專利名稱：制備重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白－7成熟肽二聚體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體說，涉及在原核細(xì)胞，尤其是在大腸桿菌中大量制備，并得到有高度生物學(xué)活性的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7成熟肽二聚體的方法背景技術(shù)骨科疾患是困擾人類的常見病，無論在平時的交通或工傷事故，還是在戰(zhàn)傷事件中都占有很大比例。人類社會的老齡化，使得防治骨質(zhì)疏松等因素造成的骨科疾病成為受到各方面嚴(yán)重關(guān)注的問題。而牙病更是貫穿人的一生的疾患，特別是經(jīng)歷歲月的研磨，牙本質(zhì)缺損帶來的苦痛，令人心悸。所以，在醫(yī)務(wù)工作者和制藥行業(yè)的迫切期待下，生物技術(shù)工作者已經(jīng)在用新技術(shù)和新方法研制治療骨科與齒科疾病的藥物。
骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)是具有異位成骨作用的一種生長因子。自1965年美國的Urist發(fā)現(xiàn)BMP以來，迄今已經(jīng)成功地克隆了19種左右的人BMP基因，為研制新的骨科治療藥物創(chuàng)造了條件。其中，BMP-7不僅有促使骨骼生長的作用，還有促進(jìn)牙本質(zhì)生長的功能。因此，它在骨科和牙科疾病的治療中有特殊的地位。
大量研究證明，在人細(xì)胞中BMP-7是以由431個氨基酸殘基組成的前肽原形式存在的。在其成熟過程中，這個前體分子被真核細(xì)胞的特殊裂解酶剪切為292個氨基酸殘基的前原區(qū)和139個氨基酸殘基的成熟肽片段。研究還發(fā)現(xiàn)，包括BMP-7在內(nèi)的BMP蛋白必須形成同源或異源二聚體，并且只有它們的二聚體才有活性，單體是沒有生物學(xué)活性的。只有真核細(xì)胞才含有Furin酶，所以只有將全長的BMP-7基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，才能產(chǎn)生成熟的BMP-7蛋白質(zhì)。迄今為止，用生物技術(shù)生產(chǎn)人BMP-7只有在真核細(xì)胞系統(tǒng)中才獲得成功，使得制備這個產(chǎn)品的成本很高，產(chǎn)量也受到限制。如用原核生物系統(tǒng)制備出有生物活性的人BMP-7，就能大大地降低成本，簡便操作過程和提高產(chǎn)量，這是一個極其吸引人的研究課題。雖然早就有人，如我國著名的生物學(xué)家侯云德先生等，首先在大腸桿菌中表達(dá)了人BMP-7的成熟肽，但是，所得到的是單體，而表現(xiàn)不出生物學(xué)活性。所以，只有用大腸桿菌產(chǎn)生出有生物活性的BMP-7成熟肽二聚體，才能實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)有治療作用的價廉的人BMP-7，滿足臨床治療的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是要提供一種用大腸桿菌生產(chǎn)的有生物活性的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(rhBMP-7)成熟肽二聚體的方法。
本發(fā)明提供的方法包括以下步驟1)編碼rhBMP-7成熟肽的核甘酸序列SEQ ID NO.1，它具有SEQ ID NO.2蛋白質(zhì)序列；2)構(gòu)建含BMP-7基因的表達(dá)載體；3)將步驟2)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成能產(chǎn)生人BMP-7蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并對其進(jìn)行檢測；4)培養(yǎng)步驟3)中的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞；5)用物理方法或化學(xué)試劑裂解細(xì)胞，抽提重組蛋白質(zhì)，將單鏈BMP-7復(fù)性、分離、純化得到有生物活性的二聚體。
本發(fā)明編碼rhBMP-7成熟肽的核甘酸序列詳見SEQ ID NO.1，它具有SEQID NO.2蛋白質(zhì)序列對于編碼rhBMP-7成熟肽的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)，在第一個氨基酸密碼子之前加上了起始密碼子ATG和限制性內(nèi)切酶的識別位點，在最后一個氨基酸之后加上終止密碼子TAA和限制性內(nèi)切酶的識別位點，將編碼rhBMP-7成熟肽的核苷酸序列中真核細(xì)胞喜好，而大腸桿菌完全不用或極少使用的密碼子改變?yōu)榇竽c桿菌喜好的密碼子，本發(fā)明中，加在合成基因首、末兩端的限制性內(nèi)切酶識別位點可以是任意的II類限制性內(nèi)切酶識別位點。
本發(fā)明中，可選用與BMP-7基因上加的識別位點具有相同的限制性內(nèi)切酶識別位點的市售載體系統(tǒng)。
