在斷奶之前對抗豬繁殖與呼吸綜合征(prrs)病毒的有效疫苗接種的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供包含編碼感染性RNA序列的DNA序列的經(jīng)分離多核苷酸分子，所述感染性RNA序列編碼遺傳修飾北美PRRS病毒；所述病毒和相關(guān)多肽、多核苷酸以及各種組分的制造方法。還提供了包含所述遺傳修飾病毒和多核苷酸的疫苗以及一種用于區(qū)分自然感染的動(dòng)物與接種疫苗的動(dòng)物的診斷試劑盒。
203489
1998.11.19

203488
1998.11.19
【專利說明】在斷奶之前對抗豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)病毒的有效 疫苗接種

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是在動(dòng)物健康領(lǐng)域中并且針對正極性RNA病毒、新穎RNA病毒以及其經(jīng)修 飾的活的形式的感染性cDNA克隆，并且使用所述cDNA克隆構(gòu)造疫苗，具體來說，豬疫苗。 更具體地說，本發(fā)明還提供了豬崽在斷奶之前的安全并且早期疫苗接種，包括從出生之后 即刻（即僅1日齡或更?。┑絻芍荦g，在所有時(shí)間任選地與多價(jià)組合豬疫苗組合，例如二價(jià) PRRSV/豬肺炎支原體（Mycoplasmahyopneumoniae;M.hyo)疫苗、二價(jià)PRRSV/2型豬圓環(huán)病 毒（PCV2)疫苗以及三價(jià)PRRSV/M.hyo/PCV2疫苗，或簡單地單價(jià)PRRSV疫苗。在所述條件 下對抗PRRS的早期疫苗接種提供保護(hù)性免疫的早發(fā)，所述保護(hù)性免疫在接種疫苗之后不 遲于約14天，即在生命第1天接種疫苗之后在第15天、在生命第7天接種疫苗之后在第21 天以及在生命第14天接種疫苗之后在不遲于約第28天出現(xiàn)。雖然本發(fā)明說明書提供了北 美PRRS病毒的"P129病毒株"的許多構(gòu)造體（參見PCT/IB2011/055003和US6, 500, 662)， 它們可作為高效疫苗，包括用于所述早期和安全使用，但是已經(jīng)確定，所述保護(hù)性免疫的早 發(fā)（即在早在出生之后第1天給予的接種疫苗免疫之后約2周）也適用于其它北美和歐洲 PRRS病毒株的使用，例如在US5, 476, 778、US5, 846, 805、US6, 380, 376、US6, 982, 160 以 及US6, 197, 310中所述的那些。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)的特征在于大母豬和小母豬中的流產(chǎn)、死產(chǎn)以及其 它繁殖問題，以及幼豬中的呼吸道疾病。病原體是PRRS病毒（PRRSV)，動(dòng)脈炎病毒科和巢 狀病毒目的一個(gè)成員。巢狀病毒是具有由單股正極性RNA組成的基因組的包膜病毒。正鏈 RNA病毒的基因組RNA實(shí)現(xiàn)了在遺傳信息的儲(chǔ)存和表達(dá)兩方面的雙重作用。沒有DNA參與 巢狀病毒的復(fù)制或轉(zhuǎn)錄。非結(jié)構(gòu)蛋白從巢狀病毒的基因組RNA直接轉(zhuǎn)譯為大多蛋白并且 隨后被病毒蛋白酶裂解成樸素的功能蛋白。從所述基因組合成3'-同末端成套次基因組 RNA(SgRNA)并將其用作用于結(jié)構(gòu)蛋白的轉(zhuǎn)譯的信使RNA。因此，巢狀病毒基因組RNA的復(fù) 制是基因組復(fù)制與sgRNA合成的一個(gè)組合過程。
[0003] 在1980年代后期，幾乎同時(shí)出現(xiàn)了所述病毒的兩種不同基因型，一種在北美洲而 另一種在歐洲。PRRS病毒現(xiàn)在是幾乎所有產(chǎn)豬國家的地方性病毒，并且被認(rèn)為是影響全球 豬肉行業(yè)的經(jīng)濟(jì)上最重要疾病之一。另外，已經(jīng)在中國和周邊國家分離出毒性極強(qiáng)的基因 型，并且所述基因型一般與北美基因型相關(guān)。
[0004] 盡管在了解PRRSV的生物學(xué)方面取得了顯著進(jìn)展，但是所述病毒的控制仍然困 難。已證實(shí)本領(lǐng)域中動(dòng)物的疫苗接種基本無效。PRRS通常在經(jīng)免疫的畜群中重新出現(xiàn)，并 且大部分農(nóng)場上PRRSV疫苗接種運(yùn)動(dòng)最終未能控制所述疾病。
[0005] 不受理論限制，使豬感染野生型PRRSV或用這種病原體的活減毒形式對其進(jìn)行疫 苗接種不幸地僅僅引發(fā)非中和抗體的大量產(chǎn)生。在這個(gè)時(shí)間間隔期間，舉例來說，產(chǎn)生了 僅有限數(shù)量的干擾素（IFN)-Y分泌細(xì)胞。因此，PRRSV似乎本能地刺激以一貫豐富的體液 (基于抗體）免疫和可變并且有限但潛在保護(hù)性T輔助細(xì)胞（Th) 1樣IFN-γ反應(yīng)為特征的 不平衡的免疫反應(yīng)。最可能有助于適應(yīng)性免疫的不平衡發(fā)展的PRRSV感染的一個(gè)特征是缺 乏足夠的先天性免疫反應(yīng)。通常，病毒感染的細(xì)胞分泌I型干擾素"IFN"（包括IFN-α和 IFN-β)，它保護(hù)鄰近細(xì)胞不被感染。另外，所釋放的I型IFN與一子組初始T細(xì)胞相互作 用以促進(jìn)其轉(zhuǎn)化成病毒特異性II型IFN(IFN-γ)分泌細(xì)胞。相比之下，豬對PRRSV暴露的 IFN-α反應(yīng)幾乎不存在。病原體對IFN-α產(chǎn)生的如此低效的刺激預(yù)計(jì)將對宿主的適應(yīng)性 免疫反應(yīng)的性質(zhì)具有顯著影響，因?yàn)镮FN-α上調(diào)IFN-Y基因表達(dá)。因此，前一種細(xì)胞因子 控制促進(jìn)適應(yīng)性免疫（即，T細(xì)胞介導(dǎo)的IFN-γ反應(yīng)和峰值抗病毒免疫防御）的發(fā)展的主 要路徑。
[0006] 就此而言，顯然病毒感染中的先天性與適應(yīng)性免疫之間的可能聯(lián)系通過一種特殊 類型的樹突狀細(xì)胞發(fā)生，這種細(xì)胞具有產(chǎn)生大量I型干擾素的能力，并且它在T細(xì)胞功能 的極化中起關(guān)鍵作用。具體來說，一種罕見但顯著類型的樹突狀細(xì)胞漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞 (PDC)，也稱為天然的IFN-α/β產(chǎn)生細(xì)胞，借助于其引起初始T細(xì)胞分化成IFN-Y分泌細(xì) 胞的能力而在抗病毒免疫中起關(guān)鍵作用。雖然稀有，但是PDC是IFN-α的強(qiáng)有力生產(chǎn)者，每 一個(gè)細(xì)胞都能夠響應(yīng)于病毒產(chǎn)生3-lOpgIFN-a。相比之下，單核細(xì)胞每一個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生1/10 至Ij1/5的IFN-α。已經(jīng)描述了豬PDC的表現(xiàn)型和一些生物特性（薩默菲爾德（Summerfield) 等人，2003,免疫學(xué)（Immunology) 110:440)。最新的研究已經(jīng)確定，PRRSV不刺激豬H)C 分泌IFN-α(卡爾扎達(dá)（Calzada)等人，2010,獸醫(yī)免疫學(xué)與免疫病理學(xué)（Veterinary ImmunologyandImmunopathology)135:20)〇
[0007] 這個(gè)事實(shí)與在接種疫苗時(shí)外源地添加IFN-α的觀察結(jié)果的結(jié)合已被發(fā)現(xiàn)可以改 良PRRSV特異性IFN-γ反應(yīng)的強(qiáng)度（W.A.邁耶（W.A.Meier)等人，獸醫(yī)免疫學(xué)與免疫病 理學(xué)（Vet.Immunol.Immunopath.) 102，第 299 頁-第 314 頁，2004)，突出了IFN-α在豬感 染這種病毒期間所起的關(guān)鍵作用。鑒于IFN-α對保護(hù)性免疫的發(fā)展的明顯關(guān)鍵作用，確定 不同PRRS病毒儲(chǔ)備液刺激和/或抑制IFN-α的產(chǎn)生的能力是重要的。因此，存在對用于 保護(hù)對抗PRRS的新的并且改良的經(jīng)修飾活疫苗的迫切需要。如下所述，顯然來源于新穎感 染性cDNA克隆、pCMV-S-P129-PK等的病毒的表現(xiàn)型不同于野生型Ρ129病毒或兩種市售經(jīng) 修飾活PRRS疫苗。不受理論限制，本發(fā)明提供促進(jìn)對抗病毒的基于細(xì)胞的免疫反應(yīng)并且定 義PRRS疫苗的新的并且有效的產(chǎn)生的疫苗。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 在第一實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種包括編碼感染性RNA分子的DNA序列的經(jīng)分離 多核苷酸分子，所述感染性RNA分子編碼PRRS病毒，所述病毒經(jīng)遺傳修飾以使得作為一種 疫苗，它在豬科動(dòng)物中引發(fā)對抗PRRS病毒的有效免疫保護(hù)性反應(yīng)。在某些方面，本發(fā)明提 供一種如本文中所述的DNA序列，包括SEQIDNO. :1、SEQIDNO. : 2、SEQIDNO. : 3、SEQ IDNO. :4或SEQID:NO:6,或與其至少70%-致，優(yōu)選地與其80%-致，并且更優(yōu)選地與其 85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%-致的序列。
[0009] 在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種質(zhì)粒，它包括如本文中所述的經(jīng)分離多核苷酸 分子和能夠在合適的宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄所述多核苷酸分子的啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施例中，質(zhì) 粒的北美或中國PRRS編碼序列在本文中進(jìn)一步編碼一或多種可檢測的異源抗原表位。本 發(fā)明提供一種包括本文中所述的質(zhì)粒的經(jīng)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。
[0010] 在另一方面，本發(fā)明提供一種用于保護(hù)豬科動(dòng)物不被PRRS病毒感染的疫苗。所述 疫苗可以包括由感染性RNA分子編碼的北美或中國PRRS病毒、所述感染性RNA分子或質(zhì) 粒，其中每一者都由本文中所述的經(jīng)分離多核苷酸分子編碼。在又另一方面，所述疫苗包括 含有本文中的多核苷酸的病毒載體。本文中所述的疫苗可以任選地包括獸用可接受的疫苗 載劑。在一個(gè)重要方面，所述疫苗具有相比于野生型P129PRRS病毒有所降低的干擾素-α 抑制作用（參見ATCC203488、203489、美國專利第6,500,662號）。
[0011] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供包括多核苷酸分子的診斷試劑盒，它區(qū)分（所謂的 DIVA測試）自然感染有PRRS病毒的野外病毒株的豬科動(dòng)物與接種本文中所述的經(jīng)修飾活 疫苗的豬科動(dòng)物。
[0012] 在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種保護(hù)豬科動(dòng)物不感染PRRS病毒的病毒株的方 法，包括向所述動(dòng)物投與免疫保護(hù)量的本文中所述權(quán)利要求書的疫苗。
[0013] 本發(fā)明的其它并且優(yōu)選的實(shí)施例包括一種經(jīng)分離的豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRS)或一種編碼所述病毒的多核苷酸序列，其中由ORFla編碼的蛋白質(zhì)選自由含有以 下氨基酸序列中的任一者的蛋白質(zhì)組成的群組，其中帶下劃線的殘基被認(rèn)為是新穎的： AMANVYD(SEQIDNO:9) ；IGHNAVM(SEQIDNO:12) ；TVPDGNC(SEQIDNO:15) ；CWWYLFD(SEQ IDNO:18) ；HGVHGKY(SEQIDN0:21) ；AAKVDQY(SEQIDN0:24) ；PSATDTS(SEQIDN0:27)； LNSLLSK(SEQIDNO:30) ；APMCQDE(SEQIDNO:33) ；CAPTGMD(SEQIDNO:36) ；PKVAKVS(SEQ IDN0:39);AGEIVGV(SEQIDN0:42);ADFNPEK(SEQIDN0:45);#&QTPILGR(SEQID N0:48)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種經(jīng)分離的北美或中國PRRS，它含有 從ORFla編碼的蛋白質(zhì)內(nèi)的以上所鑒別序列中的任一者，包括這些所鑒別序列的任何組合 (2、3、4……直到17)。
