豬繁殖與呼吸綜合征病毒組合物及其用圖
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2012年12月7日提交的美國申請編號61/734, 919的優(yōu)先權(quán)，所述 專利申請以引用的方式全文納入本文。
[0003] 序列表
[0004] 此申請包括作為ASCII格式的電子*.txt文件提交的序列表，所述序列表以引用 的方式全文納入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本申請涉及包含豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)的組合物，以及所述組合物的 用途，包括作為疫苗。
【背景技術(shù)】
[0006] 豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)的特征在于，母豬的嚴(yán)重繁殖障礙和高比例的晚期 流產(chǎn)和早產(chǎn)，以及幼豬的呼吸疾病和死亡。PRRS是由具有單鏈正義RNA基因組的小的包膜 病毒導(dǎo)致，所述病毒屬于動(dòng)脈病毒科（Arteriviridae)動(dòng)脈病毒屬（Arterivirus)。在天然 條件下，PRRS病毒在肺泡巨噬細(xì)胞中復(fù)制并且能夠維持長時(shí)間的病毒血癥，在一些情況下 導(dǎo)致持續(xù)數(shù)月的持續(xù)性感染。所述疾病于20世紀(jì)80年代晚期在美國和歐洲突然出現(xiàn)，隨 后已經(jīng)在全世界傳播，給豬飼養(yǎng)業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。所述病毒能夠在被感染的農(nóng)場中持 續(xù)存在，這主要是由于其存在于被持續(xù)感染的攜帶者母豬中。
[0007] 根據(jù)PRRS病毒所來源的大陸將其分成兩種基因型。來源于北美的PRRS病毒毒株 被分類為2型基因型，而來源于歐洲的PRRS病毒毒株被指定為1型基因型。目前兩種基因 型都在全球傳播。所述兩種基因型在基因組水平上彼此相差約40%，并且在血清學(xué)上也是 不同的。每種基因型內(nèi)的分離株也表現(xiàn)出最高達(dá)20%的相當(dāng)大的核苷酸序列異質(zhì)性。PRRS 病毒似乎是通過隨機(jī)突變和基因內(nèi)重組事件而進(jìn)化的。
[0008] 根據(jù)對西班牙毒株的序列分析，已估計(jì)PRRS病毒表現(xiàn)出的突變率為在每個(gè)位點(diǎn) 每年1-3X102次置換，這與其他快速進(jìn)化的RNA病毒的突變率類似。在過去的25年中已 觀察到的PRRS病毒的巨大遺傳變異，以及產(chǎn)生與較早分離株相比更高發(fā)病率和死亡率的 PRRS病毒分離株在本領(lǐng)域中的出現(xiàn)是值得注意的。此外，正逐漸認(rèn)識到每種PRRS病毒原液 (stock)通常作為遺傳相關(guān)物種的混合物存在的事實(shí)。
[0009] 在獸醫(yī)學(xué)中用于保護(hù)動(dòng)物免患病毒疾病的常見類型的生物制品是由經(jīng)修飾的活 病毒（MLV)疫苗組成。用于產(chǎn)生減毒活病毒疫苗的最常用的方法是在基質(zhì)（通常是細(xì)胞培 養(yǎng)物）而非天然宿主中和/或不利條件下連續(xù)傳代致病病毒，直至所述病毒從其初始的毒 力（產(chǎn)生疾病的能力）充分減毒但仍保持誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的能力。1996年，第一種MLV疫 苗被引入北美市場，所述疫苗是基于在1991年分離的PRRS病毒毒株VR-2332。通過使所述 病毒在35-37Γ下在猿猴腎細(xì)胞（MA-104/MARC-145)中進(jìn)行25次連續(xù)傳代，然后在31°C下 在相同的細(xì)胞型中進(jìn)行12次額外傳代（共36次傳代），獲得所述減毒疫苗株。