本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”為原核細(xì)胞，常用的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿菌，枯草桿菌等。
本發(fā)明中，用化學(xué)試劑裂解細(xì)胞的裂解液是5-7mol/L的鹽酸胍，50mmol/L的Tris和1mmol/L的EDTA，pH8-9。
本發(fā)明中將單鏈BMP-7復(fù)性所用的溶液為氧化還原劑——0.1-1mmol/L的氧化型谷胱甘肽/還原型谷胱甘肽；助溶劑——0.1-2mol/L的NaCl；金屬螯合劑——1-10mmol/L的EDTA和其他添加劑——0.5-5％左右的甘油，聚乙二醇等。
用本發(fā)明方法制備重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7成熟肽二聚體，可大大降低成本，提高產(chǎn)量，操作簡便。


圖1為含有合成的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7成熟肽基因的，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)型載體(pET 11b-BMP-7)圖2為pET 11b-BMP-7的NdeI和BamHI兩個限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，圖中M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1-10為不同的樣品；A、B分別為500bp、250bp分子量大小，C為載體片段(5.7Kb)，D為插入的基因片段(423bp)圖3為重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7單體的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖中M為分子量標(biāo)準(zhǔn)(從上到下依次為97.4，66，43，31，20.1和14.4Kd)，箭頭所指處為BMP-7單體。C為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的對照樣品，1-5為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的樣品。
圖4為重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7二聚體的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖中5為分子量標(biāo)準(zhǔn)(從上到下依次為97.4，66，43，31，20.1和14.4Kd)。1為純化后的BMP-7二聚體，2為BMP-7包涵體，3為誘導(dǎo)表達(dá)的BMP-7全菌蛋白，4為沒有插入目的基因的宿主菌蛋白，5為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，6為BMP-7復(fù)性蛋白，A為二體，B為單體。
圖5為在兩只小鼠肌袋內(nèi)植入重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7二聚體后形成的新骨。
具體實施例方式
以下具體實例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明范圍。
本發(fā)明的制備重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7成熟肽二聚體的方法，包括1)編碼rhBMP-7成熟肽的核甘酸序列SEQ ID NO.1，它具有SEQ ID NO.2蛋白質(zhì)序列；編碼rhBMP-7成熟肽核苷酸序列(SEQ ID NO.1)，在第一個密碼子之前加上了起始密碼子ATG和限制性內(nèi)切酶的識別位點，在最后一個氨基酸密碼子之后加上終止密碼子TAA和限制性內(nèi)切酶的識別位點；將編碼rhBMP-7成熟肽核苷酸序列中真核細(xì)胞喜好，而大腸桿菌完全不用或極少使用的密碼子改變?yōu)榇竽c桿菌喜好的密碼子，如脯氨酸的CCC；精氨酸的AGA，AGG和CGG；甘氨酸的GGA和GGG等加以改變，2)構(gòu)建含BMP-7基因的表達(dá)載體；用表達(dá)載體pET-11b，將合成的BMP-7基因，(起始端含Nde I酶切位點，終止端含Bam HI酶切位點)，與pET-11b分別經(jīng)Nde I和Bam HI雙酶切處理，酶切條件為37℃溫育3小時。然后將酶切產(chǎn)物用1～2％的瓊脂糖凝膠電泳，電泳20分鐘，電壓100伏。用Bio101凝膠回收DNA的試劑盒回收上述兩個DNA片段。其過程為用干凈手術(shù)刀切下目的片段，分別放入兩個1.5毫升離心管中。加200～500微升Nal，置于溫水(45～55℃)中至膠完全融化。將玻璃珠(Glassmilk，為Bi0101純化試劑盒中的商品)渦旋1分鐘，各取7微升加入上述兩管，放置5分鐘，每1-2分鐘混勻一次。將兩管在13000g下離心5秒。去上清，再將沉淀物重懸浮于500微升New Wash液。而后又在13000g下離心5秒。再去上清。重復(fù)上述步驟二次(重復(fù)懸浮，離心三次)。最后一次小心吸凈上清。在空氣中干燥5～10分鐘。將沉淀用17～50微升TE溶解，置于37℃水浴放置5分鐘。在13000g下離心2分鐘。小心吸出上清，分別移至兩個新的1.5ml離心管中。從上述兩管DNA中吸取適量加入一個1.5ml離心管中。其中包括DNA片段1～17微升，T4 DNA連接酶(MBI公司)1μl，10倍濃度DNA連接緩沖液2微升，加水至總體積為20微升?；靹蚝舐约与x心，于22℃進(jìn)行為時1小時的連接反應(yīng)。所構(gòu)建的pET-11b-BMP-7見附圖1。
