腸桿菌表達的胞內包涵體形式的蛋白 質制備高純度重組人BMP-2的方法，其包括以下步驟：
[0011] 1)新發(fā)酵獲得的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白_2大腸桿菌細胞，于高壓勻漿機中，在 =l〇°C條件下進行破菌；
[0012] 2)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心0. 5-2小時，棄除清液，收 集固體沉淀；
[0013] 3)沉淀轉移至攪拌罐中，加入10-30倍含0. 1%的曲拉通X-100的去離子水攪拌， 調pH值為8. 5-10. 0,在=20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離 心，離心0. 5-2小時，棄除清液，收集固體沉淀；
[0014] 4)加入10-100倍含0. 1%的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調pH值為6. 0-8. 5， 在蘭20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心0. 5-2小時，棄 除清液，收集固體沉淀；
[0015] 5)加入10-100倍含0. 1%的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調pH值為2.0-6. 0， 在蘭20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心0. 5-2小時，棄 除清液，收集固體沉淀；
[0016] 6)步驟4)的沉淀加沉淀體積重量比20-80倍的含ImM Beta-巰基乙醇的8M尿素 溶液，攪拌2-4小時使蛋白變性溶解；
[0017] 7)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心0. 5-2小時，收集澄清液 體，棄除產生的少量黑色沉淀雜質；
[0018] 8)澄清液體轉移到攪拌罐中，邊攪拌邊加入3倍體積的去離子水，添加去離子水 的流速為2-20mL/分鐘，最后尿素濃度降為2M ;
[0019] 9)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心0. 5-2小時，收集澄清液 體；
[0020] 10)用截留分子量為10000-26000道爾頓的超濾機濃縮，到1/5-1/10體積；
[0021] 11)加入去離子水到原體積，重復步驟11)6次以上，再加入去離子水到原體積；
[0022] 12)用截留分子量為26000-35000道爾頓的超濾機超濾，收集穿過液；
[0023] 13)用截留分子量為10000-26000道爾頓的超濾機濃縮，到1/10-1/50體積；
[0024] 14)用除菌過濾機除菌，冷凍干燥，分裝得成品。
[0025] 在本發(fā)明的進一步具體方面，本發(fā)明提供了從腸桿菌表達的胞內包涵體形式的蛋 白質制備高純度重組人BMP-2的方法，其包括以下步驟：
[0026] 1)新發(fā)酵獲得的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白_2大腸桿菌細胞，于高壓勻漿機中，在 =l〇°C條件下進行破菌；
[0027] 2)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心45分鐘，棄除清液，收集固 體沉淀；
[0028] 3)沉淀轉移至攪拌罐中，加入10-30倍含0. 1%的曲拉通X-100的去離子水攪拌， 調pH值為9. 0,在=20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離 心0. 5-2小時，棄除清液，收集固體沉淀；
[0029] 4)加入10-100倍含0. 1 %的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調pH值為6. 5-7. 5， 在f 20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心1小時，棄除清 液，收集固體沉淀；
[0030] 5)加入10-100倍含0. 1 %的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調pH值為3.0,在 蘭20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心0. 5-2小時，棄除 清液，收集固體沉淀；
[0031] 6)步驟4)的沉淀加沉淀體積重量比20-80倍的含ImM Beta-巰基乙醇的8M尿素 溶液，攪拌2-4小時使蛋白變性溶解；
[0032] 7)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心30分鐘，收集澄清液體，棄 除產生的少量黑色沉淀雜質；
[0033] 8)澄清液體轉移到攪拌罐中，邊攪拌邊加入3倍體積的去離子水，添加去離子水 的流速為2-20mL/分鐘，最后尿素濃度降為2M ;
[0034] 9)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心1小時，收集澄清液體；
[0035] 10)用截留分子量為20000道爾頓的超濾機濃縮，到1/5-1/10體積；
[0036] 11)加入去離子水到原體積，重復步驟11)6次以上，再加入去離子水到原體積；
[0037] 12)用截留分子量為30000道爾頓的超濾機超濾，收集穿過液；