[0010] 隨后，由于觀察到最初的PRRSMLV疫苗保護(hù)效力下降（推測是由于流行的PRRS 病毒分離株的基因組中進(jìn)化的遺傳改變，這導(dǎo)致出現(xiàn)毒力更強(qiáng)且遺傳上不同的（異源的）PRRS病毒毒株），因此在1999年引入第二個(gè)版本的MLV疫苗。這次行動(dòng)的原理是增大疫苗 株的遺傳同源性使其超過20世紀(jì)90年代后期本領(lǐng)域中傳播的同期病毒的遺傳同源性。該 減毒疫苗株來源自在1997年從PRRS的嚴(yán)重病例中分離得到的JA-142PRRS病毒，并且代 表該分離株在37°C下在猴腎細(xì)胞系MARC-145中的200次連續(xù)傳代。已記載了這些疫苗的 兩種祖先分離株（progenitor)VR-2332和JA-142分別表現(xiàn)出中等水平和高水平的毒力，因 此這解釋了為了產(chǎn)生減毒的疫苗病毒，需要在細(xì)胞培養(yǎng)物中在不利條件下進(jìn)行中等次數(shù)的 傳代（VR-2332)或在更溫和的環(huán)境中進(jìn)行更多次的連續(xù)傳代（JA-142)。值得注意的是，將 這些減毒的PRRS病毒毒株接種到豬中導(dǎo)致持續(xù)4周以上的病毒血癥。在此期間，所述病毒 從身體分泌物中排出，導(dǎo)致所述疫苗病毒傳播到未接種的動(dòng)物。因此，這些疫苗的使用導(dǎo)致 其從減毒表型倒退為毒力表型。
[0011]用野生型PRRS病毒感染豬或者用該病原體的活的減毒形式進(jìn)行疫苗接種引發(fā)產(chǎn) 生病毒特異性但是非中和的抗體，以及產(chǎn)生少量中和抗體。此外，在此期間，產(chǎn)生有限數(shù)量 的干擾素（IFN)γ分泌細(xì)胞（SC)。病毒中和抗體和病毒特異性IFNySC的產(chǎn)生被認(rèn)為是引 發(fā)針對PRRS病毒的保護(hù)性免疫的主要決定因素。被廣泛接受的是，PRRS病毒天然會刺激不 平衡（即強(qiáng)體液應(yīng)答，其特征在于產(chǎn)生豐富的非中和抗體和有限但具有潛在保護(hù)性的T細(xì) 胞介導(dǎo)的基于IFNy的細(xì)胞免疫）和非保護(hù)性免疫應(yīng)答。之前已提出，決定產(chǎn)生通常觀察 到的針對疫苗接種或感染的非保護(hù)性的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的最相關(guān)的參數(shù)是缺少由PRRS病 毒所引發(fā)的充分的先天免疫應(yīng)答。被病毒感染的細(xì)胞通常分泌I型IFN(IFNa和IFN0)， 所述I型IFN在鄰近的細(xì)胞中引起分子改變以幫助這些細(xì)胞保護(hù)自身免受病毒感染。值得 注意的是，豬對PRRS病毒感染的IFNa應(yīng)答幾乎不存在。
[0012] 已經(jīng)假設(shè)，不存在針對PRRS病毒的感染或疫苗接種的充分的先天免疫應(yīng)答，可以 至少部分導(dǎo)致特異性病毒中和抗體的延遲產(chǎn)生以及豬針對這種病毒的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng) 答的延遲出現(xiàn)。因此，PRRS病毒可通過在感染其宿主后不引發(fā)充分的IFNa產(chǎn)生而避開 Th-Ι型應(yīng)答的發(fā)生。就這點(diǎn)而言，已知漿細(xì)胞樣樹狀突細(xì)胞（pDC)在誘導(dǎo)早期抗病毒狀態(tài) 中發(fā)揮重要作用，這是由于除了其他細(xì)胞因子（例如，對適應(yīng)性免疫的發(fā)生具有重要影響 的腫瘤壞死因子（TNF)a和白細(xì)胞介素6(IL_6))以外，pDC還迅速并大量分泌IFNa。盡 管PDC僅占豬外周血單核細(xì)胞（PBMC)群的一小部分（〈1%)，它們卻產(chǎn)生了新鮮分離的豬 PBMC樣品中所分泌的IFNa中的大多數(shù)。