[0014]本發(fā)明進(jìn)一步提供一種經(jīng)分離豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRS)，其中其由ORFla 編碼的蛋白質(zhì)選自由含有以下中的任一者的那些氨基酸序列組成的群組：AMV(參見SEQID N0:9);HMA(參見SEQIDN0:12) ;P2G(參見SEQIDN0:15);WIL(參見SEQIDN0:18); VHG(參見SEQIDN0:21) ;KYD(參見SEQIDN0:24) ;AJ：D(參見SEQIDN0:27) ;SLL(參 見SEQIDN0:30) ;M￡Q(參見SEQIDN0:33) ;P：￡G(參見SEQIDN0:36) ;VAK(參見SEQ IDNO:39);EIV(參見SEQIDNO:42);FMP(參見SEQIDNO:45);以及PIL(參見SEQID N0:48)，包括這些所鑒別序列的任何組合（2、3、4……直到17)。
[0015] 在另一優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種經(jīng)分離北美或中國PRRS，其中不考慮編碼 病毒的多核苷酸或自其編碼的蛋白質(zhì)中在任何指向的任何其它特定的核苷酸或氨基酸序 列位置的一致性，ORFla病毒蛋白含有：
[0016] (a)在指定序列中的以下特定氨基酸中的任一者，
[0017] 在氨基酸序列AP(參見SEQIDNO:9)內(nèi)的氨基酸N;
[0018] 在氨基酸序列HM(參見SEQIDNO: 12)內(nèi)的氨基酸N;
[0019] 在氨基酸序列PQG(參見SEQIDNO: 15)內(nèi)的氨基酸D;
[0020] 在氨基酸序列WIL(參見SEQIDNO: 18)內(nèi)的氨基酸Y;
[0021] 在氨基酸序列VHG(參見SEQIDNO: 21)內(nèi)的氨基酸H;
[0022] 在氨基酸序列KYD(參見SEQIDNO: 24)內(nèi)的氨基酸V;
[0023] 在氨基酸序列AID(參見SEQIDNO:27)內(nèi)的氨基酸T;
[0024] 在氨基酸序列SLL(參見SEQIDNO:30)內(nèi)的氨基酸L;
[0025] 在氨基酸序列M￡Q(參見SEQIDNO:33)內(nèi)的氨基酸C;
[0026] 在氨基酸序列PIG(參見SEQIDNO:36)內(nèi)的氨基酸T;
[0027] 在氨基酸序列VAK(參見SEQIDNO: 39)內(nèi)的氨基酸A;
[0028] 在氨基酸序列EIV(參見SEQIDNO:42)內(nèi)的氨基酸I;
[0029] 在氨基酸序列FNP(參見SEQIDNO: 45)內(nèi)的氨基酸N;以及
[0030]在氨基酸序列PIL(參見SEQIDNO:48)內(nèi)的氨基酸I，包括這些所鑒別序列的任 何組合（2、3、4……直到17)，或
[0031] (b)含有在任何其它北美或中國PRRS病毒的對應(yīng)于如上所指定的3-殘基序列的 指定3-殘基ORFla肽序列中的所述特定帶下劃線的單一氨基酸，這是考慮到所述其它特定 的3-殘基氨基酸序列可以顯示一個(gè)或兩個(gè)附加氨基序列改變，但是仍然認(rèn)為對應(yīng)于以上 所指定的序列。為了本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施例，"對應(yīng)"意指可以使用如在赫尼霍夫（Henikoff) 等人美國國家科學(xué)院院刊（ProcNatl.Acad.Sci.，USA)，89,第10915頁-第10919頁，1992 中所述的BLOSUM算法最佳地比對相對序列。
[0032] 在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，提供一種經(jīng)分離的豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRS)，其中其由ORFla編碼的蛋白質(zhì)具有含有變異（a)、（b)、（c)以及（d)中的一或多者 的氨基酸序列，其中每一種所述變異定義如下：
[0033] 變異（a)，
[0034] 在氨基酸序列AP(參見SEQIDNO:9)內(nèi)的氨基酸N;
[0035] 在氨基酸序列HM(參見SEQIDNO: 12)內(nèi)的氨基酸N;
[0036] 在氨基酸序列PQG(參見SEQIDNO: 15)內(nèi)的氨基酸D;
[0037] 在氨基酸序列WIL(參見SEQIDNO: 18)內(nèi)的氨基酸Y;
[0038] 在氨基酸序列VHG(參見SEQIDNO: 21)內(nèi)的氨基酸H;或變異（a)的任何子組；
[0039] 變異（b)，
[0040] 在氨基酸序列KYD(參見SEQIDNO: 24)內(nèi)的氨基酸V;
[0041] 在氨基酸序列AID(參見SEQIDNO:27)內(nèi)的氨基酸T;
[0042] 在氨基酸序列SLL(參見SEQIDNO:30)內(nèi)的氨基酸L;
[0043] 在氨基酸序列M￡Q(參見SEQIDNO:33)內(nèi)的氨基酸C;或變異（b)的任何子組；
[0044] 變異（c)，
[0045] 在氨基酸序列PIG(參見SEQIDNO:36)內(nèi)的氨基酸T;
[0046] 在氨基酸序列VAK(參見SEQIDNO: 39)內(nèi)的氨基酸A;或變異（c)的任何子組； 以及
[0047] 變異（d)，
[0048] 在氨基酸序列EIV(參見SEQIDNO:42)內(nèi)的氨基酸I;
[0049] 在氨基酸序列FNP(參見SEQIDNO:45)內(nèi)的氨基酸N;
[0050] 以及在氨基酸序列PIL(參見SEQIDNO:20)內(nèi)的氨基酸I;或其變異（d)的任何 子組。
[0051]所述PRRS病毒可以進(jìn)一步含有在變異（a)中所鑒別的五個(gè)氨基酸序列中的兩個(gè) 或更多個(gè)，和/或在變異（b)中所鑒別的四個(gè)氨基酸序列中的兩個(gè)或更多個(gè)，和/或在變異 (c)中所鑒別的兩個(gè)氨基酸序列，和/或在變異（d)中所鑒別的三個(gè)氨基酸序列中的兩個(gè)或 更多個(gè)。
[0052] 本發(fā)明還提供了一種能夠直接轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞并且從如此轉(zhuǎn)染的合適的宿 主細(xì)胞表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRS)的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含：(a)編碼感染性RNA 分子的DNA序列，所述感染性RNA分子編碼PRRS病毒，和（b)能夠轉(zhuǎn)錄所述感染性RNA分 子的啟動(dòng)子，其中由所述病毒的ORFla編碼的蛋白質(zhì)具有含有以下的氨基酸序列：
[0053] (1)在氨基酸序列AP(參見SEQIDNO:9)內(nèi)的氨基酸N;
[0054] 在氨基酸序列HM(參見SEQIDNO: 12)內(nèi)的氨基酸N;
[0055] 在氨基酸序列PQG(參見SEQIDNO: 15)內(nèi)的氨基酸D;
[0056] 在氨基酸序列WIL(參見SEQIDNO: 18)內(nèi)的氨基酸Y;
[0057] 在氨基酸序列VHG(參見SEQIDNO: 21)內(nèi)的氨基酸H，或其任何子組；和/或
[0058] (2)在氨基酸序列KYD(參見SEQIDNO: 24)內(nèi)的氨基酸V;
[0059] 在氨基酸序列AID(參見SEQIDNO:27)內(nèi)的氨基酸T;
[0060] 在氨基酸序列SLL(參見SEQIDNO: 30)內(nèi)的氨基酸L;
[0061] 在氨基酸序列M￡Q(參見SEQIDNO: 33)內(nèi)的氨基酸C，或其任何子組；和/或
[0062] (3)在氨基酸序列PIG(參見SEQIDNO: 36)內(nèi)的氨基酸T;
[0063] 在氨基酸序列VAK(參見SEQIDNO: 39)內(nèi)的氨基酸A，或其任何子組；和/或
[0064] (4)在氨基酸序列EIV(參見SEQIDNO:42)內(nèi)的氨基酸I;
[0065] 在氨基酸序列FNP(參見SEQIDNO:45)內(nèi)的氨基酸N;
[0066] 在氨基酸序列PIL(參見SEQIDNO:48)內(nèi)的氨基酸I;或其任何子組。
[0067] 應(yīng)了解，ORFla編碼包含蛋白酶功能的多蛋白，并且ORFlb編碼包含復(fù)制酶（RNA聚 合酶）和解螺旋酶功能的多蛋白。關(guān)于從PRRS的各種ORF(開放閱讀框）編碼的蛋白質(zhì)的 功能的附加信息可見于例如美國專利第7, 132, 106號中。關(guān)于0RF7和其它開放閱讀框的 功能，還參見美國專利第7, 544, 362號。如在本領(lǐng)域中應(yīng)了解，預(yù)計(jì)ORFl編碼的蛋白質(zhì)具 有已知和未知的附加功能，并且適用于本發(fā)明實(shí)踐中的新穎氨基酸改變通過其對ORFl編 碼的蛋白質(zhì)的任何一種特定功能的作用而不受限制。
[0068] 在其它優(yōu)選實(shí)施例中，所述質(zhì)粒含有一種啟動(dòng)子，它是能夠允許目標(biāo)真核細(xì)胞中 的DNA發(fā)射的真核啟動(dòng)子，或能夠指導(dǎo)質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)錄的原核或噬菌體啟動(dòng)子。本發(fā)明類 似地提供一種產(chǎn)生PRRS病毒的方法，所述方法包含用適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞并 且獲得由轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的PRRS病毒。
[0069] 因此，在特定并且優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種包含編碼感染性RNA分子的 DNA序列的經(jīng)分離多核苷酸分子，所述感染性RNA分子編碼北美PRRS病毒，其中所述DNA序 列選自由以下組成的群組：
[0070] (a)SEQIDNO: 6 ;
[0071] (b)與（a)的DNA序列至少85%-致的序列，其中其由ORFla編碼的蛋白質(zhì)具有 含有以下的氨基酸序列：
[0072] 來自組（b)(1)
[0073] 在氨基酸序列AP(參見SEQIDNO:9)內(nèi)的氨基酸N;
[0074] 在氨基酸序列HM(參見SEQIDNO: 12)內(nèi)的氨基酸N;
[0075] 在氨基酸序列PSG(參見SEQIDNO: 15)內(nèi)的氨基酸D;
[0076] 在氨基酸序列WIL(參見SEQIDNO: 18)內(nèi)的氨基酸Y;
[0077] 在氨基酸序列VHG(參見SEQIDNO: 21)內(nèi)的氨基酸H，或其任何子組；和/或
[0078]來自組（b)(2)
[0079] 在氨基酸序列KYD(參見SEQIDNO: 24)內(nèi)的氨基酸V;
[0080] 在氨基酸序列AID(參見SEQIDNO:27)內(nèi)的氨基酸T;
[0081] 在氨基酸序列SLL(參見SEQIDNO:30)內(nèi)的氨基酸L;
[0082] 在氨基酸序列M￡Q(參見SEQIDNO: 33)內(nèi)的氨基酸C，或其任何子組；和/或
[0083]來自組（b)(3)
[0084] 在氨基酸序列PIG(參見SEQIDNO:36)內(nèi)的氨基酸T;
[0085] 在氨基酸序列VAK(參見SEQIDNO: 39)內(nèi)的氨基酸A，或其任何子組；和/或
[0086]來自組（b)(4)
[0087] 在氨基酸序列EIV(參見SEQIDNO:42)內(nèi)的氨基酸I;
[0088] 在氨基酸序列FNP(參見SEQIDNO:45)內(nèi)的氨基酸N;
[0089] 以及在氨基酸序列PIL(參見SEQIDNO: 20)內(nèi)的氨基酸I，或其任何子組；以及
[0090] (c)與（a)或（b)的DNA序列的互補(bǔ)序列在非常嚴(yán)格的條件下雜交的DNA序列， 這些非常嚴(yán)格的條件包含在65°C下在0.5MNaHPo4、7%SDSUmMEDTA中與過濾器結(jié)合的 DNA雜交，并且在68°C下在0. 1SSC/0/1%SDS中洗滌。
[0091] 本發(fā)明還提供了經(jīng)多核苷酸分子轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞并且提供了用于保護(hù)豬科動(dòng)物 不被PRRS病毒感染的疫苗，所述疫苗包含：(a)由上述多核苷酸分子編碼的遺傳修飾北美 PRRS病毒，或（b)所述感染性分子，或（c)呈質(zhì)粒形式的所述多核苷酸分子，或（d)病毒載 體，它包含所述多核苷酸分子，其中所述PRRS病毒能夠以可有效地產(chǎn)生不被感染的免疫保 護(hù)的量引發(fā)不被PRRS病毒感染的有效免疫保護(hù)反應(yīng)，和適用于獸用的載劑。
[0092] 本發(fā)明還提供了對應(yīng)于（即通過具有互補(bǔ)的堿基編碼序列）以下的RNA多核苷酸 序列：
[0093] (a)DNA序列SEQIDNO:6;
[0094] (b)與（a)的DNA序列至少85%-致的DNA序列，其中其由ORFla編碼的蛋白質(zhì) 具有含有以下中的任一者和任何以下的任何組合的氨基酸序列：