[0038] 13)用截留分子量為20000道爾頓的超濾機濃縮，到1/10-1/50體積；
[0039] 14)用除菌過濾機除菌，冷凍干燥，分裝得成品。
[0040] 在本發(fā)明的更進一步具體方面，本發(fā)明提供了從腸桿菌表達的胞內包涵體形式的 蛋白質制備高純度重組人BMP-2的方法，其包括以下步驟：
[0041] 1)新發(fā)酵獲得的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2大腸桿菌細胞，于高壓勻漿機中，在 =l〇°C條件下進行破菌；
[0042] 2)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心45分鐘，棄除清液，收集固 體沉淀；
[0043] 3)沉淀轉移至攪拌罐中，加入20倍含0. 1 %的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調 pH值為9. 0,在f 20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心1 小時，棄除清液，收集固體沉淀；
[0044] 4)加入10-100倍含0. 1 %的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調pH值為7.0,在 f 20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心1小時，棄除清 液，收集固體沉淀；
[0045] 5)加入10-100倍含0. 1 %的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調pH值為3.0,在 f 20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心1小時，棄除清 液，收集固體沉淀；
[0046] 6)步驟4)的沉淀加沉淀體積重量比20-80倍的含ImM Beta-巰基乙醇的8M尿素 溶液，攪拌2-4小時使蛋白變性溶解；
[0047] 7)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心30分鐘，收集澄清液體，棄 除產生的少量黑色沉淀雜質；
[0048] 8)澄清液體轉移到攪拌罐中，邊攪拌邊加入3倍體積的去離子水，添加去離子水 的流速為5mL/分鐘，最后尿素濃度降為2M ;
[0049] 9)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心1小時，收集澄清液體；
[0050] 10)用截留分子量為20000道爾頓的超濾機濃縮，到1/8體積；
[0051] 11)加入去離子水到原體積，重復步驟11)6次以上，再加入去離子水到原體積；
[0052] 12)用截留分子量為30000道爾頓的超濾機超濾，收集穿過液；
[0053] 13)用截留分子量為20000道爾頓的超濾機濃縮，到1/20體積；
[0054] 14)用除菌過濾機除菌，冷凍干燥，分裝得成品。
[0055] 本發(fā)明的方法在去除雜蛋白和雜質方面，不需要使用傳統(tǒng)除雜用的氯仿、丙酮、乙 醇等對人有害的溶劑，同時省略了高溫加熱法除雜蛋白的步驟，不盡節(jié)約了能源也避免了 高溫對重組人BMP-2破壞。本發(fā)明的方法操作簡單，生產成本低廉，適用于大規(guī)模工業(yè)化生 產，實現了低成本生產重組人BMP-2的工藝方法。離心和過濾所得到的濾液由于不含有任 何有害物質，不會污染環(huán)境。本工藝幾乎不產生固形廢棄物，沒有固型垃圾。復性過程所產 生尿素，可以回收，用于植物肥料。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0056] 圖1是制備重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白_2工藝路線圖。
[0057] 圖2是自制多孔噴頭示意圖。圖中的A、B、C、D、E、F代表它們的尺寸，可根據蛋白 復性罐體的尺寸設計。
[0058] 圖3是重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2在大腸桿菌中的表達情況。1、誘導前；2、IPTG 誘導后；3、破菌后離心上清；4、破菌后離心沉淀。
[0059] 圖4是重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2包涵體蛋白洗雜后沉淀的電泳圖。
[0060] 圖5是純化后冷凍干燥粉產品電泳圖。
[0061] 圖6是純化后冷凍干燥粉產品用分子篩方法檢測純度的層析圖譜。

【具體實施方式】
[0062] 為了提供對本發(fā)明的實質性理解，在下文中以不同的詳細程度描述了本發(fā)明的某 些方面、模式、實施方式、變型和特征。
[0063] 在實施本發(fā)明的過程中，使用了生物化學、蛋白質生物化學、蛋白質生物化學工程 等很多傳統(tǒng)技術。這些技術是熟知的。
[0064] 在本發(fā)明的一個實施方式中，提供了從大腸桿菌表達的胞內包涵體形式的蛋白質 制備高純度重組人MBP-2的方法，所述方法包括：高壓勻漿破碎菌體細胞、調節(jié)pH洗滌包涵 體，該包涵體變性溶解、包涵體蛋白控速復性、離心、超濾膜濃縮、過濾除菌、冷凍干燥制成 成品等步驟（圖1)。