3)將步驟2)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成能產(chǎn)生人BMP-7蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并對其進(jìn)行檢測；此例，制備宿主細(xì)胞是指采用分子克隆技術(shù)，以常規(guī)的氯化鈣方法制備大腸桿菌BL21(DE3)的感受態(tài)細(xì)胞。取上述2)步驟所得的連接反應(yīng)物10微升與感受態(tài)細(xì)胞100微升輕輕混勻，在冰上放置50分鐘，接著在42℃的水浴中放置90秒，再置冰浴1～2分鐘，然后加入0.8毫升的LB培養(yǎng)基，在37℃條件下溫浴60分鐘。隨后，將100微升被轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布到含有氨芐青霉素抗生素的LB平板上，將平板置于室溫下直至液體被吸收后，倒置平板，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～30小時后，即可出現(xiàn)重組菌的菌落，完成質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化；從轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌的固體平板上挑取單菌落，接種于裝有3毫升LB(含氨芐青霉素)培養(yǎng)液的試管中，在37℃溫度下中速振蕩培養(yǎng)10-16小時，再對收獲的菌體采用常規(guī)的堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA；此例抽提過程如下將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入1.5毫升離心管中，12000g離心30秒。棄上清，細(xì)菌沉淀略干燥。將沉淀重懸浮于100微升冰預(yù)冷的Sol I中，渦旋使沉淀分散完全。加入200微升新配的Sol II，顛倒6-8次，離心管置于冰上。再加150微升冰預(yù)冷的SolIII，顛倒6-8次。12000g離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清至一新的1.5毫升離心管中。加400微升酚氯仿溶液(酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1)，渦旋混勻，12000g離心5分鐘，轉(zhuǎn)移上清至一新的1.5毫升離心管中。加相當(dāng)于上清2-2.5倍體積的無水乙醇，顛倒混勻。12000g離心10分鐘。棄上清，加1毫升70％乙醇，12000g離心2分鐘。小心去上清，空氣干燥沉淀。用30微升含胰RNA酶(20微克/毫升)的TE重新溶解沉淀，經(jīng)37℃消化半小時后儲于-20℃?zhèn)溆?。溶液配?.Sol I125ml 200mmol/L葡萄糖，12.5ml 1mol/L Tris·Cl(pH8.0)，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容于500ml，高壓滅菌，終濃度50mM葡萄糖，25mM Tris·Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)。
2.Sol II10mol/L NaOH 60μl，10％SDS 300μl，ddH2O 2640μl或10mol/L NaOH 20μl，10％SDS 100μl，ddH2O 880μl3.Sol III(3mol/L NaAc(pH4.8))無水NaAc 24.6g，用70ml ddH2O溶解，用約20ml冰乙酸調(diào)pH至4.8，定容至100ml。
4.TE5ml 1mol/L Tris·Cl(pH8.0)，1ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容于500ml，高壓滅菌，終濃度10mM Tris·Cl(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0)。
將上述抽提的DNA用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，酶切溫度為30～37℃，酶切時間為1～3小時。正確重組子中應(yīng)當(dāng)含有400～500bp(BMP-7)及5～6kb(載體DNA)的酶切片段。凡能切出上述大小酶切片段的克隆即為轉(zhuǎn)化了新的基因(rhBMP-7)的克隆，構(gòu)建基因工程菌獲得成功。附圖2為其酶切鑒定圖，圖中M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1～10為不同的樣品；A、B分別為500bp、250bp分子量大小，C為載體片段(5.7Kb)，D為插入的基因片段(423bp)。