值得注意的是，與刺激pDC分泌大量IFNa的其 他豬病毒不同，PRRS病毒引發(fā)這種細(xì)胞亞群的少量IFNa應(yīng)答，甚至通過主動(dòng)抑制被刺激 的pDC分泌IFNa和TNFa的能力而對其功能產(chǎn)生不利影響。可合理地預(yù)料到，這種阻礙 對宿主隨后的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的性質(zhì)具有顯著影響。通過在用PRRSMLV疫苗進(jìn)行免疫時(shí) 提供外源性IFNa源而對PRRS病毒特異性的T細(xì)胞介導(dǎo)的IFNy應(yīng)答的強(qiáng)度產(chǎn)生的增強(qiáng) 作用，提供了對該假說的支持。
[0013] 在本領(lǐng)域中，一直需要有效且經(jīng)濟(jì)的疫苗，以保護(hù)豬免受PRRS感染的影響，從而 使損失最小。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了一種分離的豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS) 病毒。所述病毒的基因組可編碼選自如下的蛋白：在相對于SEQIDN0:25的第31位上包 含纈氨酸的E蛋白、在相對于SEQIDN0:25的第60位上包含丙氨酸的E蛋白，或在相對于 SEQIDN0:21的第94位上包含纈氨酸的GP3蛋白。所述病毒的基因組還可編碼在相對于 SEQIDN0:25的第31位上包含纈氨酸的E蛋白、在相對于SEQIDN0:25的第60位上包含 丙氨酸的E蛋白，和在相對于SEQIDN0:21的第94位上包含纈氨酸的GP3蛋白。所述病 毒的基因組可包含SEQIDNO: 1的序列或其RNA等價(jià)序列。
[0015] 作為一個(gè)實(shí)施方案，本文還提供了一種包含所述病毒和可藥用載體的疫苗。所述 疫苗還可包含免疫佐劑。
[0016] 作為一個(gè)實(shí)施方案，本文還提供了在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)特異性針對PRRS病毒的免 疫應(yīng)答的方法，所述方法可包括將所述疫苗給予有此需要的哺乳動(dòng)物。所述疫苗還可包含 免疫佐劑。
[0017] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫佐劑可以是干擾素α (IFN-α)、干擾素 β (IFN-β)、白細(xì)胞介素-12、白細(xì)胞介素-15和白細(xì)胞介素-18 ;編碼干擾素α的核酸；編 碼白細(xì)胞介素-12的核酸、編碼白細(xì)胞介素-15的核酸；編碼白細(xì)胞介素-18的核酸；編碼 干擾素β的核酸；誘導(dǎo)或增強(qiáng)干擾素α的活性的物質(zhì)；誘導(dǎo)或增強(qiáng)干擾素β的活性的物 質(zhì)；多聚1C或多聚ICLC。可在給予所述疫苗的同時(shí)、在給予所述疫苗之后24小時(shí)內(nèi)或在 給予所述疫苗之前24小時(shí)內(nèi)給予所述免疫佐劑。所述給藥可以是肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)、粘膜、口 月艮、舌下、眼內(nèi)、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部或經(jīng)皮膚給藥。所述給藥可以是肌肉內(nèi)給藥。