[0065] 首先，對細菌體表達的重組人生長激素進行破碎，為了能夠保證重組人MBP-2 在菌體破碎過程中不發(fā)生熱變性或降解，通常情況下在S 10°c條件下進行破菌，例如在 10°C、8°C、6°C，比較適合在4°C左右。在本發(fā)明的一些實施方式中，使用了高速離心步 驟，以去除產物中不需要的雜質，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，可以是 10000-20000轉/分，例如12000-20000轉/分，合適為14000-20000轉/分，例如在一些具 體實施例中采用15000轉/分鐘離心離心時間通常控制在2個小時以內，例如1. 5小時、1 小時、45分鐘或30分鐘。
[0066] 本發(fā)明中的漂洗包涵體實施方式中，在去離子水中加入了去污劑，。去污劑可以是 曲拉通X-100、吐溫20(20-80的分子個數）、即-40、(》-2、脂肪酸鈉等陽離子型去污劑、陰離 子型去污劑或中性去污劑，可以是單一去污劑，也可以是這些去污劑的按比例的混合物， 優(yōu)選為曲拉通X-100。去污劑使用濃度為〇. 001-20 %，優(yōu)選0. 05-2 %，更優(yōu)選為0. 05-1 %。 在一些的具體實施例中，加入去離子水攪拌后，調節(jié)了 pH值，所述的pH值可以在2-10之 間，pH值過高會使目標蛋白溶解丟失，優(yōu)選地，選擇pH值3、pH值7和pH值9三個不同pH 值洗除雜蛋白，有益于除去酸性、中性和堿性雜蛋白，使純化蛋白純度更高。重復洗滌蛋白 是非常必要的，是為了去除雜蛋白，提高產品純度?？梢灾貜拖礈於啻危线m地2-6次，例如 3-5 次。
[0067] 通常地，選擇尿素、鹽酸胍及其衍生物等作為蛋白質變性劑。本發(fā)明中的一些具體 優(yōu)選實施例中使用了 8M尿素是蛋白質變性劑，為了溶解目標蛋白，使目標蛋白變性，打開 它們的錯誤折疊的二維和三維構象。尿素的使用量可以是6-9M，優(yōu)選7M-9M，最優(yōu)選為8M。 所加變性劑的量一般在沉淀量的10-100倍（重量體積比：W/V)，例如15-100倍，優(yōu)選在50 倍。
[0068] 本發(fā)明一些具體實施例中，向所述的蛋白質變性溶解液體中添加了還原劑，所述 還原劑可以使蛋白質分子間和分子內的二硫鍵斷裂，有利于蛋白質的變性和復性。還原劑 可以是還原性谷胱甘肽、Beta-巰基乙醇、維生素 C及其衍生物、四氫化碳等有機還原劑和 無機還原劑，優(yōu)選還原劑為Beta-巰基乙醇。
[0069] 在本發(fā)明的一些實施方式中，進行了純化蛋白質的復性過程，一般先使蛋白多肽 形成二級結構，再折疊形成三級結構。這個過程需要逐漸降低蛋白質變性劑的濃度，如果過 于快速，會使變性蛋白相互纏繞，不利于復性?？梢跃徛尤肴ルx子水。每個出水點的流速 可以在lmL-100mL/分鐘，優(yōu)選2-20mL/分鐘，最優(yōu)選5mL/分鐘。
[0070] 為了更好地控制所述流速，本發(fā)明中設計和使用了自動多孔噴頭。其形式酷似淋 浴噴頭，由多個出水口，自制多孔噴頭，目的是使每個反應體系表面，在單位時間里流下的 復性劑（超純水）不至于使其局部尿素濃度降得太快，以防蛋白折疊不好，多個出水點既可 防止局部尿素濃度降得太快，又能保證復性時間縮短，大大降低生產工時。每個出水口流 速在l-100mL/分鐘，孔的直徑可以在0. 01-10cm，例如0. 5mm，1mm，5mm，lcm等。孔間間距 為0· 01-10cm，例如0· 5mm，1mm，5mm，lcm等（見圖2)。以防局部流量過快，影響蛋白復性效 率。通過該裝置，每個出水點的流速可以在lmL-100mL/分鐘，合適為2-75 mL/分鐘，優(yōu)選 2-20mL/分鐘，更優(yōu)選5-20mL/分鐘，最優(yōu)選5mL/分鐘。
[0071] 術語"所述包涵體蛋白控速復性"是指變性后，對變性劑通過控制流速進行稀釋過 程，通過控制流速和復性時間，達到包涵體蛋白的完全復性和保持其結構穩(wěn)定性。復性時間 不受限制，但過長的復性時間也不是所期望的，這是基于蛋白質性質和能量消耗所決定的。
[0072] 添加的復性液體可以是水，例如清水、純凈水、超純水、去離子水，也可以是也可以 是緩沖液，如Tris-HCl、磷酸緩沖液、碳酸緩沖液、檸檬酸緩沖液等有機或無機緩沖液。同時 也可以是相應的低濃度的變形劑。
[0073] 在本發(fā)明的一個【具體實施方式】中，用超純水，使用自制多孔噴頭，在連續(xù)濃度梯度 條件下復性，直至反應體系中尿素濃度下降到2M以下為止。2M以下濃度尿素已經能夠使 rhMBP-2蛋白完全復性和保持其結構穩(wěn)定性。
[0074] 本發(fā)明一些具體實施例中，進行了過濾濃縮步驟。首先，用超濾裝置除尿素的過 程，一般來說，重復次數越多，除尿素越干凈，但到尿素含量達到〇. OlmM以下時，就可以滿 足產品要求，次數越多工時就越長，所以本工藝選用6次，第六次為0. 0067mM。
[0075] 接著用截留分子量較大的蛋白雜質及其復性時纏繞在一起的折疊不好的目標蛋 白，因為一個折疊好的重組人BMP-2分子量在26000道爾頓左右，不容易通過20000道爾頓 的超濾柱微孔，而被截流。相反，由于折疊好的重組人BMP-2分子量在26000道爾頓左右， 可通過30000道爾頓的超濾柱微孔，有利于去除多個分子纏繞在一起的不正確裝配的大型 BMP-2蛋白和大分子量雜蛋白，可保證產品的質量。
[0076] 然后進行產品濃縮步驟，一切小于26000道爾頓的超濾裝置都可用于濃縮，但截 流分子量太大的超濾裝置會丟失一些目標蛋白，我們選用截流分子量在1000-22000道爾 頓的超濾裝置，優(yōu)選8000-22000道爾頓的超濾裝置，最優(yōu)選截流分子量在20000道爾頓超 濾裝置。
