一種檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒的恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種試劑盒及其應(yīng)用，尤其是一種檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒 的恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 發(fā)熱伴血小板減少綜合征（severefeverwitht虹omboc}ftopenia syn化ome，SFT巧是威脅我國人民健康和公共衛(wèi)生安全的重要新發(fā)傳染病，其臨床表現(xiàn)W發(fā) 熱伴血小板、白細(xì)胞減少和消化道癥狀為主要特征，重癥死亡率高達(dá)15~30%。SFTS很容 易與血液、消化、呼吸等多系統(tǒng)疾病相混淆，加上臨床醫(yī)生對其缺乏認(rèn)知，給該病的診斷和 鑒別診斷帶來困難。發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSvirus,SFTSV)需要通過實(shí)驗(yàn)室 手段進(jìn)行確診，常用的方法有病毒分離培養(yǎng)、病毒核酸檢測和免疫學(xué)檢測等。病毒分離和免 疫學(xué)檢測或是操作復(fù)雜、費(fèi)時，不能快速得到檢測結(jié)果，或是檢測敏感度不夠。當(dāng)前，基于 PCR技術(shù)（常規(guī)PCR或巧光定量PCR)對病毒核酸進(jìn)行檢測是對SFTS進(jìn)行早期快速診斷的 重要手段。PCR技術(shù)具有檢測敏感性高，操作簡單、快速等優(yōu)點(diǎn)，然而其前期投入費(fèi)用較大 (對實(shí)驗(yàn)室功能分區(qū)W及PCR儀的依賴），而且易受實(shí)驗(yàn)室污染而導(dǎo)致假陽性，加上SFTS為 人獸共患自然疫源性疾病，多發(fā)生于山區(qū)和丘陵等醫(yī)療衛(wèi)生條件相對較差的地區(qū)，所W，亟 待建立一種快速、可靠的，適合基層單位和現(xiàn)場應(yīng)用的SFTSV核酸檢測技術(shù)。申請人檢索發(fā) 現(xiàn)W下相關(guān)專利申請：①新型布尼亞病毒環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增檢測方法及試劑盒，申請 號：201510018039.0,公開了檢測新型布尼亞病毒的方法和試劑盒，反應(yīng)體系中添加了外源 性染料，通過染料的顏色變化觀察樣品。②一種新布尼亞病毒的恒溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒及檢 測方法，【申請?zhí)枴?01410795993. 6,公開了快速檢測新布尼亞病毒的試劑盒，并不能對核酸 的逆轉(zhuǎn)錄步驟進(jìn)行監(jiān)測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提出一種檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合 征病毒的恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒及應(yīng)用，適合基層單位和現(xiàn)場應(yīng)用的，能夠快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢 測出發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒核酸。
[0004] 本發(fā)明通過W下技術(shù)方案解決技術(shù)問題，首先提供一組檢測發(fā)熱伴血小板減少綜 合征病毒的寡核巧酸，包括上下游鏈置換引物、上下游探針和交叉擴(kuò)增引物； 陽〇化]所述上下游鏈置換引物分別為
[0006] SFTS-M-F3：5^ -TGGATGTTGGCCACTCTC-3^ ；
[0007]SFTS-M-B3:5< -TTCTTCTGATTCAGAACA-3';
[0008] 所述上下游探針分別為
[0009] 上游5'端FITC標(biāo)記探針
[0010] SFTS-M-DWF:5f-FnC-GAGAGCTCATCCAAGGAT-3<;
[0011] 下游5'端Biotin標(biāo)記探針
[0012] SFTS-M-D巧B:5< -Biotin-AGCACAAGACCAAATGGGT-3< ;
[0013] 所述交叉擴(kuò)增引物為
[0014]SFTS-M-CPR：
[0015] 5 ^-AGCACAAGACCAAATGGGTTCCCTTCCTTATAGC
[0016]ACAC-3'。
[0017] 本發(fā)明進(jìn)一步提供含有寡核巧酸的檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒的恒溫?cái)U(kuò) 增試劑盒，包括W下組分： 陽01引 （I)RNA提取試劑；
[0019] (2)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液，包括1XBstBuffer、甜菜堿、M拆〇4、dNTPs、RNase抑制劑、 BstDNA聚合酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、滅菌去離子水、所述上下游鏈置換引物、上下游探針和一條 交叉擴(kuò)增引物；
[0020] (3)陽性對照模板，為發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒M基因片段的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物； [OOW(4)陰性對照，滅菌去離子水。 陽02引 進(jìn)一步地，所述恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液含有抑=8. 820mMTris-肥1、IOmMKCl、 10mM(NH4)2S04、6mMMgS04、0.l%TritonX-100%、8UBstDNA聚合酶、IOUAMV逆轉(zhuǎn)錄酶、IM甜菜堿、IOURNaseInhibitor、dNTPs各0.8mM、上下游鏈置換引物各O.lyM、上下游探針 各0.3~0.5yM、交叉擴(kuò)增引物0.5yM。
[0023] 所述陽性對照模板按如下步驟制備，W下游鏈置換引物和帶有T7啟動子的上游 鏈置換引物對發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒的基因組RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；利用PCR產(chǎn)物 純化試劑盒對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；WT7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄目的RNA片段；W紫外分光光 度計(jì)測Aze。對RNA片段進(jìn)行定量，將陽性對照模板稀釋至10 5拷貝/y1，分裝后-20°C保存。