[0095] 在氨基酸序列AP(參見SEQIDNO:9)內(nèi)的氨基酸N;
[0096] 在氨基酸序列HM(參見SEQIDNO: 12)內(nèi)的氨基酸N;
[0097] 在氨基酸序列PQG(參見SEQIDNO: 15)內(nèi)的氨基酸D ;
[0098] 在氨基酸序列WIL(參見SEQIDNO: 18)內(nèi)的氨基酸Y;
[0099] 在氨基酸序列VHG(參見SEQIDNO: 21)內(nèi)的氨基酸H;
[0100] 在氨基酸序列KYD(參見SEQIDNO: 24)內(nèi)的氨基酸V;
[0101] 在氨基酸序列AID(參見SEQIDNO:27)內(nèi)的氨基酸T;
[0102] 在氨基酸序列SLL(參見SEQIDNO:30)內(nèi)的氨基酸L;
[0103] 在氨基酸序列M￡Q(參見SEQIDNO:33)內(nèi)的氨基酸C ;
[0104] 在氨基酸序列PIG(參見SEQIDNO:36)內(nèi)的氨基酸T;
[0105] 在氨基酸序列VAK(參見SEQIDNO:39)內(nèi)的氨基酸A;
[0106] 在氨基酸序列EIV(參見SEQIDNO:42)內(nèi)的氨基酸I;
[0107] 在氨基酸序列FNP(參見SEQIDNO:45)內(nèi)的氨基酸N;
[0108] 以及在氨基酸序列PIL(參見SEQIDNO:20)內(nèi)的氨基酸I;或
[0109] (c)與（a)或（b)的DNA序列的互補(bǔ)序列在非常嚴(yán)格的條件下雜交的DNA序列， 這些非常嚴(yán)格的條件包含在65°C下在0.5MNaHPo4、7%SDSUmMEDTA中與過濾器結(jié)合的 DNA雜交，并且在68°C下在0. 1SSC/0/1%SDS中洗滌。
[0110] 因此，本發(fā)明還提供了包含多核苷酸分子的診斷試劑盒，它們區(qū)分自然感染有 PRRS病毒的野外病毒株的豬科動(dòng)物與接種本發(fā)明疫苗的豬科動(dòng)物，所述疫苗（病毒）優(yōu)選 地證明了相比于野生型P129PRRS病毒（SEQIDN0:5)有所降低的干擾素-α抑制作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0111] 表1示出了感染性cDNA克隆和通過轉(zhuǎn)染到ΡΚ-9細(xì)胞中得到的對應(yīng)病毒。
[0112] 表2示出了野生型PRRS病毒和適于在細(xì)胞培養(yǎng)液中生長的衍生物的干擾素-α 抑制作用。
[0113] 表3描繪了野生型PRRS病毒Ρ129和其適于在表達(dá)⑶163的ΡΚ-9細(xì)胞中生長的 基因工程改造衍生物的干擾素-α抑制作用。
[0114] 表4示出了P129-PK-FL和P129-PK-d43/44病毒相比于野生型Ρ129病毒和 PRRSIngelvac疫苗有所降低的干擾素-α抑制作用。
[0115] 表5描繪了為了評估疫苗病毒的安全性和功效而進(jìn)行的研究的設(shè)計(jì)。
[0116] 表6示出了Ρ129第0代與P129-PK-FL第17代之間由于基因組位置所造成的所 有核苷酸差異和所得氨基酸差異。
[0117] 表7示出了Ρ129第0代與P129-PK-FL第17代之間由于病毒蛋白質(zhì)所造成的核 苷酸和氨基酸差異的匯總。
[0118] 表 8 示出 了見于感染性cDNA克隆pCMV-S-P129 和pCMV-S-P129-PK17-FL中的 PRRSV基因組之間由于基因組位置所造成的所有核苷酸差異和所得氨基酸差異。
[0119] 表9和表10示出了有助于第52代病毒（SEQIDNO:6)的表現(xiàn)型的氨基酸改變。
[0120] 表11示出了在一日齡接種經(jīng)修飾活PRRSV疫苗之后具有臨床癥狀的豬的數(shù)量。
[0121] 表12示出了在一日齡接種經(jīng)修飾活PRRSV疫苗之后的血清平均滴度。
[0122] 表13示出了在先前在一日齡接種經(jīng)修飾活PRRSV疫苗的7周齡豬攻擊之后的肺 部病灶百分比。
[0123] 表14示出了在先前在一日齡接種經(jīng)修飾活PRRSV疫苗的18周齡豬攻擊之后的肺 部病灶百分比。
[0124] 表15示出了在先前在一日齡接種經(jīng)修飾活PRRSV疫苗的26周齡豬攻擊之后的肺 部病灶百分比。
[0125] 表16示出了在先前接種經(jīng)修飾活PRRSV疫苗的5周齡豬崽攻擊之后的肺部病灶 百分比。
[0126] 圖1示出了接種疫苗后的直腸溫度。
[0127] 圖2示出了用毒性PRRSVNADC20攻擊后的直腸溫度。
[0128] 圖3示出了接種疫苗后和攻擊后的體重。
[0129] 圖4示出了攻擊后具有PRRS病灶的肺的百分比數(shù)據(jù)。
[0130] 圖5示出了關(guān)于所觀察到的病灶嚴(yán)重性的攻擊后肺評估評分（LAS)。
[0131] 圖6是一個(gè)直方圖，描繪了接種疫苗后和攻擊后在血清中的抗PRRSV抗體水平 (ELISAS/P比率）。
[0132] 圖7是血清中的攻擊后病毒載量的圖形表示（PAM細(xì)胞上的logTCID50/ml)。
[0133] 圖8是用于獲得疫苗的方法的圖示，所述疫苗包括如本文所披露的SEQIDNO: 1 到SEQIDNO:6。
[0134] 豐要序列的簡要說明
[0135] SEQIDNO: 1 提供P129-PK-FL第 17 代全基因組。
[0136] SEQIDN0:2提供P129-PK-d43/44第17代全基因組。
[0137] SEQIDN0:3提供P129-PK-FL第24代全基因組。
[0138] SEQIDN0:4 提供P129-PK-d43/44 第 34 代全基因組。
[0139] SEQIDNO:5提供P129第0代全基因組。
[0140] SEQIDNO:6提供P129第52代全基因組。

【具體實(shí)施方式】
[0141] 除非上下文另外明確規(guī)定，否則如在本說明書和所附權(quán)利要求書中所使用的單數(shù) 形式"一個(gè)/種（a/an)"和"所述"包括復(fù)數(shù)個(gè)指示物。因此，舉例來說，提到"所述方法" 包括一或多種方法，和/或本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在閱讀了本發(fā)明時(shí)所清楚的本文中所述 類型的步驟等等。
[0142] 除非另外規(guī)定，否則本文中所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 一般技術(shù)人員通常所了解相同的含義。雖然可以在本發(fā)明的實(shí)踐或測試中使用類似于或等 效于本文中所述的那些方法和材料的任何方法和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法和材料。
[0143] 除非明確相反地指出，否則本發(fā)明的實(shí)踐將采用在本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的病毒學(xué)、免 疫學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)以及重組DNA技術(shù)的常規(guī)方法，其中許多出于說明的目的如 下描述。在文獻(xiàn)中全面解釋了所述技術(shù)。參見例如薩姆布魯克（Sambrook)等人分子克 隆實(shí)驗(yàn)指南（MolecularCloning:ALaboratoryManual)(第 2版，1989);馬尼亞迪斯 (Maniatis)等人分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（1982) ;DNA克隆實(shí)用方法（DNACloning:APractical Approach),第I卷和第II卷（D.格洛弗（D.Glover)編）；寡核苷酸合成（Oligonucleotide Synthesis) (Ν·蓋特（Ν·Gait)編，1984);核酸雜交（NucleicAcidHybridization) (Β·哈 梅斯（B.Hames)和S.希金斯（S.Higgins)編，1985);轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯（Transcriptionand Translation) (Β·哈梅斯和S.希金斯，1984);動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)（AnimalCellCulture) (R.弗 瑞旭尼（R.Freshney)編，1986);佩巴爾（Perbal)，分子克隆實(shí)踐指導(dǎo)（APracticalGuide toMolecularCloning)(1984)。
[0144] "北美PRRS病毒"意指具有與北美PRRS病毒分尚株相關(guān)的遺傳特性的任何 PRRS病毒，例如（但不限于）最初在美國在約1990年代初期分離的PRRS病毒（參 見例如柯林斯，J.E. (Collins,J.E.)等人，1992，獸醫(yī)診斷研究雜志（J.Vet.Diagn. Invest.) 4:117-126);北美PRRS病毒分離株MN-Ib(光，J. (Kwang，J.)等人，1994,獸醫(yī)診 斷研究雜志 6:293-296);PRRS的QuebecLAF-exp91 病毒株（梅爾達(dá)希，H. (Mardassi，H.) 等人，1995,病毒學(xué)文獻(xiàn)（Arch.Virol. ) 140:1405-1418);以及北美PRRS病毒分離株VR 2385 (孟，X.-J(Meng，X. -J)等人，1994,普通病毒學(xué)雜志（J.Gen.Virol.) 75:1795-1801)。 遺傳特性是指由北美PRRS病毒株所共享的基因組核苷酸序列類似性和氨基酸序列類似 性。中國PRRS病毒株一般顯不出與北美病毒株約80-93%的核苷酸序列類似性。
[0145] "歐洲PRRS病毒"是指具有與最初在歐洲在約1991年分離的PRRS病毒相關(guān)的遺 傳特性的PRRS病毒的任何病毒株（參見例如，溫斯福德，G. (Wensvoort，G.)等人，1991， 獸醫(yī)問題（Vet.Q.) 13:121-130)。"歐洲PRRS病毒"在本領(lǐng)域中有時(shí)也指"萊利斯塔德病毒 (Lelystadvirus)，'。
[0146] 出于本發(fā)明的目的，"有效免疫保護(hù)反應(yīng)"、"免疫保護(hù)"等術(shù)語意指在接種疫苗的 動(dòng)物中針對病原體的一或多個(gè)抗原表位從而保護(hù)不被病原體感染的免疫反應(yīng)。出于本發(fā)明 的目的，保護(hù)不被病原體感染不僅包括感染的絕對預(yù)防，而且包括相比于未接種疫苗的感 染動(dòng)物，在接種疫苗的動(dòng)物中，被病原體感染的程度或比率的任何可檢測的降低，或由被病 原體感染產(chǎn)生的疾病或任何癥狀或病狀的嚴(yán)重程度的任何可檢測的降低?？梢栽谙惹吧形?感染病原體和/或在接種疫苗時(shí)未感染病原體的動(dòng)物中誘導(dǎo)有效免疫保護(hù)反應(yīng)。還可以在 接種疫苗時(shí)已經(jīng)感染了病原體的動(dòng)物中誘導(dǎo)有效免疫保護(hù)反應(yīng)。
[0147] 如果遺傳修飾PRRS病毒的毒性低于其未修飾的親本病毒株，那么它是"減毒的"。 如果病毒株顯示出決定疾病嚴(yán)重程度的一或多個(gè)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)顯著減少，那么它的"毒性較 低"。所述參數(shù)可以包括病毒血癥的程度、發(fā)燒、呼吸窘迫的嚴(yán)重程度、繁殖癥狀的嚴(yán)重程 度、或肺部病灶的數(shù)量或嚴(yán)重程度等。
[0148] "能夠支持PRRS病毒復(fù)制的宿主細(xì)胞"意指能夠在感染本發(fā)明病毒時(shí)產(chǎn)生感染性 PRRS的細(xì)胞。所述細(xì)胞包括單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系的豬細(xì)胞，例如豬肺泡巨噬細(xì)胞和衍生 物、MA-104猴腎細(xì)胞和衍生物（例如MARC-145細(xì)胞）以及經(jīng)PRRS病毒受體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。 術(shù)語"能夠支持PRRS病毒復(fù)制的宿主細(xì)胞"還可以包括在活豬內(nèi)的細(xì)胞。
[0149] 如本文中所用的"開放閱讀框"或"0RF"意指用于編碼特定PRRS病毒蛋白所需的 不含中間終止密碼子的最小核苷酸序列。
[0150] "豬（Porcine) "和"豬（swine) "在本文中可互換地使用并且是指作為豬科的成員 的任何動(dòng)物，例如豬（pig)。除非另外指出，否則如本文中所用的術(shù)語"PRRS病毒"意指北 美或歐洲PRRS病毒的任何病毒株。
[0151] "PRRS"涵蓋豬中由PRRS病毒感染所引起的疾病癥狀。所述癥狀的實(shí)例包括（但 不限于）發(fā)燒、懷孕母畜的流產(chǎn)、呼吸窘迫、肺部病灶、食欲不振以及幼豬的死亡。如本文所 用的"不能夠產(chǎn)生PRRS"的PRRS病毒是指可以感染豬，但是在豬中不產(chǎn)生通常與PRRS感染 相關(guān)的任何疾病癥狀的病毒。
