專利名稱：一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性制劑及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (OP-l/BMP-7)的可溶制劑及應(yīng)用，尤其涉及一 種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (rhOP-l/rhBMP-7)的可溶性制劑及其作為治療腎臟疾病和 血管鈣化，以及腦中風(fēng)、肝和肺纖維化藥物的辟用。屬生物技術(shù)制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (bone morphogenetic protein BMP"7， BMP-7)又名成骨蛋白 -1 (osteogenic protein, OP-1)，屬于BMPs家族中的一員，同屬轉(zhuǎn)化生長因子-P (TGF-P)超家族中的成員，具有強(qiáng)大的骨誘導(dǎo)活性。對它的成骨作用有大量研究，臨床上已 將BMP-7用于骨缺損和脊柱融合的治療研究。同時，BMP-7還是腎臟發(fā)育的重要誘導(dǎo)因子，在胚胎期腎臟全程表達(dá)，BMP-7基因 敲除的小鼠由于腎形成障礙，出生時即有腎發(fā)育不良/腎囊腫，出生后第一周即因尿毒 癥死亡。BMP-7的主要功能是維持腎小管上皮細(xì)胞分化和組織細(xì)胞凋亡，其作用一是通 過防止TGF- P 1介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞急性的破壞來維持腎小管上皮細(xì)胞的成熟及功能 狀態(tài)；另一方面，通過抑制前炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，減少炎癥細(xì)胞的積聚以防止腎纖維 化。BMP-7在腎臟疾病治療中可以增強(qiáng)腎功能，改善組織學(xué)參數(shù)，減少腎小球嚴(yán)重，穩(wěn) 定腎血流，增加動物生存率。在多種腎臟疾病模型中，BMP-7可以防止腎小管間質(zhì)纖維 化，減少腎小球硬化及改善糖尿病腎病動物模型的腎功能。此外，BMP-7可防止血管的 增殖紊亂，有助于維持血管的完整性。因此，BMP-7對于慢性腎病的主要并發(fā)癥，包括 腎性骨營養(yǎng)不良和血管鈣化均有療效。新近研究表明，人成骨蛋白-l(hOP-l)能產(chǎn)生顯 著的抗缺血效應(yīng)。目前市場上已經(jīng)有BMP-7埋植劑(OP-1 Implant)和BMP-7泥灰(OP-1 Putty)兩 種劑型，分別用于治療骨缺損和脊柱修補(bǔ)。BMP-7埋植劑(0P-1 Implant)是美國Stryker Biotech公司開發(fā)的制劑，其處方是將rhBMP-7與牛膠原復(fù)合制備成滅菌干粉。后來 Stryker Biotech公司又開發(fā)了 OP-1 putty,作為后外測(橫突間)腰椎融合術(shù)的載體 材料，OP-1 putty由rhBMP-7、牛骨I型-膠原基質(zhì)和羧甲基纖維素(CMC)等組分制成。 然而除上述的劑型外，目前劑型開發(fā)所遇到的問題是雖然真核哺乳動物表達(dá)的BMP-7 可溶，但是其溶解度極低，由于其分子的溶解度小，不易溶解，阻礙了其他劑型的發(fā)展 和臨床的應(yīng)用。發(fā)明內(nèi)容針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性 制劑及其作為治療腎臟疾病和血管鈣化，以及腦中風(fēng)、肝和肺纖維化藥物的應(yīng)用。本發(fā)明所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性制劑，其特征是，所述可溶性制劑以1000ml 體積量計，含如下重量的主、輔料骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 10mg 500mgL-精氨酸 蛋白穩(wěn)定劑 注射用水 或者骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7尿素蛋白穩(wěn)定劑 注射用水 或者 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7尿素L-精氨酸蛋白穩(wěn)定劑注射用水34. 84g 69.68g0g 100g 加至總體積為1000ml:10mg 500mg30g 120g0g 100g加至總體積為lOOOml;10mg 500mg 30g 120g 34.84g 69.68g Og 100g加至總體積為1000ml,上述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性制劑進(jìn)一步優(yōu)選的方式是所述可溶性制劑以 1000ml體積量計，含如下重量的主、輔料骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 L-精氨酸 蛋白穩(wěn)定劑 注射用水 或者 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7尿素蛋白穩(wěn)定劑 注射用水 或者 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7尿素L-精氨酸蛋白穩(wěn)定劑注射用水100mg 300mg 47g 57g 20g 70g加至總體積為1000ml;100rag 300mg 40g 80g20g 70g 加至總體積為1000ml:100mg 300mg 40g 80g 47g 57g 20g 70g加至總體積為1000ml。