[0024] 本發(fā)明還提供檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒的恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒的應(yīng)用，包括 W下步驟： 陽0巧]第一步、用RNA提取試劑從待檢標(biāo)本中提取病毒RNA;
[00%] 第二步、將步驟一提取得到的病毒RNA作為模板加入到裝有恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的PCR管中；對照PCR管中分別加入陽性對照模板和陰性對照；60°C擴(kuò)增反應(yīng)60min;
[0027] 第S步、將反應(yīng)后的PCR管置入垂直流動核酸試紙條防污染檢測裝置（杭州優(yōu)思 達(dá)生物技術(shù)公司）中進(jìn)行檢測，5min后判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果：當(dāng)試紙條的質(zhì)控線和檢測線均呈紅 色時，為陽性，說明樣品中含有發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒核酸；當(dāng)試紙條的質(zhì)控線呈紅 色，而檢測線為無色時，為陰性，說明樣品中不含有發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒核酸；當(dāng) 試紙條的質(zhì)控線呈無色時，無論檢測線是否為紅色，均表明實(shí)驗(yàn)失敗，再對樣品進(jìn)行重復(fù)檢 測。
[0028] 上述方法的所述垂直流動核酸試紙條防污染檢測裝置中，試紙條位于帶有不干膠 的襯墊上，按順序依次為樣品墊、有色顆粒結(jié)合物墊、纖維膜和吸水濾紙墊，上述各部分在 相鄰處部分重疊，其中有色顆粒結(jié)合物墊上的有色顆粒包被有親和素；纖維膜上設(shè)有檢測 線和質(zhì)控線，其中檢測線上包被有抗FITC抗體，質(zhì)控線上包被有生物素。
[0029] 本發(fā)明試劑盒中的5條寡核巧酸引物在BstDNA聚合酶高活性的鏈置換特性下， 對AMV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的CDNA進(jìn)行不斷的DNA鏈置換擴(kuò)增循環(huán)，并將垂直流動核酸 試紙條檢測系統(tǒng)應(yīng)用到恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物的檢測中，建立了發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒核酸 的恒溫?cái)U(kuò)增檢定性檢測方法。本發(fā)明所提供的發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒恒溫?cái)U(kuò)增檢測 試劑盒及其檢測方法具有非常好的信號-噪聲比，所設(shè)計(jì)的引物和探針具有非常好的特異 性，能準(zhǔn)確區(qū)分發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒和其它在遺傳學(xué)上或臨床上相關(guān)的病毒。通 過對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，包括引物、探針序列及濃度，Mg2+濃度、反應(yīng)溫度W及反應(yīng)時間等， 該試劑盒的檢測靈敏度可達(dá)到100拷貝分子/反應(yīng)，可W滿足快速檢測發(fā)熱伴血小板減少 綜合征病毒的需要。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果是：整個核酸擴(kuò)增和檢測過程均不 需要打開PCR管蓋，減少了擴(kuò)增產(chǎn)物污染的機(jī)會，反應(yīng)體系中無外源性染料，不會抑制擴(kuò)增 反應(yīng)，同時采用封閉式試紙條對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測更為客觀，避免了樣品弱陽型時肉眼觀 察染料顏色變化的主觀性；采用發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒M基因片段的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 作為陽性對照模板，更好地模擬了病毒核酸，能夠?qū)Σ《緳z測過程中的核酸逆轉(zhuǎn)錄步驟進(jìn) 行監(jiān)測，同時，本發(fā)明經(jīng)過臨床樣本檢測的驗(yàn)證，具備較好的臨床檢測效果。綜上所述，本發(fā) 明不僅克服了普通PCR和巧光定量PCR對實(shí)驗(yàn)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)儀器的依賴，使得發(fā)熱伴血小板 減少綜合征病毒的現(xiàn)場檢測成為可能，而且具有檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作步驟簡單、 可重復(fù)性高、反應(yīng)時間短等特性，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0030] 圖1為核酸試紙條檢測原理圖。
[0031] 圖2為試劑盒用于發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒檢測的敏感性試驗(yàn)結(jié)果。
[0032]圖3為試劑盒用于發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒檢測的特異性試驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】W33] 實(shí)施例一
[0034] 本實(shí)施例發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒恒溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒的組成如下： 陽03引①RNA提取試劑：德國Qiagen病毒RNA提取試劑盒（Qia-52904);
[0036]②恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液：20mMTris-肥 1(抑=8. 8)、10mMKCl、10mM(NH4)2S〇4、6mM M拆〇4、0.l%TritonX-100%、8UBstDNA聚合酶、IOUAMV逆轉(zhuǎn)錄酶、IM甜菜堿、IOURNase Inhibitor、dNTPs各0. 8mM、上下游鏈置換引物各0. 1Ji