專利名稱：快速檢測豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的膠體金測試試紙條的制作方法
技術領域：
本實用新型屬于預防獸醫(yī)學檢驗領域，具體是涉及一種快速檢測豬繁殖與呼吸 道綜合征病毒的膠體金測試試紙條。
背景技術：
豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome vinis， PRRSV)為動脈炎病毒科動脈炎病毒屬成員。它是豬的一種重要傳染性疾病 病原，主要引起妊娠期母豬早產、流產，產死胎、弱胎、木乃伊胎，新生仔豬普遍 發(fā)生肺炎、生長遲緩和死亡率增加。該病毒最早發(fā)現(xiàn)于美國，隨后歐洲、亞洲、大 洋洲多個國家和地區(qū)均發(fā)現(xiàn)了該病毒。1996年，郭寶清等首次報道從流產胎兒中分 離到PRRSV，從而證實我國也存在該病毒。2006年以來，由PRRSV突變株所引起的 "高致病性豬藍耳病"席巻了中國大部分省份，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了災難性的經(jīng)濟損失。
為了便于對豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)做出準確的診斷，已經(jīng)建立多種實驗室 診斷方法，如ELISA， RT-PCR，免疫熒光，原位雜交，病毒分離等，但這些診斷 方法需要借助一些特殊儀器的輔助才能完成，穩(wěn)定性較差、操作麻煩、效率低、需 低溫保存、儲運不方便，這就限制了這些方法在基層單位的廣泛使用。
發(fā)明內容
本實用新型的目的是提供一種快速檢測豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的膠體金 測試試紙條，以解決現(xiàn)有技術存在的需要借助一些特殊儀器的輔助才能完成檢測， 穩(wěn)定性較差、操作麻煩、效率低、需低溫保存、儲運不方便的問題。其采用兩條帶 顯色的膠體金層析法制備，顯帶顏色為紅色線條，能準確檢測出樣品中豬繁殖與呼 吸道綜合征病毒的含量。
本實用新型的技術方案是包括底襯、樣品墊、涂覆膠體金顆粒標記抗體的玻 璃纖維膜、包被膜和吸水紙，包被膜的底面粘帖在底襯上面，在該包被膜兩端的上 面分別粘帖玻璃纖維膜和吸水紙，在該玻璃纖維膜的另一端的上面粘帖樣品墊；在 該包被膜的上面設有檢測線和控制線，該檢測線包被處理好的豬繁殖與呼吸道綜合控制線包被處理好的抗鼠抗體。
本實用新型采用雙抗體夾心法，可用來檢測血液樣品或者棉拭子等處理樣品。 與現(xiàn)有檢測試劑盒比較，由于對檢測線和控制線進行了相應的處理，使其能夠產生 特異條帶，從而滿足現(xiàn)地農戶、基層檢測的需求。
本實用新型具有高度特異性、靈敏度、檢測速度等優(yōu)點，且不需使用儀器設備， 成本低廉，操作簡便，能廣泛應用于現(xiàn)地農戶、基層及個人對于豬繁殖與呼吸道綜 合征病毒的檢測。該試紙條可以直接使用，也可以裝配在塑料裝置中以檢測板形式 使用。


圖1為本實用新型的側面結構示意圖； 圖2為圖1的俯視圖3為本實用新型檢測結果為陽性的示意圖(包被膜4表面的檢測線6和控制 線7均顯色)；
圖4為本實用新型檢測結果為陰性的示意圖(包被膜4表面的控制線7顯色而
檢測線6不顯色)；
圖5為試紙條無效的示意圖(包被膜4表面的檢測線6和控制線7均不顯色)。
具體實施方式

如圖1和圖2所示，本實用新型包括在底襯1上順次相互搭接地粘帖樣品墊2、 涂覆約20nm厚的膠體金顆粒標記抗體的玻璃纖維膜3、包被膜4以及吸水紙5而 形成，包被膜4有檢測線6和控制線7，檢測線6包被豬繁殖與呼吸道綜合征病毒 的抗體，控制線7包被抗鼠抗體；通過所述檢測線:6和控制線7的顯色來定性。