[0152] 如本文中所用的PRRSV"N蛋白"或"0RF7"定義為由PRRS病毒的歐洲和北美基因 型兩者的0RF7編碼的多肽。當(dāng)前已知的N蛋白的具體同型的實(shí)例是在基因庫中通過寄存 編號PRU87392報(bào)告的北美PRRS原型分離株VR2322的123氨基酸多肽，和在基因庫中通過 寄存編號A26843報(bào)告的歐洲原型PRRS分離株萊利斯塔德的128殘基N蛋白。
[0153] "PRRSVN蛋白NLS-I區(qū)"或"PRRSV0RF7NLS-1 區(qū)"是指"pat4" 或"nucl" 核定位 信號（中井（Nakai)和兼久（Kanehisa), 1992 ;羅蘭（Rowland)和柳（Yoo) ,2003)，它含有 四個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸（賴氨酸或精氨酸）或三個(gè)堿性殘基和一個(gè)組氨酸或脯氨酸，位于 成熟N蛋白的約前15個(gè)N端殘基內(nèi)。舉例來說，VR2332NLS-1區(qū)序列是KRKK并且位于殘 基9-12,而萊利斯塔德分離株序列是KKKK并且位于N蛋白的殘基10-13。
[0154] "PRRSVN蛋白NLS-2區(qū)"或"PRRSV0RF7NLS-2區(qū)"是指在N蛋白內(nèi)的第二核定 位信號，它可以采用兩種形式中的一種。在北美PRRS病毒中，NLS-2具有一種被我們命名 為"pat8"基元的模式，它始于脯氨酸，之后的三個(gè)殘基內(nèi)跟隨一個(gè)五殘基序列，所述序列在 五個(gè)殘基中含有至少三個(gè)堿性殘基（K或R)(由中井和兼久，1992 ;羅蘭和柳，2003描述的 "pat7"或"nuc2"基元的輕微修飾）。舉例來說，此類序列位于北美PRRSV分離株VR2332 的N蛋白殘基41-47,并且由序列P……K表示。在歐洲PRRS病毒中，NLS-2具有"pat4" 或"nucl"基元，它是四個(gè)堿性氨基酸或與組氨酸或脯氨酸相連的三個(gè)堿性殘基的連續(xù)延伸 (中井和兼久，1992 ;羅蘭和柳，2003)。歐洲PRRSV分離株萊利斯塔德的NLS-2位于殘基 47-50并且由序列K......K表示。
[0155] "PRRSVN蛋白NoLS區(qū)"或"PRRSVORF7N〇LS區(qū)"是指核仁定位信號，具有約32個(gè) 氨基酸的總長度并且在其氨基端附近并有NLS-2區(qū)。舉例來說，VR2332N〇LS區(qū)序列位于殘 基41-72并且由序列P……R表示（羅蘭和柳，2003)，而對應(yīng)萊利斯塔德分離株序列位于 殘基42-73并且由序列P......R表示。
[0156] "經(jīng)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞"意指如美國專利第5, 600, 662號中所述，在經(jīng)PRRS病毒RNA轉(zhuǎn) 染時(shí)可以產(chǎn)生至少第一輪PRRS病毒粒子的幾乎任何宿主細(xì)胞。
[0157] 出于本發(fā)明的目的，"感染性DNA分子"是編碼用于支持從合適的宿主細(xì)胞復(fù)制、轉(zhuǎn) 錄以及轉(zhuǎn)譯成功能性病毒粒子所需要素的DNA分子。
[0158] 類似地，"經(jīng)分離多核苷酸分子"是指包含從其天然存在狀態(tài)（如果存在的話）純 化到任何可檢測程度的本發(fā)明多核苷酸分子的物質(zhì)組合物。
[0159] 出于本發(fā)明的目的，第二多核苷酸分子（RNA或DNA)的核苷酸序列是與第一多核 苷酸分子的核苷酸序列"同源的"，或與所述第一多核苷酸分子具有"一致性"，其中如基于 遺傳密碼的簡并，或當(dāng)?shù)诙嗪塑账岱肿拥暮塑账嵝蛄芯幋a足夠類似于由第一多核苷酸分 子的核苷酸序列編碼的聚氨基酸的聚氨基酸以便適用于實(shí)踐本發(fā)明時(shí)，它編碼與第一多核 苷酸分子的核苷酸序列相同的聚氨基酸。同源多核苷酸序列也是指有義鏈和反義鏈，并且 在所有情況下是指任何所述鏈的互補(bǔ)序列。出于本發(fā)明的目的，多核苷酸分子適用于實(shí)踐 本發(fā)明，并且因此是同源的或具有一致性，其中它可以用作用于檢測被感染的豬的體液或 組織樣品中PRRS病毒或病毒多核苷酸的存在的診斷探針，例如通過標(biāo)準(zhǔn)雜交或擴(kuò)增技術(shù)。 一般來講，如基于BLASTN算法（美國國立衛(wèi)生研究院（UnitedStatesNationalInstitute ofHealth)的美國國家生物技術(shù)信息中心（NationalCenterforBiotechnology Information)，另被稱為NCBI，（美國馬里蘭州貝塞斯達(dá)（Bethesda,Maryland,USA)))， 如果第二多核苷酸分子的核苷酸序列與第一多核苷酸分子的核苷酸序列具有至少約70% 核苷酸序列一致性，那么它與第一多核苷酸分子的核苷酸序列同源。在用于根據(jù)本發(fā) 明實(shí)踐計(jì)算的具體實(shí)例中，提到了BLASTP2. 2. 6 [塔圖索瓦TA(TatusovaTA)和TL馬 登（TLMadden)，"BLAST2序列-一種用于比較蛋白質(zhì)和核苷酸序列的新工具（BLAST 2sequences-anewtoolforcomparingproteinandnucleotidesequences) ·，'（1999) FEMS微生物學(xué)快報(bào)（FEMSMicrobiolLett. ) 174:247-250.]。簡單來說，使用空位開放 罰分10、空位延伸罰分0. 1以及赫尼霍夫（Henikoff)和赫尼霍夫（美國國家科學(xué)院院刊 89:10915-10919. 1992)的"blosum62"評分矩陣比對兩個(gè)氨基酸序列以優(yōu)化比對評分。然 后如下計(jì)算一致性百分比：一致匹配的總數(shù)X100/除以較長序列的長度+為了比對兩個(gè)序 列而引入到較長序列中的空位的數(shù)量。
[0160] 優(yōu)選地，同源核苷酸序列具有至少約75%核苷酸序列一致性，甚至更優(yōu)選地至少 約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%核苷酸序列一致性。由于遺傳密碼是簡 并的，所以同源核苷酸序列可以包括任何數(shù)量的"沉默"堿基改變，即仍然編碼相同氨基酸 的核苷酸取代。
[0161] 同源核苷酸序列可以進(jìn)一步含有非沉默突變，即在所編碼的聚氨基酸中產(chǎn)生氨基 酸差異的堿基取代、缺失或添加，只要所述序列保持與由第一核苷酸序列編碼的聚氨基酸 至少約70%-致或以其它方式適用于實(shí)踐本發(fā)明即可。就此而言，可以進(jìn)行公認(rèn)為不使整 體蛋白質(zhì)功能失活的某些保守氨基酸取代：例如關(guān)于帶正電荷的氨基酸（且反之亦然）賴 氨酸、精氨酸和組氨酸；關(guān)于帶負(fù)電荷的氨基酸（且反之亦然）天冬氨酸和谷氨酸；以及關(guān) 于某些不帶電氨基酸的群組（并且在所有情況下，也反之亦然），（1)丙氨酸和絲氨酸，（2) 天冬酰胺、谷氨酰胺和組氨酸，（3)半胱氨酸和絲氨酸，（4)甘氨酸和脯氨酸，（5)異亮氨酸、 亮氨酸和纈氨酸，（6)甲硫氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，（7)苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和酪 氨酸，（8)絲氨酸和蘇氨酸，（9)色氨酸和酪氨酸，（10)以及例如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨 酸。可以根據(jù)物理性質(zhì)和對二級與三級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)對氨基酸進(jìn)行分類。保守取代在 本領(lǐng)域中被認(rèn)為是一種氨基酸被具有類似性質(zhì)的另一種氨基酸取代。例示性保守取代可見 于 1997 年 3 月 13 日公開的WO97/09433 第 10 頁（PCT/GB96/02197,1996 年 9 月 6 日提 交）中。可替代地，保守氨基酸可以如勒寧格爾（Lehninger)(生物化學(xué)（Biochemistry), 第二版；沃斯出版社公司（WorthPublishers,Inc. )NY:NY(1975),第71頁-第77頁）中 所述進(jìn)行分組。其它合適的保守改變和其應(yīng)用如下所述。
[0162] 可以通過比較核苷酸序列，例如通過使用上文的BLASTN來確定同源核苷酸序列。 可替代地，可以通過在選定條件下雜交來確定同源核苷酸序列。舉例來說，如果第二多核苷 酸分子的核苷酸序列與SEQIDNO: 1的互補(bǔ)序列在適當(dāng)嚴(yán)格的條件下雜交，例如在65°C下 在0.5MNaHP04、7 %十二烷基硫酸鈉（SDS)UmMEDTA中與過濾器結(jié)合的DNA雜交，并且在 42°C下在0.2XSSC/0. 1 %SDS中洗滌（參見奧斯貝（Ausubel)等人編，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方 法匯編（ProtocolsinMolecularBiology),威利父子公司（WileyandSons) ,1994，第 6. 0. 3頁到第6. 4. 10頁），或?qū)⒁云渌绞揭鹑缦挛乃x的編碼PRRS病毒的序列的雜 交的條件，那么它與SEQIDNO: 1(或任何其它特定多核苷酸序列）同源。可以憑經(jīng)驗(yàn)確定 或基于探針的長度和鳥苷/胞嘧啶（GC)堿基配對的百分比準(zhǔn)確計(jì)算雜交條件的修改?？梢?如薩姆布魯克等人(編），分子克降實(shí)騎指南,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社（ColdSpringHarbor LaboratoryPress):冷泉港（ColdSpringHarbor),紐約州（NewYork) (1989),第 9.47 頁到第9. 51頁所述計(jì)算雜交條件。
[0163] 在另一個(gè)實(shí)施例中，如果第二核苷酸序列與SEQIDNO: 1的互補(bǔ)序列在非常嚴(yán)格 的條件下雜交，例如在65°C下在0. 5MNaHP04、7%SDSUmMEDTA中與過濾器結(jié)合的DNA雜 交，并且在68°C下在0.IXSSC/0. 1 %SDS中洗滌，如本領(lǐng)域中已知（奧斯貝（Ausebel)等 人最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編（CurrentProtocolsinMolecularBiology),格林出版 社和威利國際科學(xué)出版社（GreenePublishingandWileyInterscience),紐約，1989)， 那么它與SEQIDNO:I(或本發(fā)明的任何其它序列）同源。
[0164] 此外應(yīng)了解，本發(fā)明的經(jīng)分離多核苷酸分子和經(jīng)分離RNA分子包括合成分子和通 過重組技術(shù)，例如通過體外克隆和轉(zhuǎn)錄獲得的分子兩者。
[0165] 多核苷酸分子可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的重組技術(shù)進(jìn)行基因突變，包括 通過定點(diǎn)誘變，或通過隨機(jī)誘變，例如通過暴露于化學(xué)誘變劑或輻射，如本領(lǐng)域中已知?？?以通過本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行突變,例如如（例如莫伊倫貝格（Meulenberg)等人， 實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)與生物學(xué)進(jìn)展（Adv.Exp.Med.Biol.), 1998,440:199-206)所述的感染性拷貝的 定點(diǎn)誘變（參見例如薩姆布魯克等人（1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室 出版社，冷泉港，紐約州）。
[0166] 因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于制造遺傳修飾北美PRRS病毒的方法，所述方法 包含使編碼感染性RNA分子的DNA序列突變，所述感染性RNA分子編碼如上所述的PRRS病 毒；并且使用合適的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)遺傳修飾PRRS病毒?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中通常已知的合適 表達(dá)系統(tǒng)，從經(jīng)分離多核苷酸分子表達(dá)遺傳修飾PRRS病毒，其實(shí)例描述在本申請中。舉例 來說，經(jīng)分離多核苷酸分子可以呈能夠在合適的宿主細(xì)胞中體外表達(dá)所編碼病毒的質(zhì)粒形 式，如下文進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0167] 北美PRRSVN蛋白序列是高度保守的并且所報(bào)告的序列彼此具有約93-100% - 致性。北美和歐洲PRRSVN蛋白是約57-59%-致的并且共享共同的結(jié)構(gòu)基元。一般來講， 當(dāng)比較PRRS編碼序列和分離株（它們可以與特定核苷酸或所編碼的氨基酸以不同方式編 號）時(shí)，易于通過鑒別相關(guān)PRRS病毒株中所保存的特征氨基酸并且將它與參考病毒株進(jìn)行 比對來實(shí)現(xiàn)恰當(dāng)區(qū)域的鑒別。