[0018] 本文還提供了分離的豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)病毒，其被保藏在美國典型 菌種保藏中心（theAmericanTypecultureCollection)，被指定為ATCC專利保藏號 PTA-120658。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)的分離的毒 株，其中所述毒株是G16X、111698或794A61。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述毒株是G16X。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述毒株具有SEQIDN0:1中所示的基因組RNA序列（毒株G16X)。在一 個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)的分離的毒株，其中所述 毒株具有SEQIDN0:1(毒株G16X)或SEQIDN0:3(毒株111698)中所示的基因組RNA序 列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了PRRSV的分離的毒株，所述毒株具有由SEQIDN0:12 和SEQIDNO: 14中所示的序列表征的蛋白E序列；由SEQIDNO: 16和SEQIDNO: 17表征 的GP3序列；由SEQIDN0:7表征的Nsp2序列；和/或由SEQIDNO: 19表征的GP4序列。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施方案6中，本發(fā)明提供了PRRSV的分離的毒株，其中所述毒株具有與 SEQIDN0:1(G16X)具有至少95%同一性的核酸序列，并且所述毒株相對于PRRS病毒毒株 89-46448-40的蛋白序列具有一個(gè)或多個(gè)所編碼的氨基酸置換，所述氨基酸置換選自：蛋 白Nsp2V/M67V;蛋白Nsp2P/S490P、Nsp2P495L;Nsp2Y338H;蛋白EI31V;蛋白ET60A; 蛋白GP3I94V;和蛋白GP3P/S96S。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述毒株具有一個(gè)或多個(gè)如以 下所示的所編碼的氨基酸：蛋白Nsp2 67V;蛋白Nsp2 490P;蛋白Nsp2Y338H;蛋白Nsp2 P495L;蛋白E31V;蛋白E60A;蛋白GP3 94V;蛋白GP3L213F;蛋白GP3 96S和蛋白GP4 A32S。在其他實(shí)施方案中，所述毒株具有如本文別處所描述的同一"性水平百分?jǐn)?shù)。在一個(gè) 實(shí)施方案中，有利的是，當(dāng)PRRSV的疫苗株被給予豬時(shí)，其具有由例如巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的高的 干擾素α應(yīng)答的表型。在一個(gè)實(shí)施方案7中，本發(fā)明提供了一種免疫原性組合物，其包含 至少一種分離的PRRSV毒株以及還包含可用于獸醫(yī)用途的藥物載體，所述分離的PRRSV毒 株選自G16X、111698和實(shí)施方案6的毒株。
[0021] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在動(dòng)物中誘導(dǎo)特異性針對豬繁殖與呼吸綜合征 病毒（PRRSV)的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予動(dòng)物本文所描述的免疫原性組合物的 步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫原性組合物還包括免疫佐劑。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物還包括免疫佐劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 免疫佐劑包括以下物質(zhì)中的至少一種：干擾素α、干擾素β、白細(xì)胞介素-12、白細(xì)胞介 素-15、白細(xì)胞介素-18、在豬細(xì)胞中表達(dá)的編碼干擾素α的核酸、在豬細(xì)胞中表達(dá)的編碼 白細(xì)胞介素-12的核酸、在豬細(xì)胞中表達(dá)的編碼白細(xì)胞介素-15的核酸、在豬細(xì)胞中表達(dá)的 編碼白細(xì)胞介素-18的核酸、在豬細(xì)胞中表達(dá)的編碼干擾素β的核酸、誘導(dǎo)或增強(qiáng)干擾素 β或干擾素α或二者的活性的物質(zhì)，以及多聚1C或多聚ICLC。