口蹄疫病毒a型抗原多肽、融合抗原多肽及疫苗的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及口蹄疫病毒抗原多肽、融合抗原多肽及疫苗，具體為口蹄疫病毒A型 抗原多肽，融合抗原多肽，以及含有上述抗原多肽和/或融合抗原多肽的口蹄疫病毒A型疫 苗。本發(fā)明還涉及上述抗原多肽，融合抗原多肽和疫苗的制備及其應用。
【背景技術】
[0002] 口蹄疫是由口蹄疫病毒所引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染的動物傳染病。 口蹄疫主要侵害偶蹄類動物，其臨床診斷特征為口腔粘膜、蹄部和乳房皮膚發(fā)生水皰。成年 動物感染口蹄疫后一般致死率不高但其發(fā)病率可達100 %，發(fā)病動物的口、蹄部會出現(xiàn)大量 水皰，精神沉郁，進而使得畜產(chǎn)量銳減。幼畜感染口蹄疫后則經(jīng)常會不見癥狀地猝死，嚴重 時致死率可達1〇〇%。由于口蹄疫傳播迅速、難于防治、補救措施少，因此每次爆發(fā)后只能屠 宰和集體焚毀染病牲畜以絕后患，從而給畜牧產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。
[0003] 口蹄疫病毒是口蹄疫的致病原，其屬于細小核糖核酸病毒，具有多血清型、高變異 性等特點。已知口蹄疫病毒目前有0、A、C、SAT1 (南非I型）、SAT2 (南非II型）、SAT3 (南 非III型）和Asial(亞洲I型）7個主要血清型。每種主型又分若干亞型，目前發(fā)現(xiàn)的亞 型已有70多種。口蹄疫病毒各型之間的抗原性常常不同，彼此之間不能交互免疫，而且在 同一種血清型中抗原變異的程度也很大，以至于能夠有效地抵抗一種亞型的口蹄疫疫苗可 能對同一血清型中的另一種亞型卻沒有保護。
[0004] 我國口蹄疫流行病學研究表明，我國目前處于流行病毒多元化時期，不同血清型， 不同遺傳譜系、不同進化階段的病毒混雜存在，各自循環(huán)，形成了復雜難解的防疫局面。
[0005] 20世紀我國A型口蹄疫疫情感染動物均為牛羊，未見豬發(fā)病的臨床案例。21世紀 以來我國發(fā)生了 3次A型FMD疫情。分別是2003年青海疫情、2009年武漢疫情、2013年廣 東疫情。前兩次疫情主要感染牛羊，偶爾有豬發(fā)病，而2013年首起疫情發(fā)生于豬場，其余 發(fā)生于牛。因此，本次流行毒株能感染豬。該毒株與歷史毒株AF/72同源率為81.6%;與 2009年武漢毒株同源率為91. 5% ;與2004年越南流行毒株同源率大于93. 7%，表明此次 A型FMD流行毒株由境外傳入。目前，我國A型口蹄疫的主要是亞洲型東南亞97 (Sea-97) 毒株，結合世界口蹄疫參考實驗室的分析結果，2008~2012年間，A型口蹄疫亞洲型流行毒 株可以分為2個進化分支，兩個分支間的流行毒株VP1序列同源性在90 %左右，同一分支內(nèi) 流行毒株VP1序列同源性在95%以上。國家口蹄疫參考實驗室分析認為，2009年以來我國 發(fā)生A型口蹄疫屬于G1分支，而新出現(xiàn)的廣東茂名豬A型口蹄疫病毒屬于G2分支。我國 周邊國家俄羅斯、哈薩克斯坦在2013年也報道發(fā)生了A型疫情。本次流行的A/Sea-97/G2 毒株對豬、牛都有致病性，且在牛上，毒力高于2009年湖北武漢A型流行毒株約10倍。目 前，我國尚且沒有針對豬A型口蹄疫的疫苗，為了防止新出現(xiàn)的A型口蹄疫流行毒株在我國 豬群中暴發(fā)，需要早做準備，盡快生產(chǎn)豬A型口蹄疫疫苗。