4)在適合表達(dá)人BMP-7蛋白成熟肽的條件下，培養(yǎng)步驟3)中的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞；在含葡萄糖的LB(含氨芐青霉素)培養(yǎng)基中培養(yǎng)基因工程菌按1％的接種量將基因工程菌接入5～10毫升的LB(含氨芐青霉素)培養(yǎng)基中，以轉(zhuǎn)速100～200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)2～3小時。培養(yǎng)溫度是30～32℃。
再按1％的比例，將培養(yǎng)物接種到含有200～500毫升LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，以200～300轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速，在30～32℃下將基因工程菌培養(yǎng)至OD600＝1.2～1.4，培養(yǎng)時間為10～12小時。然后，接入大罐中的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。接種量為5∶1(培養(yǎng)液∶種子液)，pH7.0，培養(yǎng)溫度為30～32℃，攪拌速度100～600轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)4個小時加入終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)3～4小時，然后在8000～10000轉(zhuǎn)/分離心收集菌體，聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定說明已經(jīng)產(chǎn)生該蛋白質(zhì)(見附圖3)，單鏈的BMP-7成熟肽占菌體總蛋白含量的30％以上，單鏈的BMP-7成熟肽占包含體總蛋白含量的85％以上。
5)用物理方法或化學(xué)試劑裂解細(xì)胞，抽提重組蛋白質(zhì)，將單鏈BMP-7復(fù)性、分離、純化得到有生物活性的二聚體；把收集的冷凍濕菌體按1∶5的比例加入Tris-Cl(50mmol/L)-EDTA(1mmol/L)緩沖液中攪拌溶解，加入1∶100的100mmol/L的PMSF使得終濃度為1mmol/L。經(jīng)超聲波破菌后離心收集沉淀，再用Triton X-100清洗一次，收集沉淀的包含體。然后用1mol/L的尿素再次清洗收集沉淀冷凍保存。其中Tris-EDTA緩沖液的pH為8.0。整個過程需要時間大約5～6小時，在4℃下進(jìn)行，離心轉(zhuǎn)速12500轉(zhuǎn)/分。將所得到的包含體置于裂解液(5-7mol/L的鹽酸胍，50mmol/L的Tris和1mmol/L的EDTA，pH8-9)中，在室溫下放置20分鐘，以裂解包含體；然后，稀釋到BMP-7的濃度約為10-100微克/毫升后進(jìn)行復(fù)性，使之形成二聚體。在稀釋液中加入0.1-1mmol/L的氧化型谷胱甘肽/還原型谷胱甘肽；0.1-2mmol/L的NaCl；1-10mmol/L的EDTA和0.5-5％的甘油等，然后，置于4-10℃(或在室溫)下過夜。隨時用非還原的SDS-PAGE檢測二聚體形成的情況。
在反應(yīng)后通過透析除去溶劑再經(jīng)層析柱純化即可得到純的本發(fā)明的產(chǎn)品重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7成熟肽二聚體(見圖4)。
生物學(xué)實驗證明用本發(fā)明方法制得的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7成熟肽二聚體，具有促進(jìn)骨修復(fù)的活性。在小鼠肌袋中植入含1毫克重組人BMP-7成熟肽二聚體的材料后，異位成骨量達(dá)到340-602毫克(見圖5)。
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的說明。SEQ ID NO.1的信息長度423bp類型脫氧核糖核酸鏈型單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型cDNA來源人工合成特征編碼人BMP-7成熟肽羧基端的139個氨基酸的序列SEQ ID NO.1(人BMP-7成熟肽的基因編碼序列)5’ ATG TCC ACT GGT AGC AAA CAG CGT TCT CAG AAC CGT TCCAAA ACG CCG AAA AAC CAG GAA GCC CTG CGT ATG GCT AAC GTTGCT GAA AAC AGC AGC AGC GAC CAG AAA CAG GCT TGC AAA AAACAC GAA CTG TAC GTT AGC TTC CGT GAC CTG GGT TGG CAG GACTGG ATC ATC GCT