所述的豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的抗體為高純度的抗單克隆抗體和/或多克 隆抗體；所述膠體金顆粒標記抗豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的單克隆抗體。
本實用新型的制備方法是
1、 包被膜4的制備在硝酸纖維素膜上分別噴涂抗豬繁殖與 呼吸道綜合征病毒的抗體及抗鼠IgG抗體，并呈兩條線上下排列，分別形成檢 測線6和控制線7。
檢測線6:調試噴膜機，噴液量為25微升/35厘米，用包被緩沖液稀釋抗豬繁 殖與呼吸道綜合征病毒的單克隆抗體，濃度為70ug/ul，用噴膜機噴涂劃線，室溫晾干20分鐘。
控制線7:調試噴膜機，噴液量為25微升/35厘米，用包被緩沖液稀釋抗鼠IgG 多克隆抗體，濃度為2mg/ml，機器劃線，兩線間隔5mm，應細致均勻，室溫晾干20 分鐘。37'C封閉60分鐘，取出后置37"C烘干處理兩小時，封袋備用。
2、 金標抗體(膠體金顆粒標記抗體)的制備用O. 1M碳酸鉀調膠體金pH值 至7. 5，按15微克抗體/毫升膠體金加入抗豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的單克隆抗 體，混勻，靜置30分鐘，12000卬m離心30分鐘，棄上清，沉淀用標記洗滌液洗滌 兩次，最后一次其去上清，將沉淀用十分之一初始膠體金體積的金標抗體保存液溶 解，置4X:備用，效期7天；
3、 將制備好的金標抗體涂覆在玻璃纖維膜(或聚酯膜)上，制成涂覆金標抗 體的玻璃纖維膜3。
所述涂覆金標抗體的玻璃纖維膜3可以用普通方法將金標抗原涂覆在玻璃纖 維膜上，也可以通過下述方法得到將標記好的膠體金均勻地鋪在玻璃纖維膜上， 每毫升溶液鋪10平方厘米，冷凍干燥，封袋，置4"備用。
4、 在底襯1上順次相互搭接地粘貼樣品墊2、涂覆金標抗原的玻璃纖維膜3、 包被膜4以及吸水紙5，得到試紙板，按照要求切割成不同寬度的試紙條。
所述包被緩沖液和封閉液的配方及制備方法是本領域通用的技術。 本實用新型在上述制備方法中所涉及的材料的具體制備方法進一步詳細說明 如下
A. 抗原制備采用高純度的抗豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的單克隆抗體作為包
被抗原。
B. 抗原膜的制備
包被緩沖液的制備0. 05M pH9. 6碳酸鹽緩沖液為包被溶液，0.22u膜過濾， 置4'C備用，效期7天。
封閉液的配置配制0.01M pH7.0磷酸鹽緩沖液(PBS)， 0.22u膜濾過，置4 'C備用，效期7天。配制封閉工作液2%BSA， 2%脫脂奶，0.01MpH7.0PBS， 0. 22u 膜濾過，置4"C備用，效期3天。
檢測線制備調試噴膜機，噴液量為25微升/35厘米，用包被緩沖液稀釋抗豬 繁殖與呼吸道綜合征病毒的單克隆抗體，濃度為70ug/ml，機器劃線，室溫晾干20 分鐘。
控制線制備調試噴膜機，噴液量為25微升/35厘米，用包被緩沖液稀釋抗鼠IgG多克隆抗體，濃度為2mg/ml，機器劃線，兩線間隔5mm，應細致均勻，室溫晾 干20分鐘。37"C封閉60分鐘，取出后置37'C烘干處理兩小時，封袋備用。
C. 標抗體的制造規(guī)程
-氯金酸的配制用雙蒸水溶解氯金酸，配成1%溶液，置4'C備用，效期3天。 1000ml 1%氯金酸溶液配方10g氯金酸；1000ml雙蒸水。
檸檬酸三納的配置用雙蒸水溶解檸檬酸三納，配成1%溶液，置4'C備用， 效期3天。
0. 1M碳酸鉀的配制用雙蒸水配制，0.22u膜濾過，置4。C備用，效期7天。 1000ml 0. 1M碳酸鉀溶液配方:13. 8g碳酸鉀；1000ml雙蒸水。
3XPEG-20000的配制用雙蒸水配制，0. 22u膜濾過，置4。C備用，效期7天。 1000ml 3XPEG溶液配方:30g PEG-20000; 1000ml雙蒸水。