[0168] 重組DNA技術(shù)包含旨在以DNA水平修飾核酸的極其多變并且強(qiáng)大的分子生物學(xué)技 術(shù)，并且使在分子水平分析和修飾基因組成為可能。在這方面，例如PRRS病毒等病毒由于 其基因組的適度大小而尤其能夠經(jīng)受所述操作。然而，重組DNA技術(shù)并不可立即應(yīng)用于非 反轉(zhuǎn)錄病毒RNA病毒，因?yàn)檫@些病毒在其復(fù)制過程中不涵蓋DNA中間步驟。關(guān)于所述病毒， 必須在重組DNA技術(shù)可以應(yīng)用于其基因組以產(chǎn)生修飾病毒之前發(fā)展感染性cDNA克隆。感染 性克隆可以通過構(gòu)造在研究中的病毒的全長（基因組長度）cDNA(這里是在RNA的DNA拷 貝的廣泛意義上并且不僅在mRNA的DNA拷貝的嚴(yán)格意義上使用）得到，之后在經(jīng)全長cDNA 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中體內(nèi)合成感染性轉(zhuǎn)錄物，但是感染性轉(zhuǎn)錄物還可以通過在具有原核啟動(dòng)子的 質(zhì)粒中在存在轉(zhuǎn)錄混合液的情況下從全長cDNA體外轉(zhuǎn)錄獲得，或同樣使用包含完整病毒 基因組的接合部分長度cDNA片段體外獲得。在所有情況下，所轉(zhuǎn)錄的RNA攜帶已被引入到 cDNA中的所有修飾并且可以用以使如此修飾的病毒進(jìn)一步傳代。
[0169] 歐洲PRRS病毒分離株或萊利斯塔德病毒的感染性克隆的制備描述在美國專利 第6, 268, 199號中，所述專利以引用的方式完全并入本文中。命名為P129(李（Lee)等 人，2005 ;柳等人，2004)的北美PRRS病毒分離株的感染性cDNA克隆的制備描述在美國專 利第6, 500, 662號中，所述專利以引用的方式完全并入本文中。P129cDNA的序列披露于基 因庫寄存編號AF494042中和美國專利第6, 500, 662號中。我們以下的工作利用這類感染 性克隆，它在質(zhì)粒的情況下通過CMV即刻早期啟動(dòng)子表達(dá)并且已被命名為pCMV-S-P129并 且也披露在美國專利第6, 500, 662號內(nèi)。如美國專利第6, 500, 662號中所描述，存在適用 于此的其它質(zhì)粒和啟動(dòng)子。
[0170] 鑒于任何相關(guān)開放閱讀框的全序列和相關(guān)氨基酸殘基的位置，普通技術(shù)人員僅僅 需要查詢密碼子表來設(shè)計(jì)在所希望的特定位置的改變。
[0171] 密碼子構(gòu)成了mRNA和其對應(yīng)cDNA分子中核苷酸的三重序列。密碼子當(dāng)存在于 mRNA分子中時(shí)以堿基尿嘧啶（U)為特征，但是當(dāng)存在于DNA中時(shí)以堿基胸苷（T)為特征。 多核苷酸內(nèi)相同氨基酸殘基的密碼子簡單改變將不改變所編碼多肽的序列或結(jié)構(gòu)。顯然當(dāng) 短語陳述特定3核苷酸序列"編碼"任何特定氨基酸時(shí)，一般熟練的業(yè)內(nèi)人士將認(rèn)識到上表 提供了討論中的特定核苷酸的鑒別手段。舉例來說，如果特定三核苷酸序列編碼賴氨酸，那 么上表披露了兩種可能的三重序列是AAA和AAG。甘氨酸是由GGA、GGC、GGT(如果在RNA 中，那么是GGU)以及GGG編碼的。為了將所編碼蛋白質(zhì)中的賴氨酸變成甘氨酸殘基，可以 用GGA和GGC、GGT或GGG中的任一者替換編碼核酸中的AAA或AAG三聯(lián)體。
[0172] 如上文所提到，本發(fā)明是針對提供PRRS的疫苗病毒株，其中除了其它反應(yīng)以外， 不下調(diào)由干擾素路徑介導(dǎo)的宿主對病毒的反應(yīng)。如下文詳細(xì)描述，存在對病毒基因組的各 種修飾，這些修飾就此而言是有效的，尤其是在如本文所披露的ORFla中所發(fā)現(xiàn)的那些，以 及其組合。應(yīng)注意，類似修飾點(diǎn)可見于PRRS基因組的其它開放閱讀框中，也披露在本文中 (參見表9)。
[0173] 值得注意的是，為了減弱PRRS病毒而用于PRRS多核苷酸修飾的某些其它先前方 法已經(jīng)成功了，有可能提供疫苗使用的適合性，但是所得減毒的確切原因尚未普遍知曉。舉 例來說，已經(jīng)披露了通過突變或刪除病毒的核衣殼或N蛋白（由0RF7編碼）中的NLS-2區(qū)、 NoLS區(qū)或NES區(qū)，從而包括開放閱讀框7 (0RF7)中的缺失而使毒性PRRS病毒減弱。在另一 方面，0RF7缺失是在編碼衣殼蛋白的核定位信號（NLS)的序列內(nèi)。在編碼NLS的序列內(nèi)的 0RF7缺失可以包括在位置43-48的一或多個(gè)氨基酸的缺失或在位置43和44中的任一者或 兩者的氨基酸缺失。參見例如美國專利7, 544, 362的完整披露內(nèi)容，所述專利以引用的方 式并入本文中。由0RF7編碼的PRRSV的核衣殼蛋白（N)是一種被磷酸化的小堿性蛋白（伍 頓（Wootton)、羅蘭以及柳，2002)并且形成同型二聚體（伍頓和柳，2003)。近來已經(jīng)確定 了晶體結(jié)構(gòu)（多恩（Doan)和多克蘭（Dokland)，2003)。N蛋白在感染細(xì)胞中似乎具有多種 功能。除了形成內(nèi)部包裝有基因組RNA的球形衣殼結(jié)構(gòu)，一種在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生的過程以外， 一部分N蛋白還被輸送到細(xì)胞核中并且更明確地說被輸送到被感染細(xì)胞的細(xì)胞核。N蛋白 的氨基酸序列含有兩種核定位信號（NLS):核仁定位信號（NoLS)和核輸出信號（NES)，它們 對應(yīng)地促進(jìn)輸送到細(xì)胞核和核仁中并且從細(xì)胞核輸出（羅蘭等人，1999 ;羅蘭等人，2003 ; 羅蘭和柳，2003)。同時(shí)在核仁中，N蛋白與小核仁RNA相關(guān)蛋白纖維蛋白相互作用并且可 以調(diào)節(jié)感染細(xì)胞中的rRNA加工和核糖體生物合成以便促進(jìn)病毒復(fù)制（柳等人，2003)。這 種類型的病毒突變單獨(dú)或與其它減毒突變組合對于設(shè)計(jì)新穎PRRS疫苗是有價(jià)值的。在已 經(jīng)減毒的PRRS病毒的另一個(gè)實(shí)例中，采用了對ORFla的修飾。采用了編碼在ORFla的非結(jié) 構(gòu)蛋白2編碼區(qū)中的高變區(qū)中的氨基酸616到752之間的抗原表位的DNA序列的缺失，參 見美國專利7, 618, 797,所述專利以全文引用的方式并入本文中。
[0174] 關(guān)于PRRS病毒的免疫生物學(xué)的研究表明，PRRS病毒與TOC的相互相用有益于檢 查。這種細(xì)胞類型代表了人類、小鼠、大鼠、豬以及猴中〇. 2% -0. 8%的外周血單個(gè)核細(xì)胞。 盡管其稀少，但是這種細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的一種重要組分并且能夠在病毒刺激之后分泌 大量IFN-a。PDC是通過IFN-α的分泌而在調(diào)節(jié)抗病毒先天性和適應(yīng)性免疫中起主要作 用，因?yàn)樗鼈兇龠M(jìn)了自然殺傷細(xì)胞、B細(xì)胞以及T細(xì)胞的功能。此外，通過PDC分泌的IFN-a 幫助了豬單核細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞（MoDC)的成熟，產(chǎn)生MoDC對所存在抗原和活化T細(xì)胞 的強(qiáng)化能力。在病毒感染的后期，PDC分化成獨(dú)特類型的成熟樹突狀細(xì)胞，它直接調(diào)節(jié)T細(xì) 胞的功能并且指導(dǎo)T細(xì)胞分化成能夠分泌IFN-γ的細(xì)胞，IFN-Y是對抗病毒（包括PRRS 病毒）的抗病毒免疫的主要介體。不出意料，存在已知抑制PDC分泌IFN-a的能力的人類 病毒，例如呼吸道合胞病毒和麻疹病毒。這種抑制作用被認(rèn)為在由于感染了這些病毒所觀 察到的體液免疫反應(yīng)的優(yōu)勢和相關(guān)免疫病理學(xué)中，以及在宿主對繼發(fā)性細(xì)菌和病毒感染的 增加易感性中起一定作用。
[0175] 相比之下，野生型PRRSV分離株以及兩種IngelvacPRRS疫苗病毒株（參見下文 中的實(shí)例5和以下實(shí)例）抑制豬PDC的經(jīng)純化群體產(chǎn)生IFN-α的能力，而新穎P129-PK-FL 和P129-PK-d43/44病毒儲(chǔ)備液（參見下文）展現(xiàn)出對這種PDC功能的最小到無的抑制作 用。這些觀察結(jié)果的重要性部分在于IFN-α在調(diào)節(jié)對病毒的適應(yīng)性免疫反應(yīng)的發(fā)展中的 重要性。因此，來源于最小IFN-a抑制病毒的減毒病毒疫苗極有可能將引發(fā)強(qiáng)烈的抗病毒 保護(hù)免疫反應(yīng)。先前已經(jīng)證明了IFN-a對IngelvacPRRSMLV疫苗誘導(dǎo)的病毒特異性T 細(xì)胞介導(dǎo)的IFN-Y反應(yīng)的輔助作用，并且在野外和實(shí)驗(yàn)室條件下，由疫苗引起的病毒特異 性T細(xì)胞介導(dǎo)的IFN-Y反應(yīng)的強(qiáng)度與對抗病毒的保護(hù)性免疫具有正相關(guān)。因此，雖然不受 理論限制，但是可以合理預(yù)計(jì)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和由非IFN-α抑制PRRSV引起的保護(hù)性 免疫的水平將顯著大于展現(xiàn)野生型（IFN-α抑制）表現(xiàn)型的PRRSV分離株。
[0176] 參看本發(fā)明，值得注意的是，P129-PK-FL病毒以及來源于pCMV-S-P129-PK感染性 cDNA克隆的所有五種缺失突變體都失去了抑制IFN-a產(chǎn)生的能力。因此，這種與眾不同 的表現(xiàn)型可能不是僅僅由于缺失，但是一定至少部分地由于在感染性克隆的構(gòu)造期間變成 固定的基因改變。有趣的是，在PK-9細(xì)胞上連續(xù)傳代63次的未克隆的P129病毒保留了抑 制IFN誘導(dǎo)的能力（表1)。在所有感染性克隆來源病毒中所看到的常見IFN表現(xiàn)型的最 可能解釋是在感染性克隆的產(chǎn)生期間并入了一或多個(gè)突變。這些突變本來應(yīng)該可能以低 水平存在于用來構(gòu)造感染性克隆的病毒RNA中。最終，這些突變可能已經(jīng)存在于豬的初始 (第〇代）病毒中或它們可以在使病毒適應(yīng)在PK-9細(xì)胞上生長持續(xù)16次傳代的過程期間 產(chǎn)生并且富集。不能排除突變是PCR誘導(dǎo)錯(cuò)誤或克隆假象的結(jié)果的可能性。無論如何，導(dǎo) 致IFN-α抑制功能丟失的突變在感染性克隆構(gòu)造期間變成"固定"的，并且預(yù)計(jì)將存在于 來源于這種特定感染性克隆的所有病毒中。
[0177] 考慮到已知PRRSV由于病毒RNA依賴性RNA聚合酶的錯(cuò)誤而易于產(chǎn)生隨機(jī)遺傳多 樣性，導(dǎo)致改變的IFN-α抑制表現(xiàn)型的突變預(yù)存在于用來構(gòu)造cDNA克隆的病毒RNA中的 可能性是可能的。病毒準(zhǔn)種由自然地出現(xiàn)于病毒體內(nèi)復(fù)制期間的密切相關(guān)的遺傳變異體的 不均勻混合物組成。甚至更相關(guān)的是在來源于感染性cDNA克隆的PRRSV的多次體外傳代之 后，病毒準(zhǔn)種的觀察結(jié)果。這是值得注意的，因?yàn)樵谙惹斑M(jìn)行的研究中病毒基因組的起始群 體由基因同源群體組成，并且序列多樣性在傳代期間在細(xì)胞培養(yǎng)液中迅速地產(chǎn)生。在當(dāng)前 研究中，基因組異源性水平本來應(yīng)該更高，因?yàn)槌跏糚129病毒在構(gòu)造感染性克隆之前的16 次PK-9傳代之前尚未被克?。ㄒ陨飳W(xué)方式或以分子方式）。因此，準(zhǔn)種之中導(dǎo)致IFN-a 抑制功能丟失的PRRSVRNA變異體的機(jī)會(huì)選擇和并入到pCMV-S-P129-PK17-FL感染性cDNA 克隆中似乎是合理的。在一些情況下，考慮到所有衍生病毒應(yīng)該共享可以證明對有效的下 一代PRRS疫苗的發(fā)展至關(guān)重要的這種獨(dú)特生物表現(xiàn)型，將這些突變并入到感染性克隆中 可以被視為偶然的。