[0006] 國家口蹄疫參考實驗室分子流行病學監(jiān)測結果表明：當前在我國豬群中存在0型 和A型口蹄疫病毒，0型口蹄疫病毒主要有3個拓撲型毒株流行（圖1為我國0型口蹄疫毒 株遺傳分類地位），即新豬毒（分屬CATHAY拓撲型）、泛亞毒（分屬ME-SA拓撲型）和緬甸 98毒（分屬SEA拓撲型），A型口蹄疫病毒主要有1個拓撲型毒株流行（圖2為我國A型口 蹄疫病毒遺傳分類地位），即Asia型（亞洲型），代表毒株為A/GDMM/2013毒株。根據(jù)口蹄 疫病毒分子流行病學分析表明：口蹄疫〇型病毒中新豬毒譜系和泛亞譜系的核苷酸同源性 僅76~80 %，與Mya98譜系的核苷酸同源性僅在75~76 %，泛亞譜系和Mya98譜系的核苷 酸同源性在84~85%。這種狀況下很可能出現(xiàn)同型不同毒株之間的不能完全保護的變異 株，但對我國豬群中危害較大的是緬甸98毒（MYA98)。在此前的中國專利CN102180952A(其 申請日為2011年05月10日，發(fā)明名稱為"口蹄疫病毒A型抗原多肽、融合抗原多肽及疫 苗"）雖然公開了針對0/MYA98/BY/2010毒株設計的0型抗原多肽、融合抗原多肽及疫苗， 但該技術方案僅適用于應對0/MYA98/BY/2010毒株本身，加之FMDV血清型的多樣性造成了 疫苗在不同血清型病毒感染的動物之間沒有保護作用，口蹄疫病毒0型和A型毒株間沒有 交叉保護作用，所以〇型抗原多肽、融合抗原多肽及疫苗的公開完全不能對A型毒株抗原、 融合多肽及疫苗的研制帶來工作啟示。
[0007] 口蹄疫病毒的高異變性和各血清型之間通常不能相互免疫，所以給口蹄疫的防治 工作帶來巨大的困難。目前仍迫切需要提供對口蹄疫病毒具有良好免疫原性的疫苗，理想 的疫苗還應對多種不同亞型的口蹄疫病毒都具有良好的免疫原性，從而可以為牲畜提供廣 泛的免疫保護。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明涉及口蹄疫病毒A型抗原多肽，融合抗原多肽，以及含有上述抗原多肽和/ 或融合抗原多肽的口蹄疫病毒A型疫苗，該抗原多肽和疫苗可使宿主動物產(chǎn)生針對多種不 同譜系口蹄疫病毒的免疫原性，從而為宿主動物提供針對多種不同譜系口蹄疫病毒的免疫 保護。
[0009] 就本發(fā)明而言，術語"免疫"是指，以適宜的形式和通過適宜的途徑對宿主動物給 與某一抗原后，誘導宿主動物產(chǎn)生針對該抗原的特異性的細胞介導的和/或基于抗體的免 疫應答，例如，抗體和/或細胞因子的產(chǎn)生和/或細胞毒性T細胞、抗原呈遞細胞、輔助T細 胞、樹突細胞的活化，和/或其它細胞應答反應。
[0010] 就本發(fā)明而言，術語"免疫原性"是指一種或多種抗原誘導宿主動物產(chǎn)生針對該一 種或多種抗原的特異性的免疫反應的能力。
[0011] 就本發(fā)明而言，術語"抗原多肽"是指由兩個或兩個以上氨基酸通過肽鍵共價連接 形成的具有免疫原性的肽鏈結構。本發(fā)明的肽鏈結構可以是直鏈的，帶分支結構的，和/或 帶環(huán)狀結構的。
[0012] 就本發(fā)明而言，術語"疫苗"是指含有一種或多種具有機體免疫能力的抗原并被配 制成能向宿主動物給藥形式的制劑。將疫苗引入到宿主動物體內(nèi)后，該疫苗就能激發(fā)宿主 動物產(chǎn)生針對該一種或多種抗原的免疫反應。
[0013]就本發(fā)明而言，術語"宿主動物"是指能夠被口蹄疫病毒侵入并允許口蹄疫病毒在 其體內(nèi)復制的動物。在某些實施方式中，宿主動物是偶蹄動物。在某些實施方式中，宿主動 物是豬、牛、羊等家畜動物?？谔阋卟《驹谒拗鲃游镏械那秩牒蛷椭瓶赡苁顾拗鲃游锂a(chǎn)生口 蹄疫的臨床特征，也可能不使宿主動物產(chǎn)生任何臨床特征。
[0014] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：
[0015] 第一方面，本發(fā)明提供一種口蹄疫病毒A型抗原多肽，包含如SEQ ID N0 :1所示的 氨基酸序列：
[0016] SEQ ID NO dVal-Tyr-XfGly-XfSer-XfTyr-Ser-XfXs-Xfs-XfXs-Arg-Arg-Gly-A sp-X 9-Gly-X10-Leu-Ala-Ala-Arg-Xn-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-X12-Ser-Phe-Asn-X13-Gly-Ala -Ile-X14-Ala-Thr -X15-I 1θ；