上述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性制劑最優(yōu)選的方式是所述可溶性制劑以1000ml 體積量計，含如下重量的主、輔料骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 200mg 300mg 尿素 60g 70g L-精氨酸 50g 55g 蛋白穩(wěn)定劑 40g 60g 注射用水 加至總體積為1000ml。上述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7是指經(jīng)動物組織提取的BMP-7或基因工程制備的重組人骨 形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (rhBMP-7)或與人BMP-7序列類同且其完整序列相似度不低于60%的各 種基因重組人BMP-7;所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7是單體分子或是其二聚體分子或者它們的 混合物，其中混合物中二聚體比例不低于50%，或者是BMP-7與BMP-4、 BMP-5或BMP-6 等比例混合的雜合二聚體。其中所述重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7可以是本領(lǐng)域人員共知的哺乳動物細(xì)胞(如CHO, COS or BSC等)的表達(dá)產(chǎn)物，也可以是酵母等真菌的表達(dá)產(chǎn)物，也可以是原核細(xì) 胞如大腸桿菌、枯草桿菌等的表達(dá)產(chǎn)物；所述重組人rhBMP-7純度為95%以上，其氨基 酸序列如SEQ ID NO. 1所示。上述蛋白穩(wěn)定劑是指人血清白蛋白、組織纖維蛋白原、甘露醇之一或它們的等比例 混合物。其中，所述蛋白穩(wěn)定劑優(yōu)選指人血清白蛋白。 上述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性制劑優(yōu)選是注射劑或凍干粉針劑。本發(fā)明所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性制劑的制備方法，其步驟是按處方量稱取尿素或L-精氨酸，配成濃度為0. 5 2.0 M/L的尿素溶液(pH 3. 5-7. 4) 或濃度為0. 2 0. 4M/L的L-精氨酸溶液(調(diào)pH=3. 5-7. 4),或配成0. 5~2. 0 M/L的尿 素溶液與0. 2~0. 4M/L的L-精氨酸溶液的任意體積比的混合液;將處方量的骨形態(tài)發(fā)生 蛋白-7 (BMP-7)加入上述溶液中，同時按處方量加入或不加蛋白穩(wěn)定劑(血清白蛋白、 組織纖維蛋白原或甘露醇)，然后用相應(yīng)種類和濃度的上述溶液定容至1000毫升，使 BMP-7的最終濃度為0.01 0.5mg/ml (10. 0 500u g/ml);然后經(jīng)去熱源、過濾除菌， 分裝成臨床常用劑量的瓶裝注射劑(規(guī)格50lig/瓶300ug/瓶lmg/瓶3rag/瓶；5mg/ 瓶;10mg/瓶)，或者以常規(guī)方法進(jìn)一步冷凍干燥，制得骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的凍干粉針劑。 粉針劑在使用時以蒸餾水或者以生理鹽水溶解使用。本發(fā)明所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性制劑的制備中，將BMP-7與蛋白助溶劑(如 氨基酸、尿素或表面活性劑)混合處理，也可以加入各種蛋白穩(wěn)定劑(如人血清白蛋 白、組織纖維蛋白原、甘露醇)，即可獲得可溶性BMP-7制劑。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明的rhBMP-7可溶性制劑具有溶解度高，在血清中無沉淀產(chǎn)生的特 點(diǎn)，其濃度達(dá)可達(dá)到0.2-1. Orag/ml。本發(fā)明所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性制劑經(jīng)小 鼠毒性實(shí)驗(yàn)沒有發(fā)現(xiàn)致死、過敏、血管刺激性等毒副作用。本發(fā)明所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性制劑作為治療腎臟疾病和血管鈣化，以及骨 質(zhì)疏松、腦中風(fēng)、肝和肺纖維化藥物的應(yīng)用。在臨床上，本發(fā)明的BMP-7制劑可用于治療腎臟疾病和血管鈣化，也可以用于骨質(zhì) 疏松、腦中風(fēng)恢復(fù)、肝和肺纖維化的預(yù)防和治療。其中具體治療的腎臟疾病包括腎移植、 糖尿病腎病、腎毒性血清腎炎、遺傳性腎病、高血壓腎病、腎小球腎病、腎肥大、腎衰 等。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性制劑對腎衰模型動物的尿 素氮、肌酐、尿酸等實(shí)驗(yàn)檢測具有明顯的腎功能保護(hù)作用(見附圖1 3)。