[0178] 野生型PRRS病毒株P(guān)129如這種病毒的其它病毒株一樣，展現(xiàn)出對外周血單個(gè)核 細(xì)胞（PBMC)和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（roc)產(chǎn)生干擾素（IFN)-α的能力的強(qiáng)烈抑制作用。 另一方面，來源于Ρ129的感染性cDNA克?。╬CMV-S-P129-PK17-FL)的病毒展現(xiàn)出IFN-a 抑制表現(xiàn)型顯著減少。這種感染性克隆是從先前經(jīng)適應(yīng)以在表達(dá)⑶163的豬腎細(xì)胞系PK-9 上生長的病毒在16次連續(xù)傳代的過程中構(gòu)造的（參見美國專利7, 754, 464,所述專利以全 文引用的方式并入本文中）。P129-PK-FL和P129-PK-d43/44的IFN-a抑制表現(xiàn)型在低 到可忽略的之間變化并且與兩種IngelvacPRRS修飾活病毒疫苗病毒株中的任一者所展 現(xiàn)的IFN-α抑制表現(xiàn)型形成鮮明對比，這兩種病毒株均是高度抑制性的。這些結(jié)果表明 P129-PK-FL和P129-PK-d43/44病毒在生物學(xué)上不同于親本低傳代P129分離株、其它野生 型PRRS病毒以及兩種IngelvacPRRS疫苗。討論了降低的IFN-a抑制性表現(xiàn)型的潛在含 義以及表現(xiàn)型改變的可能原因。
[0179] 本發(fā)明的氨某酸修飾
[0180] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)踐，PRRS的新穎分離株，無論具有北美或中國基因型，都可以被野 外鑒別，這些分離株在從ORFl編碼的蛋白質(zhì)中的特定位置含有特定含有氨基酸，并且賦予 這些病毒所希望的表現(xiàn)型。在替代方案中，如上文所提到，可以采用標(biāo)準(zhǔn)基因程序來修飾所 編碼ORFl蛋白的基因序列（并且由此修飾氨基酸序列），此外產(chǎn)生經(jīng)修飾北美和中國PRRS 病毒以及來自這些病毒的感染性克隆和疫苗，所有這些都提供所述表現(xiàn)型。在優(yōu)選實(shí)例中， 表現(xiàn)型包括（但不限于）如相比于野生型PRRS病毒有所降低的干擾素-α抑制作用，并且 任選地，用于在宿主動(dòng)物（豬）中繁殖或存留同時(shí)觸發(fā)穩(wěn)固的免疫反應(yīng)的能力，但是具有極 少的可檢測病理學(xué)。
[0181] 因此，在本發(fā)明的實(shí)踐中，可以充當(dāng)有用的起始點(diǎn)的北美PRRS病毒株或分離 株包括例如在美國專利 6, 500, 662 ;7, 618, 797 ;7, 691，389 ;7, 132, 106 ;6, 773, 908 ; 7, 264, 957 ;5, 695, 766 ;5, 476, 778 ;5, 846, 805 ;6, 042, 830 ;6, 982, 160 ;6, 241，990 ;以及 6, 110, 468中披露的那些。關(guān)于可以充當(dāng)有用的起始點(diǎn)的中國PRRS病毒株和分離株，參見 例如來自關(guān)于TJM-92病毒的中國申請CN201633909的公開中國申請CN200910091233. 6。
[0182] 結(jié)合以下討論，關(guān)于由DNA編碼的大多數(shù)常見氨基酸使用國際公認(rèn)的單字母和三 字母名稱：丙氨酸（Ala，A);精氨酸（Arg，R);天冬酰胺（Asn，N);天冬氨酸（Asp，D);半胱 氨酸（Cys，C);谷氨酸（Glu，E);谷氨酰胺（Gln，Q);甘氨酸（Gly，G);組氨酸（His，H);異 亮氨酸（Ile,I);亮氨酸（Leu，L);賴氨酸（Lys，K);甲硫氨酸（Met，M);苯丙氨酸（Phe，F(xiàn)); 脯氨酸（Pro，P);絲氨酸（ser，S);蘇氨酸（Thr，T);色氨酸（Trp，W);酪氨酸（Tyr，Y)以及 纈氨酸（Val，V)。
[0183] 表9和表10鑒別所觀察到的導(dǎo)致北美（和中國）PRRS的毒力減弱的氨基酸改變， 這些改變與干擾素α活性的抑制降低有關(guān)，從而允許對疫苗的安全并且穩(wěn)固的免疫反應(yīng)。 表10鑒別在ORFla內(nèi)就此而言高度優(yōu)選的氨基酸修飾，并且顯示這些突變?nèi)绾侮P(guān)于從其它 Ρ129培養(yǎng)物的傳代出現(xiàn)（應(yīng)注意，這個(gè)歷史的檢查也有助于用于（重新）構(gòu)造具有本發(fā)明 氨基酸改變中的任一者（根據(jù)需要）的編碼DNA的誘變策略的設(shè)計(jì)）。就此而言，ORFla的 最優(yōu)選氨基酸改良（如通過P129第52代所證明）包括：在182的天冬酰胺、在189的天冬 酰胺、在273的酪氨酸、在302的組氨酸、在665的蘇氨酸、在943的半胱氨酸、在1429的蘇 氨酸、在1505的丙氨酸、在2410的天冬酰胺，這些改良也潛在地增加了許多糖基化機(jī)會(huì)并 且可以進(jìn)一步改變蛋白質(zhì)功能。
[0184]因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種經(jīng)分離豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRS)，其中其由 ORFla編碼的蛋白質(zhì)選自由含有以下中的任一者的那些氨基酸序列組成的群組：
[0185] 在氨基酸序列AMAPYD(SEQIDNO:9)內(nèi)的氨基酸N;
[0186] 在氨基酸序列IGHMVM(SEQIDNO: 12)內(nèi)的氨基酸N;
[0187] 在氨基酸序列TVP2GNC(SEQIDN0:15)內(nèi)的氨基酸D;
[0188] 在氨基酸序列CffffILFD(SEQIDNO: 18)內(nèi)的氨基酸Y;
[0189] 在氨基酸序列HGVHGKY(SEQIDNO: 21)內(nèi)的氨基酸H;
[0190] 在氨基酸序列AAKYDQY(SEQIDNO:24)內(nèi)的氨基酸V;
[0191] 在氨基酸序列PSAIDTS(SEQIDNO:27)內(nèi)的氨基酸T;
[0192] 在氨基酸序列LNSLLSK(SEQIDNO:30)內(nèi)的氨基酸L;
[0193] 在氨基酸序列APM￡QDE(SEQIDNO:33)內(nèi)的氨基酸C;
[0194] 在氨基酸序列CAPIGMD(SEQIDNO:36)內(nèi)的氨基酸T;
[0195] 在氨基酸序列PKVAKVS(SEQIDNO: 39)內(nèi)的氨基酸A;
[0196] 在氨基酸序列AGEIVGV(SEQIDNO:42)內(nèi)的氨基酸I;
[0197] 在氨基酸序列ADFNPEK(SEQIDNO: 45)內(nèi)的氨基酸N;以及
[0198] 在氨基酸序列QTPILGR(SEQIDNO:48)內(nèi)的氨基酸I。
[0199] 更具體來說，本發(fā)明提供一種經(jīng)分離豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRS)，其中其由 ORFla編碼的蛋白質(zhì)選自由含有以下中的任一者的那些氨基酸序列組成的群組：
[0200] 在氨基酸序列AP(參見SEQIDNO:9)內(nèi)的氨基酸N;
[0201] 在氨基酸序列HM(參見SEQIDNO: 12)內(nèi)的氨基酸N;
[0202] 在氨基酸序列PQG(參見SEQIDNO: 15)內(nèi)的氨基酸D;
[0203] 在氨基酸序列WIL(參見SEQIDNO: 18)內(nèi)的氨基酸Y;
[0204] 在氨基酸序列VHG(參見SEQIDNO: 21)內(nèi)的氨基酸H;
[0205] 在氨基酸序列KYD(參見SEQIDNO: 24)內(nèi)的氨基酸V;
[0206] 在氨基酸序列AID(參見SEQIDNO:27)內(nèi)的氨基酸T;
[0207] 在氨基酸序列SLL(參見SEQIDNO:30)內(nèi)的氨基酸L;
[0208] 在氨基酸序列M￡Q(參見SEQIDNO:33)內(nèi)的氨基酸C ;
[0209] 在氨基酸序列PIG(參見SEQIDNO:36)內(nèi)的氨基酸T;
[0210] 在氨基酸序列VAK(參見SEQIDNO: 39)內(nèi)的氨基酸A;
[0211] 在氨基酸序列EIV(參見SEQIDNO:42)內(nèi)的氨基酸I;
[0212] 在氨基酸序列FNP(參見SEQIDNO: 45)內(nèi)的氨基酸N;以及
[0213] 在氨基酸序列PIL(參見SEQIDNO:48)內(nèi)的氨基酸I。
[0214] 如上文所提到，存在北美和中國PRRS的許多已知病毒株和分離株，并且新穎病毒 株繼續(xù)進(jìn)化或分離。雖然在所有這些病毒株之間存在高水平的氨基酸序列同源性，但是本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將立即認(rèn)識到，的確存在一些變異，并且實(shí)際上可以采用這些差異和 相似性的優(yōu)點(diǎn)以進(jìn)一步改良所有疫苗病毒株的表現(xiàn)型特性。
[0215] 首先，關(guān)于通過剛剛（在第19頁-第20頁）在上文指定的SEQIDNO定義的所有 氨基酸基元，帶下劃線的并且優(yōu)選的氨基酸（如從P129第52代提供）一般保持完全有益 的，即使相鄰氨基酸已經(jīng)以其它方式從指定SEQIDNO序列改變。因此，關(guān)于AMAPYD(SEQ IDNO:9)，作為一個(gè)特定并且代表性實(shí)例，檢查來自任何北美或中國PRRS的對應(yīng)ORFl表 達(dá)的蛋白質(zhì)序列，從而發(fā)現(xiàn)對應(yīng)氨基酸基元一般來說是可能的，即使在所述其它病毒株中 由于進(jìn)化而發(fā)生了其它改變，引起取代和/或缺失或添加。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解， 通過P129第52代證明的優(yōu)選氨基酸改變因此也應(yīng)該保持可操作的，盡管在第52代的正 好5'或3'到指定氨基酸的整體氨基酸序列中有其它改變。如果在對比氨基酸改變被認(rèn) 為是保守的時(shí)尤其將如此。因此關(guān)于AMAPYD(SEQIDN0:9)和其子序列ANV，如果例如 其中的纈氨酸被異亮氨酸或亮氨酸或任何其它殘基替換，或如果簡單地缺失殘基或添加附 加殘基，那么應(yīng)該可能易于鑒別另一種PRRS病毒株中的類似基元。存在用于鑒別比對的 許多計(jì)算機(jī)程序并且由此確定多肽序列基元是否對應(yīng)于例如所謂的Blosum表（基于指定 的一致性百分比水平），參見S.赫尼霍夫等人"來自蛋白序列塊的氨基酸取代矩陣（Amino AcidSubstitutionmatricesfromproteinblocks)"，美國國家科學(xué)院院刊，89 (22)，第 10915頁-第10919頁，1992年11月15日，并且還參見A.L.勒寧格爾（A.L.Lehninger) 等人生物化學(xué)原理（PrinciplesofBiochemistry) ,2005，麥克米倫公司（MacMillanand Company)，第4版。保守氨基酸改變也基于分成以下總共5組來識別：巰基（Cys);芳香族 (卩116、15^和1'?。粔A性（1^8、八找、把8) ;脂肪族（^11、11611、1^11、]^1：)以及親水性（八1&、 Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser以及Thr)。因此，在適當(dāng)?shù)牟⑶覍?yīng)的位置并入關(guān)于P129 第52代所指定的氨基酸改變中的任一者來修飾編碼任何北美或中國PRRS的核苷酸序列是 在本發(fā)明的實(shí)踐內(nèi)，即使與所指定位置相鄰的其它氨基酸中的一或多者已經(jīng)被添加、缺失 或取代。
[0216] 另外，基于類似原理，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識到，一旦根據(jù)本發(fā)明實(shí)踐從關(guān) 于ORFla所鑒別的特定第52代改變鑒別出優(yōu)選的氨基酸，那么也可以將任何所述第52代 氨基酸之保守替換用于P129變異體中或關(guān)于任何其它北美或中國病毒株，伴隨對預(yù)期第 52代表現(xiàn)型的實(shí)質(zhì)性保護(hù)。因此，作為代表性實(shí)例：關(guān)于SLL(在SEQIDN0:30內(nèi)），指定 亮氨酸殘基可以進(jìn)一步用異亮氨酸、纈氨酸或甲硫氨酸替換；關(guān)于FNP(在SEQIDN0:45 內(nèi)），指定天冬酰胺可以用Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gin、Ser以及Thr中的任一者替換；以 及關(guān)于VAK(參見SEQIDN0:39)，指定丙氨酸可以用Asn、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Ser#& Thr中的任一者替換等等，但是將容易認(rèn)識到，任何所述替換氨基酸與最初鑒別的在指定位 置的獨(dú)特第52代氨基酸改變一樣好地起作用不是本發(fā)明的要求。當(dāng)然，在本發(fā)明中也實(shí)踐 了根據(jù)任何其它公認(rèn)模型的標(biāo)準(zhǔn)保守氨基酸改變的使用。舉例來說并且在所有情況下都包 括反之亦然，Asp用于Glu并且反之亦然,Asn用于Gin,Arg用于Lys,Ser用于Cys或Thr, Phe用于Tyr，Val用于Leu或lieu,Ala用于Gly等等。