[0077] 同時，對制備的重組人BMP-2用法瑪西亞Phamarcia)蛋白質純度分析儀AKTA Purifier的分子篩Sup erdeX75檢驗產品的純度，經過分析測定得到重組人生長激素均在 95% 以上，例如 96%，97%，98%，99%，有的甚至接近 100%，例如 99. 5%，99. 8 或 99. 9%。
[0078] 在本發(fā)明的一些實施例中，采用堿性磷酸酶（ALP)活性的方法對重組人BMP-2的 生物學活性進行了檢測。一般依據試劑盒提供的說明書進行ALP活性檢測。這些方法都是 本領域技術人員所熟知的。本發(fā)明的重組人BMP-2比活性均在7500U/mg以上，例如8000U/ mg、8500U/mg、9000U/mg 以上，有的甚至超過 10000U/mg。
[0079] 經過計算得出，蛋白質可回收率在65%以上，例如70、80%、85%以上，在一些本 發(fā)明優(yōu)選實施方式中，蛋白質可回收率在80%以上，例如85%以上，例如90%、92%、95、 97%、99%。
[0080] 在本發(fā)明的一個【具體實施方式】中，本發(fā)明提供了從腸桿菌表達的胞內包涵體形式 的蛋白質制備高純度重組人BMP-2的方法，其包括以下步驟：
[0081] 1)新發(fā)酵獲得的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2大腸桿菌細胞，于高壓勻漿機中，在 =l〇°C條件下進行破菌；
[0082] 2)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心0. 5-2小時，棄除清液，收 集固體沉淀；
[0083] 3)沉淀轉移至攪拌罐中，加入10-30倍含0. 1%的曲拉通X-100的去離子水攪拌， 調pH值為8. 5-10. 0,在=20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離 心，離心0. 5-2小時，棄除清液，收集固體沉淀；
[0084] 4)加入10-100倍含0. 1 %的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調pH值為6. 0-8. 5， 在蘭20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心0. 5-2小時，棄 除清液，收集固體沉淀；
[0085] 5)加入10-100倍含0. 1 %的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調pH值為2. 0-6. 0， 在蘭20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心0. 5-2小時，棄 除清液，收集固體沉淀；
[0086] 6)步驟4)的沉淀加沉淀體積重量比20-80倍的含ImM Beta-巰基乙醇的8M尿素 溶液，攪拌2-4小時使蛋白變性溶解；
[0087] 7)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心0. 5-2小時，收集澄清液 體，棄除產生的少量黑色沉淀雜質；
[0088] 8)澄清液體轉移到攪拌罐中，邊攪拌邊加入3倍體積的去離子水，添加去離子水 的流速為2-20mL/分鐘，最后尿素濃度降為2M ;
[0089] 9)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心0. 5-2小時，收集澄清液 體；
[0090] 10)用截留分子量為10000-26000道爾頓的超濾機濃縮，到1/5-1/10體積；
[0091] 11)加入去離子水到原體積，重復步驟11)6次以上，再加入去離子水到原體積；
[0092] 12)用截留分子量為26000-35000道爾頓的超濾機超濾，收集穿過液；
[0093] 13)用截留分子量為10000-26000道爾頓的超濾機濃縮，到1/10-1/50體積；
[0094] 14)用除菌過濾機除菌，冷凍干燥，分裝得成品。
[0095] 在本發(fā)明的進一步【具體實施方式】中，本發(fā)明提供了從腸桿菌表達的胞內包涵體形 式的蛋白質制備高純度重組人BMP-2的方法，其包括以下步驟：
[0096] 1)新發(fā)酵獲得的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白_2大腸桿菌細胞，于高壓勻漿機中，在 =l〇°C條件下進行破菌；
[0097] 2)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心45分鐘，棄除清液，收集固 體沉淀；
[0098] 3)沉淀轉移至攪拌罐中，加入10-30倍含0. 1%的曲拉通X-100的去離子水攪拌， 調pH值為9. 0,在=20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離 心0. 5-2小時，棄除清液，收集固體沉淀；
[0099] 4)加入10-100倍含0. 1 %的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調pH值為6. 5-7. 5， 在f 20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心1小時，棄除清 液，收集固體沉淀；
[0100] 5)加入10-100倍含0. 1 %的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調pH值為3.0,在 蘭20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心0. 5-2小時，棄除 清液，收集固體沉淀；