在一個(gè)實(shí)施方案中，在給 予所述免疫原性組合物的同時(shí)、在給予所述免疫原性組合物之后24小時(shí)內(nèi)或在給予所述 免疫原性組合物之前24小時(shí)內(nèi)給予所述免疫佐劑。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物的給藥是肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)、粘膜、口服、舌下、 眼內(nèi)、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部或經(jīng)皮膚給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，給藥是肌肉內(nèi)給藥。
【附圖說明】
[0024] 圖1說明在用PRRS病毒分離株89-46448-40、NADC-20或模擬接種物（mock inoculum)感染后第7天和第14天，豬的體重改變（％)。根據(jù)激發(fā)時(shí)的體重來確定體重增 加百分?jǐn)?shù)。計(jì)算各組的平均值（土SEM)。
[0025] 圖2表示在用PRRS病毒分離株89-46448-40或NADC-20或模擬接種物感染豬之后 的血清病毒血癥。在ZMAC細(xì)胞（ATCCNo.PTA-8764,野豬（Susscrofa)(豬（pig/swine)) 肺組織細(xì)胞）中測定豬血清樣品中傳染性病毒的數(shù)量（TCID5(]/ml)。
[0026] 圖3說明用PRRS病毒分離株89-46448-40或NADC-20或模擬接種物感染14天的 豬的肺部總病理學(xué)得分。根據(jù)本領(lǐng)域已知的評分系統(tǒng)來確定總肺病理學(xué)得分。
[0027]圖 4A-4D提供了PRRS病毒分離株 89-46448-40 和衍生毒株 794A61、111698 和G16X 之間非結(jié)構(gòu)蛋白2(Nsp2,圖4A)、蛋白E(圖4B)以及糖蛋白GP3(圖4C)和GP4(圖4D)的 一級結(jié)構(gòu)中預(yù)測的氨基酸差異。粗體字母示出了PRRSV89-46448-40、794A61、111698和 G16X的完整蛋白E和GP3以及Nsp2和GP4的連續(xù)部分（以〈和〉指示）的預(yù)測的氨基酸 序列中有區(qū)別的氨基酸位點(diǎn)。加框的字母對示出了PRRS病毒89-46448-40的一些蛋白中 的多態(tài)位點(diǎn)。
[0028] 圖5示出了豬肺泡巨噬細(xì)胞針對不同類型的PRRS病毒感染的干擾素α應(yīng)答。以 標(biāo)示的感染復(fù)數(shù)（Μ0Ι)用PRRS病毒感染ZMAC細(xì)胞。通過特異性針對豬干擾素α的ELISA 測定在所述細(xì)胞暴露于所標(biāo)示的病毒后8h時(shí)收集的培養(yǎng)物上清液中干擾素α的量。
[0029] 圖6示出了不同的PRRS病毒毒株對于肺泡巨噬細(xì)胞對多聚（I:C)的干擾素α應(yīng) 答的影響。模擬感染或用標(biāo)示的病毒（Μ0Ι= 5)感染ZMAC細(xì)胞。在孵育2h之后，將細(xì)胞 培養(yǎng)物暴露于25mg/ml多聚（I:C)。8h后收集細(xì)胞培養(yǎng)基，并通過特異性針對豬干擾素α 的ELISA檢測干擾素α的存在。
[0030] 圖7提供了在用有毒力的PRRS病毒激發(fā)后第7天時(shí)未接種PRRS病毒（PRRS virusnaive)和接種PRRS病毒的豬的體重改變（％)。根據(jù)激發(fā)時(shí)體重來確定體重增加 百分?jǐn)?shù)。計(jì)算每組的平均值（土SEM)。