圖l rhBMP-7可溶性制劑對模型動物的尿素氮清除作用。 圖2 rhBMP-7可溶性制劑對模型動物的肌酐清除作用。 圖3 rhBMP-7可溶性制劑對模型動物的尿酸清除作用。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l取純化的哺乳動物細(xì)胞CH0表達(dá)的重組人rhBMP-7 (純度達(dá)95%以上)300 mg加入 至0. 3M/L的L-精氨酸溶液(調(diào)pH-6.5)中，用相同濃度的L-精氨酸溶液定容至1000 毫升，使BMP-7的最終濃度為0.3 mg/ral，然后經(jīng)去熱源、過濾除菌，分裝成臨床常用 劑量的瓶裝注射劑(3mg/瓶)。臨床應(yīng)用方法各種腎臟疾病以300 400ug重組人rhBMP"7/kg'體重的劑量，每 周2-3次，連續(xù)給藥2-12周。同時檢測尿量、血肌酑、尿酸等指標(biāo)。實(shí)施例2按如下處方量取各組分骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 200mg尿素 60gL-精氨酸 50g血清白蛋白 40g用注射用水溶解上述組分，然后定容至1000毫升(pH7.0)，使BMP-7的最終濃度 為0.2 mg/ml (200" g/ml);然后經(jīng)去熱源、過濾除菌，以常規(guī)方法冷凍干燥，制得骨 形態(tài)發(fā)生蛋白-7的凍干粉針劑。上述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7是指純度為95%以上由哺乳動物細(xì)胞COS表達(dá)的重組人 rhBMP-7，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。腎臟疾病應(yīng)用方法粉針劑在使用時以蒸餾水或者以生理鹽水溶解使用。以300~400ug重組人 rhBMP-7/kg體重的劑量，每周2-3次。連續(xù)給藥2-12周。同時檢測尿量、血肌酐、尿 酸等指標(biāo)。實(shí)施例3取純化的原核細(xì)胞表達(dá)的重組人rhBMP-7 (純度達(dá)到97%以上)300呢加入至0. 3M/L 精氨酸溶液中(pH6.8-7.4)，用相同濃度的精氨酸溶液定容至1000亳升，使BMP-7的 最終濃度為0. 3 mg/ml (300ug/ml)，然后經(jīng)去熱源、過濾除菌，可分別分裝成50ug/ 瓶；300ug/瓶；lmg/瓶；3mg/瓶；5mg/瓶；10mg/瓶的注射劑。實(shí)施例4按如下處方量稱取各組分骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 300mg 尿素 120g組織纖維蛋白原 70g 按處方量稱取尿素，用注射用水先配成2M/L尿素溶液(pH7.4);將處方量的骨形 態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)加入上述溶液中，同時按處方量加入組織纖維蛋白原，然后用 上述尿素溶液定容至1000毫升，使BMP-7的最終濃度為0.3mg/ml;然后經(jīng)去熱源、過 濾除菌，分裝成臨床常用劑量的瓶裝注射劑(規(guī)格50ng/瓶；300ug/瓶lmg/瓶3mg/ 瓶5mg/瓶;10mg/瓶)，或者以常規(guī)方法進(jìn)一步冷凍干燥，制得骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的凍 干粉針劑。粉針劑在使用時以蒸餾水或者以生理鹽水溶解使用。實(shí)施例5按如下處方量稱取各組分 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 lOOmg L-精氨酸 47g 甘露醇 20g 按處方量稱取L-精氨酸，用注射用水配成L-精氨酸溶液(調(diào)p^5.70),將處方量 的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (BMP-7)加入上述溶液中，同時按處方量加入甘露醇，然后用上 述L-精氨酸溶液定容至1000毫升，使BMP-7的最終濃度為0.1呢/1111,然后經(jīng)去熱源、 過濾除菌，以常規(guī)方法冷凍干燥，制得骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的凍干粉針劑。 粉針劑在使用時以蒸餾水或者以生理鹽水溶解使用。序列表〈110〉山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心<120>—種骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性制劑及應(yīng)用<141〉 2008-5-5<160> 1<210〉 1<211〉 431<212〉 PRT<213〉骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein) <221>重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (rhBMP-7) <222〉 (1)…(431)<400> 1 Met His ValArg Ser Leu Arg Ala Ala Ala Pro His Ser Phe510Ala Leu Trp Ala Pro Leu Phe Leu Leu Arg Ser Ala Leu Ala 20 25Glu Val His