[0101] 6)步驟4)的沉淀加沉淀體積重量比20-80倍的含ImM Beta-巰基乙醇的8M尿素 溶液，攪拌2-4小時使蛋白變性溶解；
[0102] 7)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心30分鐘，收集澄清液體，棄 除產生的少量黑色沉淀雜質；
[0103] 8)澄清液體轉移到攪拌罐中，邊攪拌邊加入3倍體積的去離子水，添加去離子水 的流速為2-20mL/分鐘，最后尿素濃度降為2M ;
[0104] 9)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心1小時，收集澄清液體；
[0105] 10)用截留分子量為20000道爾頓的超濾機濃縮，到1/5-1/10體積；
[0106] 11)加入去離子水到原體積，重復步驟11)6次以上，再加入去離子水到原體積；
[0107] 12)用截留分子量為30000道爾頓的超濾機超濾，收集穿過液；
[0108] 13)用截留分子量為20000道爾頓的超濾機濃縮，到1/10-1/50體積；
[0109] 14)用除菌過濾機除菌，冷凍干燥，分裝得成品。
[0110] 在本發(fā)明的更進一步【具體實施方式】中，本發(fā)明提供了從腸桿菌表達的胞內包涵體 形式的蛋白質制備高純度重組人BMP-2的方法，其包括以下步驟：
[0111] 1)新發(fā)酵獲得的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2大腸桿菌細胞，于高壓勻漿機中，在 =10°c條件下進行破菌；
[0112] 2)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心45分鐘，棄除清液，收集固 體沉淀；
[0113] 3)沉淀轉移至攪拌罐中，加入20倍含0. 1%的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調 pH值為9. 0,在f 20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心1 小時，棄除清液，收集固體沉淀；
[0114] 4)加入10-100倍含0. 1 %的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調pH值為7.0,在 f 20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心1小時，棄除清 液，收集固體沉淀；
[0115] 5)加入10-100倍含0. 1 %的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調pH值為3.0,在 f 20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心1小時，棄除清 液，收集固體沉淀；
[0116] 6)步驟4)的沉淀加沉淀體積重量比20-80倍的含ImM Beta-巰基乙醇的8M尿素 溶液，攪拌2-4小時使蛋白變性溶解；
[0117] 7)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心30分鐘，收集澄清液體，棄 除產生的少量黑色沉淀雜質；
[0118] 8)澄清液體轉移到攪拌罐中，邊攪拌邊加入3倍體積的去離子水，添加去離子水 的流速為5mL/分鐘，最后尿素濃度降為2M ;
[0119] 9)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心1小時，收集澄清液體；
[0120] 10)用截留分子量為20000道爾頓的超濾機濃縮，到1/8體積；
[0121] 11)加入去離子水到原體積，重復步驟11)6次以上，再加入去離子水到原體積；
[0122] 12)用截留分子量為30000道爾頓的超濾機超濾，收集穿過液；
[0123] 13)用截留分子量為20000道爾頓的超濾機濃縮，到1/20體積；
[0124] 14)用除菌過濾機除菌，冷凍干燥，分裝得成品。
[0125] 結合附圖1，對本發(fā)明的從包涵體形式的重組蛋白到通過一系列蛋白純化方法，實 現了人骨形成蛋白2工業(yè)生產的目的，以下對本技術方案作進一步說明。
[0126] 通過如下實施例描述，更好地理解本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅僅局限于所記載的實 施例。
[0127] 實施例
[0128] 實施例1
[0129] 1)新鮮發(fā)酵獲得的重組BMP-2大腸桿菌細胞1公斤，加入80升去離子水，攪拌均 勻，于高壓勻漿機中，在=l〇°C條件下進行破菌；
[0130] 2)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，棄除清液，收集固體沉淀約0. 6 公斤（圖3和圖4)和；
[0131] 3)將沉淀轉移至攪拌罐中。加入30升的去離子水（含0. 1 %的曲拉通X-100)攪 拌，調pH值為7.0,在=20°C攪拌2小時；
[0132] 4)加入50倍的去離子水（含0.1 %的曲拉通X-100)攪拌，調pH值為7.0,在 f 20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，棄除清液，收集固體沉 淀；
[0133] 5)加入50倍的去離子水（含0· 1 %的曲拉通X-100)攪拌，調pH值為3.0,在 f 20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，棄除清液，收集固體沉 淀，得沉淀約0. 4公斤；