CCG GAA GGT TAC CAC GCT TAC TAC TGC GAAGGT GAA TGC GCT TTC CCG CTG AAC TCC TAC ATG AAC GCT ACTAAC CAC GCT ATC GTT CAG ACT CTG GTT CAC TTC ATC AAC CCG GAAACT GTT CCG AAA CCG TGC TGC GCT CCG ACT CAG CTG AAC GCTATC TCC GTT CTG TAC TTC GAC GAC AGC TCC AAC GTT ATC CTG AAAAAA TAC AGA AAC ATG GTT GTT CGT GCT TGC GGT TGC CAC TAG 3’SEQ ID NO.2的信息長度139個氨基酸類型氨基酸幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型多肽特征人BMP-7成熟肽羧基端的139個氨基酸殘基的序列SEQ ID NO.2(人BMP-7成熟肽的氨基酸殘基序列)MSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYHAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYEFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH
權(quán)利要求
1.一種制備重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7成熟肽二聚體的方法，其特征是該方法包括以下步驟1)編碼rhBMP-7成熟肽的核甘酸序列SEQ ID NO.1，它具有SEQ ID NO.2蛋白質(zhì)序列；2)構(gòu)建含BMP-7基因的表達(dá)載體；3)將步驟2)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成能產(chǎn)生人BMP-7蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并對其進(jìn)行檢測；4)培養(yǎng)步驟3)中的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞；5)用物理方法或化學(xué)試劑裂解細(xì)胞，抽提重組蛋白質(zhì)，將單鏈BMP-7復(fù)性、分離、純化得到有生物活性的二聚體。
2.按權(quán)利要求1所述的制備重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7成熟肽二聚體的方法，其特征是用化學(xué)試劑裂解細(xì)胞的裂解液是5-7mol/L的鹽酸胍，50mmol/L的Tris和1mmol/L的EDTA，pH8-9。
3.按權(quán)利要求1所述的制備重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7成熟肽二聚體的方法，其特征是將單鏈BMP-7復(fù)性所用的溶液為氧化還原劑——0.1-1mmol/L的氧化型谷胱甘肽/還原型谷胱甘肽；助溶劑——0.1-2mol/L的NaCl；金屬螯合劑——1-10mmol/L的EDTA和其他添加劑——0.5-5％左右的甘油，聚乙二醇等。
4.按權(quán)利要求1所述的制備重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7成熟肽二聚體的方法，其特征是所說的宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明提供的制備重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白－7成熟肽二聚體的方法包括以下步驟1)編碼rhBMP－7成熟肽的核甘酸序列SEQ ID NO.1，它具有SEQ ID NO.2蛋白質(zhì)序列；2)構(gòu)建含BMP－7基因的表達(dá)載體；3)將步驟2)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成能產(chǎn)生人BMP－7蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并對其進(jìn)行檢測；4)培養(yǎng)步驟3)中的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞；5)用物理方法或化學(xué)試劑裂解細(xì)胞，抽提重組蛋白質(zhì)，將單鏈BMP－7復(fù)性、分離、純化得到有生物活性的二聚體。用本發(fā)明方法制備重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白－7成熟肽二聚體，可大大降低成本，提高產(chǎn)量，操作簡便。
文檔編號C07K14/435GK1412200SQ01135658
公開日2003年4月23日 申請日期2001年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月12日
發(fā)明者徐放, 鄭仲承 申請人:杭州華東醫(yī)藥(集團(tuán))公司基因技術(shù)研究所