Ser Ser Phe lie His ArgPhe Ser Leu Leu Arg Ser lie Leu Gly His Asn SerAsp Asn 35Gin Glu Arg Arg Glu 50Leu Pro His Arg Pro 65Ala Pro Met Phe Met Leu 8040Met Gin Arg Glu lie Leu 55Arg Pro His Leu Gin Gly70Asp 85LeuTyr Asn Gly PhePro Tyr Lys Leu Gin Asp110Ser His Phe Leu Thr125Phe Val Asn Leu Val Glu His Asp 140Asp Lys115 Ala 130 Glu 145AlaSerAla Val Glu Glu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Gin 95 100 Ala Val Phe Ser Thr Gin Gly Pro Pro Leu AlaAsp Met Val MetPhe Phe His ProVal15Asp30Arg45Ser60Lys75Met90Tyr105Ser120Ser135Arg150Arg Glu Phe Arg Phe Asp Leu Ser Lys lie160Ala Ala Glu Phe Arg lie Tyr LysTyr His His Arg Glu Phe Arg Phe Asp Leu Ser Lys lie Pro Gly Glu Alalie Arg Glu Arg Phe Asp Asn Glu Thr Phe Arg lie Ser ValValGin Val Leu Gin Leu Asp Ser Arg Phe Asp lie ThrSer lie Asn ProGin Asn Lys Gin Pro PheVal His Phe Arg SerGin Asn Arg Ala Asn ValGlu 155 Thr 170 Phe 185 Glu 200 Thr 215 Ala 230 Leu 245 Lys 260 Pro 275 Ser 290 Lys 305 Glu 320 Leu 335 Ala 350 Phe 365 Gin 380 Cys 395HisLeuLeu Gly Trp AlaArg Glu SerSer Glu GluThr Ser Asn His Trp Val Val Asn ProLeulieThrAla Glu AsnAla Gly Met Val Arg Ser ^ro Lys Ser SerLeu lie GlyHis Asn Leu Gly Leu Gin Leu Ser Val Glu Thr Leu AspArg His Ala Phe Phe Lys Ala Lys GinArg GinGlu Uu Tyr Val Ser Phe Arg Asp Leu GlyTyr TyrLys Lys HisAsp Trp lie lie Ala Pro Glu Gly Tyr 350Gly Glu Cys Ala Phe Pro Leu Asn Ser His Ala lie Val Gin Thr Leu Val HisVal Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gin Leu Asn Ala lieLeu 160 Arg 175 Phe 190 Glu 205 Glu 220 Trp 235 Glu 250 lie 265 Phe 280 Gly 295 Gin 310 Asp 325 Arg 340 Ala 355 Tyr 370 Phe 385 Gin 400AspAsp Leu Gly TrpPheLeuGly Gly ThrThr Gly Ser Lys Gin Arg Asn Gin Glu Ala Leu ArgSer Asp GinAlaAla Trp CysMet Asn Ala Thrlie Asn Pro GluGlu 165 Tyr 180 Tyr 195 teu 210 Val 225 Arg 240 Gin 255 Pro 270 Glu 285 Ser 300 Met 315 Cys 330 Gin 345 Glu 360 Asn 375 Thr 390 Ser 405Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val lie Leu Lys Lys Tyr 410 415 420Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His 425 430
權(quán)利要求
1.一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性制劑，其特征是，所述可溶性制劑以1000ml體積量計，含如下重量的主、輔料骨形態(tài)發(fā)生蛋白-710mg～500mgL-精氨酸34.84g～69.68g蛋白穩(wěn)定劑 0g～100g注射用水加至總體積為1000ml或者骨形態(tài)發(fā)生蛋白-710mg～500mg尿素30g～120g蛋白穩(wěn)定劑 0g～100g注射用水加至總體積為1000ml；或者骨形態(tài)發(fā)生蛋白-710mg～500mg尿素30g～120gL-精氨酸34.84g～69.68g蛋白穩(wěn)定劑 0g～100g注射用水加至總體積為1000ml。