[0134] 6)步驟5)的沉淀加20升的8M尿素（含ImMBeta-巰基乙醇）溶液，攪拌2小時 使蛋白變性溶解；
[0135] 7)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，收集澄清液體，棄除產生的少量 黑色沉淀雜質；
[0136] 8)澄清液體轉移到攪拌罐中，用自制多孔噴頭邊攪拌邊加入60升去離子水，每孔 流速為5mL/分；
[0137] 9)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，收集澄清液體；
[0138] 10)用截留分子量為20000道爾頓的超濾機濃縮到8升；
[0139] 11)加入80升去離子水，重復步驟11)6次以上，再加入去離子水到80升；
[0140] 12)用截留分子量為30000道爾頓的超濾機超濾，收集穿過液；
[0141] 13)用截留分子量為20000道爾頓的超濾機濃縮，到4升；
[0142] 14)用除菌過濾機除菌，冷凍干燥，分裝得成品約200克。所得制品的純度為 98.9%，活性為 998(^/11^，回收率為90.7%(圖6)。
[0143] 實施例2
[0144] 1)新鮮發(fā)酵獲得的重組人BMP-2大腸桿菌細胞5公斤，加入400升去離子水，攪拌 均勻，于高壓勻漿機中，在S 10°c條件下進行破菌；
[0145] 2)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，棄除清液，收集固體沉淀約0. 6 公斤；
[0146] 3)將沉淀轉移至攪拌罐中。加入150升的去離子水（含0. 1 %的曲拉通X-100) 攪拌，調pH值為7.0,在=20°C攪拌2小時；
[0147] 4)加入50倍的去離子水（含0.1 %的曲拉通X-100)攪拌，調pH值為7.0,在 f 20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，棄除清液，收集固體沉 淀；
[0148] 5)加入50倍的去離子水（含0.1 %的曲拉通X-100)攪拌，調pH值為3.0,在 f 20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，棄除清液，收集固體沉 淀，得沉淀約2公斤；
[0149] 6)步驟5)的沉淀加100升的8M尿素（含ImMBeta-巰基乙醇）溶液，攪拌2小時 使蛋白變性溶解；
[0150] 7)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，收集澄清液體，棄除產生的少量 黑色沉淀雜質；
[0151] 8)澄清液體轉移到攪拌罐中，用自制多孔噴頭邊攪拌邊加入300升去離子水，每 孔流速為5mL/分；
[0152] 9)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，收集澄清液體；
[0153] 10)用截留分子量為20000道爾頓的超濾機濃縮到40升；
[0154] 11)加入400升去離子水，重復步驟10)6次以上，再加入去離子水到400升；
[0155] 12)用截留分子量為30000道爾頓的超濾機超濾，收集穿過液；
[0156] 13)用截留分子量為20000道爾頓的超濾機濃縮，到20升；
[0157] 14)用除菌過濾機除菌，冷凍干燥，分裝得成品約1000克。
[0158] 實施例3
[0159] 1)新鮮發(fā)酵獲得的重組人BMP-2大腸桿菌細胞10公斤，加入800升去離子水，攪 拌均勻，于高壓勻漿機中，在=l〇°C條件下進行破菌；
[0160] 2)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，棄除清液，收集固體沉淀約0. 6 公斤；
[0161] 3)將沉淀轉移至攪拌罐中。加入300升的去離子水（含0. 1%的曲拉通X-100) 攪拌，調pH值為7.0,在=20°C攪拌2小時；
[0162] 4)加入50倍的去離子水（含0.1 %的曲拉通X-100)攪拌，調pH值為7.0,在 f 20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，棄除清液，收集固體沉 淀；
[0163] 5)加入50倍的去離子水（含0.1 %的曲拉通X-100)攪拌，調pH值為3.0,在 f 20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，棄除清液，收集固體沉 淀，得沉淀約4公斤；
[0164] 6)步驟5)的沉淀加200升的8M尿素（含ImMBeta-巰基乙醇）溶液，攪拌2小時 使蛋白變性溶解；
[0165] 7)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，收集澄清液體，棄除產生的少量 黑色沉淀雜質；
[0166] 8)澄清液體轉移到攪拌罐中，用自制多孔噴頭邊攪拌邊加入600升去離子水，每 孔流速為5mL/分；
[0167] 9)用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，收集澄清液體；
[0168] 10)用截留分子量為20000道爾頓的超濾機濃縮到80升；
[0169] 11)加入800升去離子水，重復步驟10)6次以上，再加入去離子水到800升；
[0170] 12)用截留分子量為30000道爾頓的超濾機超濾，收集穿過液；
[0171] 13)用截留分子量為20000道爾頓的超濾機濃縮，到20升；