[0217] 此外，在本發(fā)明的實(shí)踐內(nèi)，雖然單獨(dú)的第52代氨基酸改變（如以上關(guān)于ORFla所 鑒別）中的任一者可以有用地放在具有所希望的表現(xiàn)型作用的任何北美或中國PRRS中，但 是進(jìn)一步優(yōu)選的是在最終構(gòu)造體中包括盡可能多的表9或表10氨基酸選擇，所述最終構(gòu)造 體通常如通過編碼多核苷酸序列的適當(dāng)修飾來提供。因此，本發(fā)明的實(shí)踐包括提供中國或 北美PRRS病毒（和對應(yīng)編碼多核苷酸），這些病毒提供約17種所鑒別的第52代ORFla改 變（表9)中的2、3、4、5、6、7、8、9種并且多達(dá)其中的任何種（所有都在最終病毒序列內(nèi)）， 從而包括所有總體鑒別的第52代氨基酸改變的任何特定配對、三聯(lián)體或其它更高組合。當(dāng) 然，所述氨基酸改變可以通過定點(diǎn)誘變、PCR以及在本領(lǐng)域中眾所周知的其它技術(shù)被引入到 病毒的對應(yīng)編碼核苷酸序列中。
[0218] 為了證明特定遺傳修飾病毒株被減毒，可以使用如下所述的實(shí)驗(yàn)。
[0219] 在每一個(gè)試驗(yàn)中包括每組至少10只小母豬，它們來源于不含PRRSV的農(nóng)場。這些 動(dòng)物經(jīng)測試不含PRRS病毒特異性血清抗體并且是PRRSV陰性的。試驗(yàn)中所包括的所有動(dòng) 物具有相同的來源和品種。將動(dòng)物隨機(jī)分成數(shù)組。
[0220] 在懷孕第90天以每鼻孔IO5TCID5tl鼻內(nèi)施加ImlPRRSV進(jìn)行攻擊。每一個(gè)測試設(shè) 置存在至少三組：一組關(guān)于P129攻擊；一個(gè)測試組關(guān)于用可能減毒的病毒攻擊；以及一個(gè) 嚴(yán)格對照組。
[0221] 當(dāng)嚴(yán)格對照組在研究的時(shí)間過程內(nèi)保持PRRSV陰性并且在P129攻擊組中出生相 比于嚴(yán)格對照組少至少25%的健康活豬崽時(shí)，認(rèn)為所述研究是有效的。
[0222] 減毒（換句話說毒性更?。┒x為決定繁殖性能或其它癥候?qū)W的一或多個(gè)參數(shù)的 統(tǒng)計(jì)顯著改變 ：
[0223] 相比于未修飾親本病毒株感染組，測試組（可能減毒的病毒）的以下參數(shù)中的至 少一者的顯著降低將是一種減毒指示：
[0224] a)死產(chǎn)頻率
[0225] b)在懷孕第112天或在這之前流產(chǎn)
[0226] c)木乃伊化豬崽的數(shù)量
[0227] d)較不活躍并且虛弱的豬崽的數(shù)量
[0228] e)斷奶前死亡率
[0229] 此外，相比于未修飾親本病毒株感染組，測試組的以下參數(shù)之一顯著增加是優(yōu)選 的：
[0230] f)每只大母豬的斷奶豬崽的數(shù)量
[0231] g)每只大母豬生出的健康活豬崽的數(shù)量
[0232] 在替代方案中，可以檢查PRRSV感染的呼吸道癥狀和其它癥狀以建立減毒。
[0233] 減毒病毒株對于配制疫苗來說是有價(jià)值的。如果本發(fā)明疫苗保護(hù)豬不被PRRS病 毒感染，那么它是有效的。如果在向一或多只未感染的豬投與疫苗之后，生物學(xué)上純的病毒 分離株（例如，VR2385、VR2386、P129等）的隨后攻擊引起疾病的任何總體或組織病理學(xué) 改變（例如，肺部病灶）和/或癥狀的嚴(yán)重程度相比于無保護(hù)的類似豬（即，相對于適當(dāng)?shù)?對照組）中通常由分離株引起的那些改變或癥狀有所減弱，那么所述疫苗保護(hù)豬不被PRRS 病毒感染。更具體地說，通過向?qū)ζ溆行枰囊换蚨嘀缓线m的豬投與疫苗，然后在適當(dāng)?shù)臅r(shí) 間長度（例如，4周）之后，用生物學(xué)上純的PRRSV分離株的大樣品（IO^TCIDi5c0)攻擊， 可以顯示出本發(fā)明疫苗是有效的。然后在約一周之后從被攻擊的豬抽取血液樣品，并且然 后試圖從所述血液樣品中分離出病毒。大量病毒的分離說明所述疫苗可能不是有效的，而 有所降低的量的病毒（或無病毒）的分離說明所述疫苗可以是有效的。
[0234] 因此，可以在數(shù)量上（即，固結(jié)的肺組織的百分比相比于適當(dāng)?shù)膶φ战M有所減小） 或質(zhì)量上（例如，從血液分離PRRSV，通過免疫分析檢測肺、扁桃體或淋巴結(jié)組織樣品中的PRRSV抗原）評估本發(fā)明疫苗的有效性?？梢栽跀?shù)量上（例如，溫度/熱度）或半數(shù)量上 (例如，一或多種癥狀的存在或不存在或一或多種癥狀的嚴(yán)重程度的降低，所述癥狀例如發(fā) 紺、肺炎、肺部病灶等）評估豬繁殖與呼吸疾病的癥狀。
[0235] 未感染豬是尚未暴露于豬繁殖與呼吸疾病感染劑，或已經(jīng)暴露于豬繁殖與呼吸疾 病感染劑但是未顯示出所述疾病的癥狀的豬。被感染的豬是顯示出PRRS癥狀或可以從中 分離出PRRSV的豬。
[0236] 本發(fā)明疫苗可以遵循公認(rèn)慣例來配制，包括用于動(dòng)物，包括人類（如果適用）的 可接受載劑，例如標(biāo)準(zhǔn)緩沖液、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑和/或增溶劑；并且也可以經(jīng)配置以 促進(jìn)持續(xù)釋放。稀釋劑包括水、生理食鹽水、右旋糖、乙醇、甘油等。用于等張性的添加劑 尤其包括氯化鈉、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇以及乳糖。穩(wěn)定劑尤其包括白蛋白。其它合 適的疫苗媒劑和添加劑，包括尤其適用于配制經(jīng)修飾活疫苗的那些，為本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員所知曉或?qū)⑹乔宄?。參見例如雷明頓的藥物科學(xué)（Remington'sPharmaceutical Science),第18版，1990，馬克出版（MackPublishing),它以引用的方式并入本文中。
[0237] 本發(fā)明疫苗可以進(jìn)一步包含一或多種附加免疫調(diào)節(jié)組分，尤其例如佐劑或細(xì)胞因 子?？梢杂糜诒景l(fā)明疫苗中的佐劑的非限制性實(shí)例包括RIBI佐劑系統(tǒng)（蒙大拿州漢密爾 頓的瑞比公司（RibiInc. ,Hamilton,Mont.))、明研^、礦物凝膠（例如氫氧化錯(cuò)凝膠）、水 包油型乳液、油包水型乳液（例如弗氏（Freund's)完全和不完全佐劑）、嵌段共聚物（佐 治亞州亞特蘭大（Atlanta，Ga.)的CytRx)、QS-21 (馬薩諸塞州劍橋的劍橋生物技術(shù)公司 (CambridgeBiotechInc.,CambridgeMass. ))、SAF_M(加利福尼亞州愛莫利維爾的凱龍 公司（Chiron,EmeryvilleCalif. ))、AMPHIGEN.RTM.佐劑、皂苷、植物皂苷（QuilA)或其 它皂苷部分、單磷?；|(zhì)A以及阿夫立定（Avridine)脂質(zhì)-胺佐劑。適用于本發(fā)明疫苗 的水包油型乳液的非限制性實(shí)例包括經(jīng)修飾SEAM62和SEAM1/2配制品。經(jīng)修飾SEAM62 是一種水包油型乳液，它含有5% (v/v)角鯊烯（西格瑪（Sigma))、l% (v/v)SPAN.RTM. 85 清潔劑（ICI表面活性劑）、0. 7% (v/v)TWEEN.RTM. 80清潔劑（ICI表面活性劑）、2. 5% (v/ v)乙醇、200pg/ml植物阜苷、100[mgr]g/ml膽固醇以及0.5% (v/v)卵磷脂。經(jīng)修飾SEAM 1/2是一種水包油型乳液，它包含5 % (v/v)角鯊烯、1 % (v/v)SPAN.RTM. 85清潔劑、0.7% (v/v)吐溫80清潔劑、2.5% (v/v)乙醇、100yg/ml植物阜苷以及50yg/ml膽固醇?？梢?包括在疫苗中的其它免疫調(diào)節(jié)劑包括例如一或多種介白素、干擾素或其它已知細(xì)胞因子。
[0238] 本發(fā)明疫苗可以任選地經(jīng)配制用于持續(xù)釋放本發(fā)明的病毒、感染性RNA分子、質(zhì) ?；虿《据d體。所述持續(xù)釋放配制品的實(shí)例包括與生物相容性聚合物的復(fù)合物組合的 病毒、感染性RNA分子、質(zhì)粒或病毒載體，所述生物相容性聚合物例如聚（乳酸）、聚（乳 酸-共-乙醇酸）、甲基纖維素、透明質(zhì)酸、膠原蛋白等。藥物傳遞媒劑中可降解聚合物 的結(jié)構(gòu)、選擇和使用已經(jīng)在若干出版物中有所綜述，這些出版物包括A.多姆（A.Domb)等 人，1992，先進(jìn)技術(shù)聚合物（PolymersforAdvancedTechnologies)3:279_292,它以引用 的方式并入本文中。關(guān)于藥物配制品中聚合物的選擇和使用的附加指導(dǎo)可見于本領(lǐng)域中已 知的文本中，例如M.蔡辛（M.Chasin)和R.蘭格（R.Langer)(編），1990，"作為藥物傳遞 系統(tǒng)的生物可降解聚合物（BiodegradablePolymersasDrugDeliverySystems)"藥物與 制藥科學(xué)（DrugsandthePharmaceuticalSciences),第 45 卷，Μ·德克（M.Dekker),紐 約州，它也以引用的方式并入本文中?？商娲鼗蛄硗?，可以對病毒、質(zhì)粒或病毒載體進(jìn)行 微封裝以改良投藥和功效。用于對抗原進(jìn)行微封裝的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并且 包括在以下各者中所述的技術(shù)，例如美國專利第3, 137, 631號；美國專利第3, 959, 457號； 美國專利第4, 205, 060號；美國專利第4, 606, 940號；美國專利第4, 744, 933號；美國專利 第5, 132, 117 ;以及國際專利公開WO95/28227,所有這些都以引用的方式并入本文中。
[0239] 還可以使用脂質(zhì)體來提供病毒、質(zhì)?；虿《据d體的持續(xù)釋放。關(guān)于如何制造并使 用脂質(zhì)體配制品的細(xì)節(jié)尤其可見于美國專利第4, 016, 100號；美國專利第4, 452, 747號； 美國專利第4, 921，706號；美國專利第4, 927, 637號；美國專利第4, 944, 948號；美國專利 第5, 008, 050 ;以及美國專利第5, 009, 956中，所有這些都以引用的方式并入本文中。
[0240] 上述疫苗中的任一者的有效量可以通過常規(guī)手段確定，以低劑量的病毒、病毒蛋 白質(zhì)?；虿《据d體開始，并且然后增加劑量同時(shí)監(jiān)測作用?？梢栽趩未瓮杜c疫苗之后或在 多次投與疫苗之后獲得有效量。當(dāng)確定每種動(dòng)物的最佳劑量時(shí)，可以考慮已知因素。這些因 素包括所述動(dòng)物的物種、大小、年齡以及一般情況、所述動(dòng)物中其它藥物的存在情況等等。 優(yōu)選地在考慮了來自其它動(dòng)物研究（參見例如以下實(shí)例2和3)的結(jié)果之后選擇實(shí)際劑量。
[0241] 是否已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了足夠的免疫反應(yīng)的一種檢測方法是測定在接種疫苗之后動(dòng)物中 的血清轉(zhuǎn)化和抗體滴度。接種疫苗的時(shí)間安排和輔助劑（如果存在的話）的數(shù)量優(yōu)選地將 基于所有相關(guān)因素的分析由醫(yī)生或獸醫(yī)確定，所述因素中的一些在上文已有描述。
[0242] 本發(fā)明的病毒、蛋白質(zhì)、感染性DNA分子、質(zhì)?；虿《据d體的有效劑量可以使用已 知技術(shù)，考慮可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定的因素（例如待接種疫苗的動(dòng)物的體重）來確 定。本發(fā)明疫苗中本發(fā)明病毒的劑量優(yōu)選地介于約IO1到約IO9Pfu(空斑形成單位），更優(yōu) 選地約IO2到約IO8Pfu,并且最優(yōu)選地約IO3到約IO7Pfu的范圍內(nèi)。本發(fā)明疫苗中本發(fā)明質(zhì) 粒的劑量優(yōu)選地介于約〇.Img到約IOOmg,更優(yōu)選地約Img到約IOmg,甚至更優(yōu)選地約IOmg 到約Img的范圍內(nèi)。本發(fā)明疫苗中本發(fā)明感染性DNA分子的劑量優(yōu)選地介于約0.Img到約 IOOmg,更優(yōu)選地約Img到約IOmg,甚至更優(yōu)選地約IOmg到約Img的范圍內(nèi)。本發(fā)明疫苗中 本發(fā)明病毒載體的劑量優(yōu)選地介于約IO1Pfu到約109pfu，更優(yōu)選地約102pfu到約108pfu， 并且甚至更優(yōu)選地約IO3到約IO7Pfu的范圍內(nèi)。合適的劑量大小介于約0. 5ml到約IOml, 并且更優(yōu)選地約Iml到約5ml的范圍內(nèi)。