[0017] 其中，)^=Asn或Ser;X2=Val或Cys或Thr;X3=Arg或Lys;X4=Ala或Thr; X5=Pro或Thr;X6_X7=Gin或Gly-Gly或Ala;X8=Asn或Gly或Thr;X9=Leu或Ser;X10=Ser或ProLeu或Val12=Cys或Ser或Ala13=Phe或Tyr14=Arg或 Gin;X15=Glu或Thr〇
[0018] 優(yōu)選地，所述口蹄疫病毒A型抗原多肽，包含SEQ ID N0:2至SEQ ID N0:40所示 的任一序列：
[0019] Val-Tyr-Ser-Gly-Cys-Ser-X3-Tyr-Ser-X 4-X5-X6-X7-X8-Arg-Arg-Gly-Asp-X 9-Gl y-X10-Leu-Ala-Ala-Arg-Xn-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Cys-Ser-Phe-Asn-X13-Gly-Ala-Ile-X 14-Ala-Thr-X 15_Ile(SEQ ID N0:2);其中，X3=Arg或Lys;X4=Ala或Thr;X5=Pro或 Thr ;X6_X7= Gin或Gly-Gly或Ala 8= Asn或Gly或Thr 9= Leu或Ser 10= Ser或 Pro ;Xn= Leu或Val 13= Phe或Tyr 14= Arg或Gin 15= Glu或Thr ;
[0020] Val-Tyr-Asn-Gly-X2-Ser-X3-Tyr-Ser-X 4-X5-X6-X7-X8-Arg-Arg-Gly-Asp-X 9-Gly-X10-Leu-Ala-Ala -Arg-Xn-Ala-Ala -Gin-Leu-Pro-X12 -Ser-Phe-Asn-X13 -Gly-Ala-1 le-X14-A la-Thr_X15-Ile ; (SEQ ID NO:3)，其中，X2= Val或Cys或Thr ;X 3= Arg或Lys ;X 4= Ala 或Thr ;X5= Pro或Thr 6_X7= Gin或Gly-Gly或Ala 8= Asn或Gly或Thr 9= Leu 或Ser ;X10= Ser或Pro n= Leu或Val 12= Ser或Ala 13= Phe或Tyr 14= Arg 或Gin ;X15= Glu或Thr ;
[0021] Val-Tyr-Ser-Gly-Cys-Ser-Lys-Tyr-Ser-Ala-Pr〇-Ala-Thr-Arg-Arg-Gly-Asp -Leu-Gly-Pr〇-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Cys-Ser-Phe-Asn-Phe-G ly-Ala-Ile-Arg-Ala-Thr-Glu-Ile(SEQ ID NO：4)；
[0022] Val-Tyr-Ser-Gly-Cys-Ser-Lys-Tyr-Ser-Ala-Pr〇-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Asp -Ser-Gly-Pr〇-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Cys-Ser-Phe-Asn-Phe-G ly-Ala-Ile-Arg-Ala-Thr-Glu-Ile(SEQ ID NO：5)；
[0023] Val-Tyr-Asn-Gly-Val-Ser-Arg-Tyr-Ser-Thr-Thr-Gly-Gly-Gly-Arg-Arg-Gly-A sp-Leu-Gly-Ser-Leu-Ala-Ala-Arg-Val-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Ser-Ser-Phe-Asn-Phe-Gl y-Ala-Ile-Gln-Ala-Thr-Thr-Ile(SEQ ID NO：6)；