[0172] 14)用除菌過濾機除菌，冷凍干燥，分裝得成品約2000克。
[0173] 本發(fā)明的方法操作簡單，生產成本低廉，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產，實現了低成本 生產重組人生長激素的工藝方法。離心和過濾所得到的濾液由于不含有任何有害物質，不 會污染環(huán)境。本工藝幾乎不產生固形廢棄物，沒有固型垃圾。復性過程所產生尿素，可以回 收，用于植物肥料。
[0174] 本發(fā)明不局限在本申請中描述的特定實施方式，用作本發(fā)明的單獨的方面的單一 說明。本領域技術人員將理解，可以不脫離本申請的精神和范圍的情況下進行各種修改和 改動。實際上，用于實施本發(fā)明的所述模式的各種修改對于生物化學和生物工程或相關領 域的技術人員來說都是顯而易見的，均應落入本發(fā)明權利要求書的范圍。
[0175] 根據以上描述，除了本文中列舉的以外，本公開的范圍內的功能上等同的用途對 于本領域的本領域技術人員而言是明顯的。這樣的改動和修改意欲落在所附權利要求的范 圍內。本公開僅受所附權利要求以及與這樣的權利要求的的范圍所等同的全部范圍限制。 應當理解，本公開不局限于特定的方法、試劑、組合物和生物系統(tǒng)，當然，所述方法、試劑、組 合物和生物系統(tǒng)可以變化。還可理解，本文中使用的術語僅用于描述特定的實施方式，不用 來是限制性的。
[0176] 本文所參考的或引用的所有專利、專利申請、在先申請和出版物通過引用而全文 并入本文，包括所有的附圖和表格，使得它們不與本說明書的明確教導相矛盾。在權利要求 范圍內提出其他的實施方式。
【權利要求】
1. 一種在大腸桿菌中以包涵體形式表達重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的制備方法，其包 括如下步驟：高壓勻漿破碎菌體細胞、漂洗包涵體和調節(jié)不同pH值、變性溶解所述包涵體 蛋白、所述包涵體蛋白控速復性、離心、超濾膜濃縮、過濾除菌、冷凍干燥制成成品步驟。
2. 如權利要求1所述的方法，其中，所述漂洗包涵體和調節(jié)不同pH值步驟是用含有 0. 1-5%的去污劑的去離子水和調節(jié)不同的pH值至2-10,漂洗包涵體3-5次。
3. 如權利要求2所述的方法，其中，所述去污劑為曲拉通X-100。
4. 如權利要求1所述的方法，其中，所述包涵體蛋白控速復性步驟為：添加水或緩沖液 降低尿素濃度來實施的。
5. 如權利要求1所述的方法，其中，所述尿素控速復性該包涵體蛋白步驟是通過控制 添加水或緩沖液的流速為l-l〇〇mL/分鐘來實現的。
6. 如權利要求1所述的方法，其中，所述尿素控速復性該包涵體蛋白步驟是通過控制 添加水或緩沖液的流速為5-20mL/分鐘來實現的。
7. 如上述權利要求所述的方法，其中，所述超濾膜濃縮的步驟是用截留分子量為 10000道爾頓-35000道爾頓的超濾膜進行反復超濾濃縮。
8. 如權利要求7所述的方法，其中，所述的方法包括的步驟如下： 1) 新發(fā)酵獲得的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2大腸桿菌細胞，于高壓勻漿機中，在S 10°C 條件下進行破菌； 2) 用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心0. 5-2小時，棄除清液，收集固 體沉淀； 3) 沉淀轉移至攪拌罐中，加入10-30倍含0. 1 %的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調 pH值為8. 5-10. 0,在蘭20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心， 離心0. 5-2小時，棄除清液，收集固體沉淀； 4) 加入10-100倍含0. 1 %的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調pH值為6. 0-8. 5,在 蘭20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心0. 5-2小時，棄除 清液，收集固體沉淀； 5) 加入10-100倍含0. 1 %的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調pH值為2. 0-6. 0,在 蘭20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心 0. 5-2小時，棄除清液，收集固體沉淀； 6) 步驟4)的沉淀加沉淀體積重量比20-80倍的含ImM Beta-巰基乙醇的8M尿素溶 液，攪拌2-4小時使蛋白變性溶解； 7) 用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心0. 5-2小時，收集澄清液體，棄 除產生的少量黑色沉淀雜質； 8) 澄清液體轉移到攪拌罐中，邊攪拌邊加入3倍體積的去離子水，添加去離子水的流 速為2-20mL/分鐘，最后尿素濃度降為2M ; 9) 用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心0. 5-2小時，收集澄清液體； 10) 用截留分子量為1000-26000道爾頓的超濾機濃縮，到1/5-1/10體積； 11) 加入去離子水到原體積，重復步驟11)6次以上，再加入去離子水到原體積； 12) 用截留分子量為26000-35000道爾頓的超濾機超濾，收集穿過液； 13) 用截留分子量為1000-26000道爾頓的超濾機濃縮，到1/10-1/50體積；14)用除菌 過濾機除菌，冷凍干燥，分裝得成品。