2.如權(quán)利要求1所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性制劑，其特征是，所述可溶性制劑 以1000ml體積量計，含如下重量的主、輔料 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 100mg 300mg47g 57g 20g 70g加至總體積為1000ml;L-精氨酸 蛋白穩(wěn)定劑 注射用水 或者骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7尿素蛋白穩(wěn)定劑 注射用水 或者骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7尿素L-精氨酸 蛋白穩(wěn)定劑 注射用水100mg 300mg 40g 80g20g 70g 加至總體積為1000ml;100mg 300mg 40g 80g 47g 57g 20g 70g加至總體積為1000ml。
3.如權(quán)利要求2所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性制劑，其特征是，所述可溶性制劑 以1000ml體積量計，含如下重量的主、輔料 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 200mg 300mg 尿素 60g 70g L-精氨酸 50g 55g蛋白穩(wěn)定劑 40g 60g注射用水 加至總體積為1000ml。
4. 如權(quán)利要求1 3之一所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性制劑，其特征是，所述骨形 態(tài)發(fā)生蛋白-7是指經(jīng)動物組織提取的BMP-7或基因工程制備的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白 -7或與人BMP-7序列類同且其完整序列相似度不低于60%的各種基因重組人BMP-7;所 述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7是單體分子或是其二聚體分子或者它們的混合物,其中混合物中二 聚體比例不低于50%,或者是BMP-7與BMP-4、BMP-5或BMP-6等比例混合的雜合二聚體。
5. 如權(quán)利要求4所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性制劑，其特征是，所述骨形態(tài)發(fā)生 蛋白-7是指純度為95^以上由哺乳動物細(xì)胞CHO、 COS或BSC表達(dá)的重組人rhBMP-7, 其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
6. 如權(quán)利要求4所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性制劑，其特征是，所述骨形態(tài)發(fā)生 蛋白-7是指純度為95%以上由酵母細(xì)胞、大腸桿菌或枯草桿菌表達(dá)的重組人rhBMP-7， 其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
7. 如權(quán)利要求1 3之一所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性制劑，其特征是，所述蛋白 穩(wěn)定劑是指人血清白蛋白、組織纖維蛋白原、甘露醇之一或它們的等比例混合物。
8. 如權(quán)利要求7所述一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性制劑，其特征是，所述蛋白穩(wěn) 定劑是指人血清白蛋白。
9. 如權(quán)利要求1 3之一所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性制劑，其特征是，所述可溶 性制劑是注射劑或凍干粉針劑。
10. 權(quán)利要求1 3之一所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性制劑作為治療腎臟疾病和血 管鈣化，以及骨質(zhì)疏松、腦中風(fēng)、肝和肺纖維化藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性制劑，含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7、L-精氨酸或/和尿素、蛋白穩(wěn)定劑及注射用水；具有溶解度高，在血清中無沉淀產(chǎn)生的特點(diǎn)，其濃度達(dá)可達(dá)到0.2-1.0mg/ml。本發(fā)明所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的可溶性制劑在臨床上可用于治療腎臟疾病和血管鈣化，也可以用于治療腦中風(fēng)恢復(fù)、肝和肺纖維化的治療。
文檔編號A61P9/14GK101269213SQ20081001587
公開日2008年9月24日 申請日期2008年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月9日
發(fā)明者翠 張, 王世立, 王素紅, 葛魯娜, 遲名峰, 韓金祥 申請人:山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心