標記洗滌液的配制2%BSA， 0. OIM pH7. 0 PBS溶液，0. 22u膜濾過，置4。C備 用，效期兩周。1000ml標記洗滌液的配制20g BSA;1000ml 0. 01M pH7. 0 PBS溶 液。
金標抗體保存液的配制:1%BSA， 0.5%脫脂奶，5/萬NaN3， 0.1% Tween-20， 0. 01M pH 7. 0 PBS溶液，0. 22u膜濾過，置4。C備用，效期15天，1000ml金標抗 體保存液的配置:10g BSA;5g脫脂奶；0. 5g NaN3;lml Tween-20; 1000 ml 0. OIM pH 7. 0 PBS溶液。
膠體金的燒制用雙蒸水將1%氯金酸稀釋成0.01%，置電爐煮沸，按每IOO 毫升0.01%氯金酸加入4毫升1%檸檬酸三納，繼續(xù)煮沸，直到液體呈亮紅色即停 止加熱，冷卻至室溫后補足失水。外觀應純凈，透亮，無沉淀和漂浮物。
金標抗體的制備用0. 1M碳酸鉀調膠體金pH值至7. 6，按10微克抗體/毫升 膠體金加入抗豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的單克隆抗體，混勻，靜置30分鐘， 12000rpm離心三十分鐘，棄上清，沉淀用標記洗滌液洗滌兩次，最后一次棄去上 清，將沉淀用十分之一初始膠體金體積的金標抗體保存液溶解，置fC備用，效期 一周。
D. 金條抗體的干燥
將標記好的膠體金均勻地鋪在玻璃纖維膜上，每毫升溶液鋪10平方厘米，干 燥，封袋，置4"C備用。
E. 金標抗體包被的玻璃纖維膜寬度的確定
將膠體金玻璃纖維膜裁成4毫米、5毫米、6毫米規(guī)格，與包被膜組成測試條，每條寬4毫米。選擇能檢出室內質控樣本，無非特異性反應的金標玻璃纖維膜寬度 定為使用寬度。
F. 金標抗體玻璃纖維膜的裁切
根據(jù)滴配實驗確定的寬度，將金標抗體玻璃纖維膜進行裁切，置干燥房間備用。
G. 吸水紙的裁切
用裁紙機將吸水紙切成35厘米長，4.2厘米寬，置于干燥房間備用。
H. 玻璃纖維膜的裁切這是沒有標記抗體的玻璃纖維膜，其起到引導液體流動 通路的作用。
將玻璃纖維模切成長35厘米，寬2厘米的長條，置于干燥房間備用。
I. 大板的粘貼
按要求把包被膜4、吸水紙5、已經(jīng)涂覆在玻璃纖維膜的凍干金標抗體、玻璃 纖維膜3粘貼在塑料底板上，組成大板。組裝車間溫度控制在25。C，濕度20%-30 % 。
J.切條
用切條機將大板切成單頭份，每份寬度3毫米，隨機抽檢，靈敏度能檢出室內 質控，條帶顯色程度達到一個"+ "號，無非特異性條帶。 K.封裝與組盒
將1份已切好的試紙條與一包干燥劑封裝在鋁箔塑料袋內，放入試劑盒，與4-20
"c避光保存。
本實用新型所述的一種快速檢測豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的膠體金測試試 紙條，采用高純度的抗豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的單克隆抗體作為包被抗原進行 特異的豬繁殖與呼吸道綜合征病毒檢查。其原理是試紙條中含均勻分布的膠體金標 記豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的單克隆抗體，抗豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的抗體