[0031] 圖8說明用有毒力的PRRS病毒激發(fā)之后在未接種PRRS病毒和接種PRRS病毒的 豬中的病毒血癥的程度和頻率。通過實(shí)時(shí)定量PCR來測定在用有毒力的PRRS病毒激發(fā)之 后第7天從豬采集的血清樣品中PRRS病毒基因組的拷貝數(shù)。
[0032] 圖9不出了用有毒力的PRRS病毒激發(fā)之后在未接種PRRS病毒和接種PRRS病毒 的豬中的BAL液中的病毒載量。在ZMAC細(xì)胞中滴定在用有毒力的PRRS病毒激發(fā)后第14 天采集的豬BAL液樣品中的傳染性病毒的量（TCIDM/ml)。
[0033]圖 10A示出了PRRS病毒毒株G16X(SEQIDN0:26)、89-46448-40、794A61 和 111698(后三者為SEQIDN0:25)的蛋白E氨基酸序列的比對。圖10B示出了來自G16X的 蛋白E的氨基酸序列（SEQIDN0:26)，圖10C示出了來自毒株89-46448-40的蛋白E的氨 基酸序列（SEQIDN0:25)。
[0034]圖 11A示出了PRRS病毒毒株G16X(SEQIDN0:23)、89-46448-40(SEQIDN0:23)、 794A61(SEQIDNO:23)和 111698(SEQIDNO:24)的GP4 氨基酸序列的比對。圖 1IB示出 了來自毒株89-46448-40的GP4的氨基酸序列（SEQIDNO: 23)。圖11C示出了與PRRSV分 離株89-46448-40相關(guān)的GP4的氨基酸序列（SEQIDN0. 24)。
[0035]圖 12A示出了PRRS病毒毒株G16X(SEQIDN0:22)、89-46448-40(SEQIDN0:21)、 794A61(SEQIDN0:22)和 111698(SEQIDN0:48)的GP3 氨基酸序列的比對。圖 12B表示 來自毒株89-46448-40的GP3的氨基酸序列（SEQIDN0:21)。圖12C表示與PRRSV分離株 G16X相關(guān)的GP3的氨基酸序列（SEQIDN0. 22)。
[0036] 圖13示出了用IngelvacPRRSMLV或G16X接種后豬的血清干擾素α的水平。如 在"材料和方法"中所述用IngelvacPRRSMLV或G16X接種兩組豬（η= 6)。在接種后所 標(biāo)示的時(shí)間點(diǎn)采集血清樣品并通過ELISA測定血清干擾素α的水平。數(shù)據(jù)代表在每個(gè)處 理組中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測的6個(gè)樣品的平均值土SE。模擬接種動(dòng)物在每個(gè)測試的時(shí)間點(diǎn)具有 <2pg/ml血清（數(shù)據(jù)未示出）。
[0037] 圖14示出了暴露于有毒力的PRRS病毒之后豬的體重（BW)改變。在用野生型 PRRSV分離株LTX1激發(fā)之前不久以及激發(fā)后第7、10和14天對模擬接種、接種Ingelvac PRRSMLV或接種G16X病毒的豬（每組η= 6)進(jìn)行稱重。還在所述4個(gè)時(shí)間點(diǎn)對未被激 發(fā)且未接種的動(dòng)物（嚴(yán)格對照，η= 6)進(jìn)行稱重。在個(gè)體基礎(chǔ)上測定激發(fā)后接下來的第7、 10和14天期間的BW改變，并計(jì)算相對于激發(fā)時(shí)BW的體重改變百分?jǐn)?shù)（％)。結(jié)果代表每 組的平均體重改變百分?jǐn)?shù))+/_SDEV。除了G16X組，所有組都是由每組6只動(dòng)物組成。 G16X組有6只動(dòng)物，直到第10天該組減少到5只動(dòng)物。該組中的一只動(dòng)物被排除，因?yàn)樗?患了腸扭轉(zhuǎn)，需要在病毒激發(fā)后第10天對該動(dòng)物施行安樂死。