[0024] Val-Tyr-Asn-Gly-Thr-Ser-Lys-Tyr-Ser-Ala-Pr〇-Ala-Thr-Arg-Arg-Gly-Asp -Leu-Gly-Ser-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Ala-Ser-Phe-Asn-Tyr-G ly-Ala-Ile-Arg-Ala-Thr-Glu-Ile(SEQ ID NO：7)；
[0025] Val-Tyr-Ser-Gly-Cys-Ser-X3-Tyr-Ser-X 4-X5-X6-X7-X8-Arg-Arg-Gly-Asp-X 9-Gly -X^-Leu-Ala-Ala-Arg-Xn-Ala-Ala-Gln-Leu-Pro-X^-Ser-Phe-Asn-X^-Gly-Ala-Ile-X!^ Ala-Thr_X 15-Ile;(SEQ ID N0:8);其中，X3=Arg或Lys;X4=Ala或Thr;X5=Pro或Thr; X6_X7= Gin或Gly-Gly或Ala ;X 8= Asn或Gly或Thr ;X 9= Leu或Ser ;X 10= Ser或Pro ; Xn= Leu或Val ;X 12= Cys或Ser或Ala ;X 13= Phe或Tyr ;X 14= Arg或Gin ;X 15= Glu或Thr；
[0026] Val-Tyr-Ser-Gly-X2-Ser-X3-Tyr-Ser-X 4-X5-X6-X7-X8-Arg-Arg-Gly-Asp-X 9-Gly-X10-Leu-Ala-Ala-Arg-Xn-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Cys-Ser-Phe-Asn-X13-Gly-Ala-Ile-X14-Ala-Thr_X 15-Ile;(SEQ ID N0:9);其中，X2=Val或Cys或Thr;X3=Arg或Lys;X4=Ala 或Thr ;X5= Pro或Thr 6_X7= Gin或Gly-Gly或Ala 8= Asn或Gly或Thr 9= Leu 或Ser ;X10= Ser或Pro n= Leu或Val 13= Phe或Tyr 14= Arg或Gin 15= Glu 或Thr ;
[0027] Val-Tyr-Asn-Gly-Val-Ser-X3-Tyr-Ser-X 4-X5-X6-X7-X8-Arg-Arg-Gly-Asp-X 9-Gly -X^-Leu-Ala-Ala-Arg-Xn-Ala-Ala-Gln-Leu-Pro-X^-Ser-Phe-Asn-X^-Gly-Ala-Ile-X!^ Ala-Thr_X 15-Ile(SEQ ID N0:10);其中，X3=Arg或Lys;X4=Ala或Thr;X5=Pro或Thr; X6_X7= Gin或Gly-Gly或Ala ;X 8= Asn或Gly或Thr ;X 9= Leu或Ser ;X 10= Ser或Pro ; Xn= Leu或Val ;X 12= Cys或Ser或Ala ;X 13= Phe或Tyr ;X 14= Arg或Gin ;X 15= Glu或 Thr；
[0028] Val-Tyr-Asn-Gly-Thr-Ser-X3-Tyr-Ser-X 4-X5-X6-X7-X8-Arg-Arg-Gly-Asp-X 9-Gly -X^-Leu-Ala-Ala-Arg-Xn-Ala-Ala-Gln-Leu-Pro-X^-Ser-Phe-Asn-X^-Gly-Ala-Ile-X!^ Ala-Thr_X 15-Ile(SEQ ID N0:11);其中，X3=Arg或Lys;X4=Ala或Thr;X5=Pro或Thr; X6_X7= Gin或Gly-Gly或Ala ;X 8= Asn或Gly或Thr ;X 9= Leu或Ser ;X 10= Ser或Pro ; Xn= Leu或Val ;X 12= Cys或Ser或Ala ;X 13= Phe或Tyr ;X 14= Arg或Gin ;X 15= Glu或 Thr；