及抗鼠IgG抗體分別固定于硝酰膜上并呈兩條線上下排列，抗鼠IgG抗體在上方為 陰性對照，抗豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的抗體在下方為檢測線。所述檢測線和控 制線通過控制膠體金顆粒的大小與多少，得到顏色不同深淺的檢測線和控制線從而 確定豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的有無。當被檢樣中含有豬繁殖與呼吸道綜合征病 毒的抗原時，豬繁殖與呼吸道綜合征病毒先和金標記的豬繁殖與呼吸道綜合征病毒 的抗體進行特異性吸附，形成Ag-Ab3復合物。由于微孔濾膜的毛細管作用和層析 作用，反應復合物沿硝酰膜向前移動，待行至抗a豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的抗 體線時，形成Aba-Ag-AbP-Au復合物而富集在包被線上，最終形成一條紅色沉淀線，是為豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的陽性反應。而試紙條上無關的金標記鼠IgG 繼續(xù)上行至抗鼠IgG抗體處，與之形成紅色標記的抗原抗體復合物是為陰性對照。 用于檢測時，觀察檢測線6和控制線7的顯色和形狀來判斷陽性還是陰性。如
圖3，當檢測線6和控制線7均顯色時，結果為陽性；如圖4所示，當控制線7顯 色而檢測線6不顯色時，結果為陰性。圖5為試紙條無效的示意圖(包被膜4表面 的檢測線6和控制線7均不顯色)。
權利要求1、一種快速檢測豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的膠體金測試試紙條，其特征在于包括底襯(1)、樣品墊(2)、涂覆膠體金顆粒標記抗體的玻璃纖維膜(3)、包被膜(4)和吸水紙(5)，包被膜(4)的底面粘帖在底襯(1)上面，在該包被膜(4)兩端的上面分別粘帖玻璃纖維膜(3)和吸水紙(5)，在該玻璃纖維膜(3)的另一端的上面粘帖樣品墊(2)；在該包被膜(4)的上面設有檢測線(6)和控制線(7)，該檢測線(6)包被處理好的豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的抗體，該控制線(7)包被處理好的抗鼠抗體。
2、 根據(jù)權利要求1所述的快速檢測豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的膠體金測試 試紙條，其特征在于所述的豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的抗體為高純度的抗單克 隆抗體和/或多克隆抗體；所述膠體金顆粒標記抗體為抗豬繁殖與呼吸道綜合征病 毒的單克隆抗體；抗豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的抗體及抗鼠IgG抗體分別固定于 硝酰膜上并呈兩條線上下排列，構成所述的檢測線(6)和控制線(7)。
專利摘要一種快速檢測豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的膠體金測試試紙條，包括底襯、樣品墊、涂覆金標抗體的玻璃纖維膜、包被膜和吸水紙，包被膜的底面粘帖在底襯上面，在該包被膜兩端的上面分別粘帖玻璃纖維膜和吸水紙，在該玻璃纖維膜的另一端的上面粘帖樣品墊；在該包被膜的上面設有檢測線和控制線，該檢測線包被豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的抗體，該控制線包被抗鼠抗體。該試紙條具有高度特異性、靈敏度、檢測速度等優(yōu)點，且不需使用儀器設備，成本低廉，操作簡便，能廣泛應用于現(xiàn)地農戶、基層及個人對于豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的檢測。
文檔編號G01N33/577GK201397334SQ20092015067
公開日2010年2月3日 申請日期2009年5月18日 優(yōu)先權日2009年5月18日
發(fā)明者崔尚金 申請人:中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所