9. 如權利要求8所述的方法，其中，所述的方法包括的步驟如下： 1) 新發(fā)酵獲得的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2大腸桿菌細胞，于高壓勻漿機中，在S 10°C 條件下進行破菌； 2) 用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心45分鐘，棄除清液，收集固體沉 淀； 3) 沉淀轉移至攪拌罐中，加入10-30倍含0. 1 %的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調 pH值為9. 0,在=20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心 0. 5-2小時，棄除清液，收集固體沉淀； 4) 加入10-100倍含0. 1 %的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調pH值為6. 5-7. 5,在 f 20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心1小時，棄除清 液，收集固體沉淀； 5) 加入10-100倍含0. 1%的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調pH值為3. 0,在蘭20°C 攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心0. 5-2小時，棄除清液， 收集固體沉淀； 6) 步驟4)的沉淀加沉淀體積重量比20-80倍的含ImM Beta-巰基乙醇的8M尿素溶 液，攪拌2-4小時使蛋白變性溶解； 7) 用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心30分鐘，收集澄清液體，棄除產 生的少量黑色沉淀雜質； 8) 澄清液體轉移到攪拌罐中，邊攪拌邊加入3倍體積的去離子水，添加去離子水的流 速為2-20mL/分鐘，最后尿素濃度降為2M ; 9) 用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心1小時，收集澄清液體； 10) 用截留分子量為20000道爾頓的超濾機濃縮，到1/5-1/10體積； 11) 加入去離子水到原體積，重復步驟11)6次以上，再加入去離子水到原體積； 12) 用截留分子量為30000道爾頓的超濾機超濾，收集穿過液； 13) 用截留分子量為20000道爾頓的超濾機濃縮，到1/10-1/50體積； 14) 用除菌過濾機除菌，冷凍干燥，分裝得成品。
10. 如權利要求9所述的方法，其中，所述的方法包括的步驟如下： 1) 新發(fā)酵獲得的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2大腸桿菌細胞，于高壓勻漿機中，在S 10°C 條件下進行破菌； 2) 用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心45分鐘，棄除清液，收集固體沉 淀； 3) 沉淀轉移至攪拌罐中，加入20倍含0. 1 %的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調pH 值為9. 0,在蘭20°C攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心1小 時，棄除清液，收集固體沉淀； 4) 加入10-100倍含0. 1%的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調pH值為7.0,在蘭20°C 攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心1小時，棄除清液，收集 固體沉淀； 5) 加入10-100倍含0. 1%的曲拉通X-100的去離子水攪拌，調pH值為3. 0,在蘭20°C 攪拌2小時，用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心1小時，棄除清液，收集 固體沉淀； 6) 步驟4)的沉淀加沉淀體積重量比20-80倍的含ImM Beta-巰基乙醇的8M尿素溶 液，攪拌2-4小時使蛋白變性溶解； 7) 用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心30分鐘，收集澄清液體，棄除產 生的少量黑色沉淀雜質； 8) 澄清液體轉移到攪拌罐中，邊攪拌邊加入3倍體積的去離子水，添加去離子水的流 速為5mL/分鐘，最后尿素濃度降為2M ; 9) 用螺罐式連續(xù)高速離心機15000轉/分鐘離心，離心1小時，收集澄清液體； 10) 用截留分子量為20000道爾頓的超濾機濃縮，到1/8體積； 11) 加入去離子水到原體積，重復步驟11)6次以上，再加入去離子水到原體積； 12) 用截留分子量為30000道爾頓的超濾機超濾，收集穿過液； 13) 用截留分子量為20000道爾頓的超濾機濃縮，到1/20體積； 14) 用除菌過濾機除菌，冷凍干燥，分裝得成品。
【文檔編號】C07K14/51GK104151419SQ201410405887
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月15日 優(yōu)先權日:2014年6月17日
【發(fā)明者】劉爽, 鄧小霞, 龐玉, 王子華, 孫曉悅 申請人:吉林省金梓源生物科技有限公司