[0029] Val-Tyr-Asn-Gly-X2-Ser-X3-Tyr-Ser-X 4-X5-X6-X7-X8-Arg-Arg-Gly-Asp-X 9-Gly-X10-Leu-Ala-Ala-Arg-Xn-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Ala-Ser-Phe-Asn-X13-Gly-Ala-Ile-X14-Ala-Thr_X 15-Ile;(SEQ ID N0:12);其中，X2=Val或Cys或Thr;X3=Arg或Lys;X4=Ala 或Thr ;X5= Pro或Thr 6_X7= Gin或Gly-Gly或Ala 8= Asn或Gly或Thr 9= Leu 或Ser ;X10= Ser或Pro n= Leu或Val 13= Phe或Tyr 14= Arg或Gin 15= Glu 或Thr ;
[0030] Val-Tyr-Asn-Gly-X2-Ser-X3-Tyr-Ser-X 4-X5-X6-X7-X8-Arg-Arg-Gly-Asp-X 9-Gly-X10-Leu-Ala-Ala-Arg-Xn-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Ser-Ser-Phe-Asn-X13-Gly-Ala-Ile-X14-Ala-Thr_X 15-Ile;(SEQ ID N0:13);其中，X2=Val或Cys或Thr;X3=Arg或Lys;X4=Ala 或Thr ;X5= Pro或Thr 6_X7= Gin或Gly-Gly或Ala 8= Asn或Gly或Thr 9= Leu 或Ser ;X10= Ser或Pro n= Leu或Val 13= Phe或Tyr 14= Arg或Gin 15= Glu 或Thr ;
[0031] Val-Tyr-Ser-Gly-Cys-Ser-Lys-Tyr-Ser-X4-X 5-X6-X7-X8-Arg-Arg-Gly-Asp-X 9-G ly-X10-Leu-Ala-Ala-Arg-Xn-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Cys-Ser-Phe-Asn-X13-Gly-Ala-Ile-X14-Ala-Thr-X 15-Ile(SEQ ID N0:14);其中，X4=Ala或Thr;X5=Pro或Thr;X6-X7=Gln 或Gly-Gly或Ala ;X8= Asn或Gly或Thr ;X 9= Leu或Ser ;X 10= Ser或Pro ;X Leu或 Val ;X13= Phe或Tyr ;X 14= Arg或Gin ;X 15= Glu或Thr ;
[0032] Val-Tyr-Asn-Gly-Thr-Ser-Lys-Tyr-Ser-X4-X 5-X6-X7-X8-Arg-Arg-Gly-Asp-X 9-G ly-X10-Leu-Ala-Ala-Arg-Xn-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Ala-Ser-Phe-Asn-X13-Gly-Ala-Ile- X14-Ala-Thr-X15-Ile(SEQ IDN0:15);其中，X4=Ala或Thr;X5=Pro或Thr;X6-X7=Gln或Gly-Gly或Ala ;X8= Asn或Gly或Thr ;X 9= Leu或Ser ;X 10= Ser或 Pro ;X Leu或 Val ;X13= Phe或Tyr ;X 14= Arg或Gin ;X 15= Glu或Thr ;
[0033] Val-Tyr-Asn-Gly-Val-Ser-Arg-Tyr-Ser-X4-X 5-X6-X7-X8-Arg-Arg-Gly-Asp-X 9-G ly-X10-Leu-Ala-Ala-Arg-Xn-Ala-Ala-Gln-Leu-Pr〇-Ser-Ser-Phe-Asn-X13-Gly-Ala-Ile-X14-Ala-Thr-X 15-Ile(SEQ IDN0:16);其中，X4=Ala或Thr;X5=Pro或Thr;X6-X7=Gln或