[0038] 圖15不出了暴露于有毒力的PRRS病毒后豬的病毒血癥的程度和頻率。在用野生 型PRRS病毒LTX1激發(fā)之前不久和激發(fā)后的標(biāo)示天數(shù)從模擬接種、接種IngelvacPRRSMLV 或接種G16X病毒的動(dòng)物采集血清樣品。還在這些時(shí)間點(diǎn)采集未激發(fā)且未接種的動(dòng)物（嚴(yán) 格對照）（η= 6)的樣品。通過在ZMAC細(xì)胞中進(jìn)行傳染性病毒滴定來測定血清中的病毒載 量。提供各個(gè)豬的結(jié)果，然后計(jì)算每組成員的平均值（水平紅色柱）。在激發(fā)后第10天將 G16X組的一只豬從試驗(yàn)中排除（參見圖14的圖注）。
[0039] 圖16不出了暴露于有毒力的PRRS病毒后豬的BAL液中的病毒載量。在用野生型 PRRS病毒LTX1激發(fā)后第14天從模擬接種、接種IngelvacPRRSMLV或接種G16X病毒的動(dòng) 物的肺采集BAL液。還在此時(shí)間點(diǎn)從未激發(fā)且未接種動(dòng)物（嚴(yán)格對照）（η= 6)獲得樣品。 通過在ZMAC細(xì)胞中進(jìn)行傳染性病毒滴定來測定每只動(dòng)物的BAL液中的病毒載量。提供各 個(gè)豬的結(jié)果，然后僅使用病毒陽性樣品計(jì)算每組成員的平均值（水平柱）。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 豬繁殖與呼吸綜合征病毒在20世紀(jì)80年代后期首先出現(xiàn)在美國。過去幾年中美 國豬種群中PRRS患病率的顯著增加最好地說明了需要新工具來控制PRRS的令人信服的證 據(jù)。動(dòng)植物衛(wèi)生檢驗(yàn)局（APHIS)所進(jìn)行的血清學(xué)調(diào)查表明，在2000年觀察到的養(yǎng)殖者/加 工者（grower/finisher)美國豬群中PRRS的最初患病率為35%，到2006年增加到53%。 從那時(shí)起，所述患病率持續(xù)升高，到2009年所述患病率令人擔(dān)憂地高達(dá)71 %，這代表在9年 中患病率>200%的增加?，F(xiàn)在，美國70%以上的豬群被北美型（基因型2)PRRS病毒感染， 導(dǎo)致每年的經(jīng)濟(jì)損失超過6. 64億美元，使PRRS成為豬養(yǎng)殖業(yè)帶來損失最高的疾病。
[0041] 作為豬養(yǎng)殖業(yè)的主要經(jīng)濟(jì)問題，美國國家豬肉委員會（NPB)將在豬的商業(yè)種群中 控制和根除PRRS病毒視為最優(yōu)先的事。但是，疾病控制被證明難以在很大程度上實(shí)現(xiàn)，因 為該病毒的RNA基因組表現(xiàn)出很高的突變速率，這導(dǎo)致顯著且持續(xù)的遺傳/抗原病毒的多 樣化。這可通過以下事實(shí)得到清楚的說明：存在這樣的9種明確定義的2型（或北美樣） PRRS病毒譜系，在其之間表現(xiàn)出較大的系統(tǒng)發(fā)生差異。從25年前這一主要的豬病原體首 次出現(xiàn)起，所述9種不同的北美樣PRRS病毒譜系就已經(jīng)出現(xiàn)，并且包含了目前世界上存在 的PRRSV病毒的大的遺傳差異。這些譜系在遺傳上是不同的，這可通過至少11%的譜系內(nèi) 多樣性來證實(shí)。大多數(shù)（>95%)在美國已分離的PRRS病毒屬于這些譜系中的四個(gè)，即譜系 1、5、8 和 9。
[0042] 通常認(rèn)為，PRRSMLV疫苗針對因有毒力的PRRS病毒感染而導(dǎo)致的疾病的保護(hù)性 效力水平主要取決于所述兩種病毒的遺傳相似性（同源性）。因此，基于本領(lǐng)域中表現(xiàn)出的 集體智慧，同時(shí)期的PRRS病毒毒株之間的遺傳多樣性中的時(shí)間依賴性的增加，應(yīng)當(dāng)會使具 有過時(shí)基因型的減毒PRRS病毒疫苗不能在豬中賦予針對最近進(jìn)化的PRRS病毒的充分有效 的保護(hù)性免疫。因此，應(yīng)當(dāng)注意到，