[0243] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)踐，病毒蛋白或肽疫苗的合適劑量的范圍一般是1到50微克/劑 量或更高的量，如可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法確定，其中關(guān)于每種所述物質(zhì)的佐劑的量通過公認(rèn)方 法確定。在關(guān)于豬的疫苗接種的一個(gè)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)例中，動(dòng)物的最佳年齡目標(biāo)是在約1與 21天之間，在斷奶之前，還可以與安排的其它疫苗接種一致，例如抗豬肺炎支原體或PCV。 另外，育種大母豬的疫苗接種的優(yōu)選安排將包括類似劑量與每年再接種安排。
[0244] 上述疫苗中的任一者的有效量可以通過常規(guī)手段確定，以低劑量的病毒、質(zhì)粒或 病毒載體開始，并且然后增加劑量同時(shí)監(jiān)測作用?？梢栽趩未瓮杜c疫苗之后或在多次投與 疫苗之后獲得有效量。當(dāng)確定每種動(dòng)物的最佳劑量時(shí)，可以考慮已知因素。這些因素包括 所述動(dòng)物的物種、大小、年齡以及一般情況、所述動(dòng)物中其它藥物的存在情況等等。優(yōu)選地 在考慮了來自其它動(dòng)物研究的結(jié)果之后選擇實(shí)際劑量。
[0245] 是否已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了足夠的免疫反應(yīng)的一種檢測方法是測定在接種疫苗之后動(dòng)物中 的血清轉(zhuǎn)化和抗體滴度。接種疫苗的時(shí)間安排和輔助劑（如果存在的話）的數(shù)量優(yōu)選地將 基于所有相關(guān)因素的分析由醫(yī)生或獸醫(yī)確定，所述因素中的一些在上文已有描述。
[0246] 本發(fā)明的病毒、感染性RNA分子、質(zhì)粒或病毒載體的有效劑量可以使用已知技術(shù)， 考慮可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定的因素（例如待接種疫苗的動(dòng)物的體重）來確定。舉例 來說，可以經(jīng)口、非經(jīng)腸、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、鼻內(nèi)或靜脈內(nèi)傳遞疫苗。經(jīng)口傳遞可以涵蓋例如 向動(dòng)物的飼料或飲料中添加組合物。與疫苗劑量有關(guān)的因素包括例如豬的體重和年齡。
[0247] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種制備包含本文中所述的PRRS病毒、感染性RNA分子、質(zhì)粒 或病毒載體的疫苗的方法，所述方法包含將有效量的本發(fā)明的PRRS病毒、感染性RNA分子、 質(zhì)?；虿《据d體中的一種與藥用或獸用可接受的載劑組合。
[0248] 另外，如美國專利第6, 500, 662號中所述，可以對本發(fā)明的活減毒疫苗進(jìn)行修飾 以編碼使用已知的重組技術(shù)插入到PRRS病毒基因組中的異源抗原表位。還參見美國專 利7, 132, 106,它以全文引用的方式并入本文中。適用作本發(fā)明異源抗原表位的抗原表位 包括來自除PRRS病毒以外的豬病原體的抗原表位，包括（但不限于）來自選自由以下組 成的群組的豬病原體的抗原表位：豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒、豬輪狀病毒、豬流感病毒、假 狂犬病毒、傳染性胃腸炎病毒、豬呼吸道冠狀病毒、古典豬瘟病毒、非洲豬瘟病毒、腦心肌炎 病毒、豬副粘病毒、細(xì)環(huán)病毒、胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacilluspleuropneumoniae)、 豬放線桿菌（Actinobacillussuis)、炭疽桿菌（Bacillusanthraci)、支氣管炎博德特 菌（Bordetellabronchiseptica)、溶血梭狀芽胞桿菌（Clostridiumhaemolyticum)、 產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens)、破傷風(fēng)梭菌（Clostridiumtetani)、大腸 桿菌（Escherichiacoli)、豬紅斑丹毒絲菌（Erysipelothrixrhusiopathiae)、副豬 嗜血桿菌（Haemophilusparasuis)、鉤端螺旋體屬（Leptospiraspp·)、豬肺炎支原 體（Mycoplasmahyopneumoniae)、豬鼻支原體（Mycoplasmahyorhinis)、豬滑液支原體 (Mycoplasmahyosynovia)、出血敗血性巴斯德氏菌（Pasteurellamultocida)、豬霍亂沙 門氏菌（Salmonellacholeraesuis)、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimurium)、類馬鏈 球菌（Streptococcusequismilis)以及豬鏈球菌（Streptococcussuis)。編碼來自上述 豬病原體的抗原表位的核苷酸序列是本領(lǐng)域中已知的并且可以在萬維網(wǎng)上從公共基因數(shù) 據(jù)庫獲得，例如（美國）國家生物技術(shù)信息中心的基因庫。
[0249] 本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將從本申請的全部內(nèi)容（包括詳細(xì)描述）清楚本發(fā)明的其 它特征和變化形式，并且所有所述特征打算作為本發(fā)明的方面。類似地，本文中所述的本發(fā) 明特征可以重新組合成附加實(shí)施例，這些附加實(shí)施例也打算作為本發(fā)明的方面，這與上文 是否具體提到特征組合作為本發(fā)明的方面或?qū)嵤├裏o關(guān)。此外，只有本文中描述為對本發(fā) 明至關(guān)重要的所述限制才應(yīng)該如此看待；缺乏本文中尚未描述為至關(guān)重要的限制的本發(fā)明 變化形式打算作為本發(fā)明的方面。應(yīng)該清楚，本發(fā)明可以與以上說明和實(shí)例中具體描述的 不同的方式來實(shí)踐。
[0250] 鑒于以上傳授內(nèi)容，本發(fā)明的許多修改和變化形式是可能的并且因此，在本發(fā)明 的范圍內(nèi)。
[0251] 以下實(shí)例旨在說明但不限制本發(fā)明。
[0252]實(shí)例1
[0253]PRRSV分離株P(guān)129對PK-9細(xì)朐的話應(yīng)和減毒
[0254] 在1995年在印地安那州普渡大學(xué)（PurdueUniversity)的動(dòng)物疾病診斷實(shí)驗(yàn)室， 從病豬中分離出了毒性PRRS分離株P(guān)129。使來自此豬的血清樣品在高健康狀態(tài)的豬中傳 代一次以擴(kuò)大血清和肺勻漿儲(chǔ)備液。從血清和肺勻漿中提取病毒RNA并將其用于測定P129 第〇代病毒的全基因組共同序列。RNA先用無規(guī)六聚物預(yù)致敏并用于合成cDNA。使用高保 真度（校正）PCR，在三個(gè)重疊碎片中擴(kuò)增基因組。來自三個(gè)單獨(dú)的PCR反應(yīng)（每一個(gè)基因 組區(qū)段）的PCR產(chǎn)物被T/A克隆并且用于DNA測序以產(chǎn)生全長基因組共同序列（參見SEQ IDN0:1)。
[0255] 使用用于DNA測序的含有P129第0代的相同豬血清的等分試樣來感染原代豬肺 泡巨噬細(xì)胞（PAM)細(xì)胞。通過0. 1微米針筒過濾器過濾來自PAM感染的子代病毒（第1代） 并將其用于感染PK-9細(xì)胞。
[0256]PK-9細(xì)胞是通過用編碼豬⑶163基因和新霉素抗性基因的缺失版本的質(zhì)粒穩(wěn)定 地轉(zhuǎn)染PK0809豬腎細(xì)胞系得到的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。先前已經(jīng)描述了PK-9細(xì)胞系的構(gòu)造和特 征的細(xì)節(jié)。
[0257] 使來自PAM細(xì)胞的第1代病毒適應(yīng)在PK-9細(xì)胞上生長是困難的，并且需要用 多個(gè)平行譜系嘗試若干次。通過具有復(fù)孔的免疫熒光法，使用對病毒核衣殼蛋白具有特 異性的FITC結(jié)合的單克隆抗體SD0W17(南達(dá)科他州布魯金斯的農(nóng)村技術(shù)公司（Rural TechnologiesInc,BrookingsSouthDakota))來監(jiān)測感染。早期傳代產(chǎn)生了一些小焦點(diǎn)， 但是未產(chǎn)生足以起始新鮮單層的感染的無細(xì)胞病毒粒子。這些傳代是通過用Accutase(胰 蛋白酶替代物）處理被感染的單層并且再播種于含新鮮培養(yǎng)基的多個(gè)孔中的細(xì)胞中來實(shí) 現(xiàn)的，所述培養(yǎng)基添加或未添加未感染的PK-9細(xì)胞。在若干次所述傳代之后，一些譜系顯 示出熒光焦點(diǎn)的頻率和大小清楚增加。這些當(dāng)中的一些已經(jīng)獲得了使用無細(xì)胞病毒體液 傳代的能力。通過傳代17次（1次在PAM細(xì)胞上，16次在PK-9上），可以使用來自先前傳 代的無細(xì)胞體液的稀釋液可靠地維持一個(gè)譜系，并且所述譜系在幾天內(nèi)引起整個(gè)單層的感 染。所述病毒在任何傳代水平都不引起對PK-9細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)。在病毒第17代，從 被感染的PK-9細(xì)胞提取RNA并將其用于構(gòu)造感染性cDNA克隆。
[0258]實(shí)例 2
[0259]P129-PK第17代的感染件cDNA克降的構(gòu)誥
[0260] 使用如先前所述的骨架質(zhì)粒構(gòu)造P129-PK第17代病毒的感染性cDNA克隆。通過 在重疊區(qū)中含天然存在的獨(dú)特限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的三個(gè)重疊區(qū)段中逆轉(zhuǎn)錄和PCR來 擴(kuò)增病毒基因組。對來自三個(gè)單獨(dú)的PCR反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測序，并且比對以產(chǎn)生每 個(gè)基因組區(qū)段的共同序列。如果指定區(qū)段的三個(gè)克隆產(chǎn)物中沒有一個(gè)匹配關(guān)于那個(gè)區(qū)段所 預(yù)測的共同氨基酸序列，那么通過亞克隆和/或定點(diǎn)誘變來修飾這些克隆中的一個(gè)直到它 匹配所預(yù)測的共同氨基酸序列為止。使用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)和限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)連接三個(gè) 基因組區(qū)段和質(zhì)粒骨架。命名為PCMV-S-P129-PK17-FL的所得全長克隆當(dāng)被轉(zhuǎn)染到PK-9 細(xì)胞中時(shí)是感染性的。這種感染性cDNA克隆的序列給出在SEQIDN0:2中。所述基因組 基本上與構(gòu)造它的第17代病毒一致，具有可靠末端，并且相對于第17代的共同序列缺乏任 何插入或缺失。在這種感染性cDNA克隆的病毒基因組內(nèi)不存在工程改造限制性位點(diǎn)或其 它目標(biāo)改變。
[0261]P129第0代的全基因組共同序列與感染性克隆pCMV-S-P129-PK17-FL的基因組 序列之間的核苷酸和氨基酸差異單獨(dú)地列在表6中。表6包括由于基因組位置所造成的 所有核苷酸差異和所得氨基酸差異。這些突變的子組導(dǎo)致從IFN抑制性（第O代）到IFN非抑制性（來源于第17代感染性cDNA克隆的所有病毒）的表現(xiàn)型改變。表7概述了由于 PRRSV開放閱讀框（ORF)或非結(jié)構(gòu)蛋白（nsp)所造成的核苷酸、氨基酸以及非保守氨基酸差 異。為了表7，以下各組氨基酸是在被認(rèn)為保守的那些當(dāng)中 ：[K、R]、[D、E]、[L、I、V、A]以 及[S、T]。
[0262]實(shí)例 3
[0263]P129-PK第17代中的缺失突奪體
[0264] 將基因組的兩個(gè)區(qū)域中的缺失工程改造到感染性cDNA克隆 PCMV-S-P129-PK17-FL中，從而產(chǎn)生五個(gè)遺傳修飾感染性克隆。
[0265] 經(jīng)歷修飾的基因組的一個(gè)區(qū)域是位于核衣殼蛋白（由PRRSVORF7編碼）的氨基 酸位置41-47的核定位序列（NLS)。制作了兩種類型的缺失。先前已經(jīng)在另一種PRRSV感 染性克隆的情況下描述了這些缺失。氨基酸殘基41-49的野生型序列是PG……KN。在突 變體"d43/44"（也稱為"PG-KS"）中，賴氨酸殘基43和44缺失并且天冬酰胺殘基49變 成了絲氨酸。在突變體"d43/44/46"（也稱為"PG-S-KS"）中，賴氨酸殘基43、44和46缺 失并且天冬酰胺殘基49變成了絲氨酸。來源于并有這些缺失的pCMV-S-P129-PK17-FL的 感染性克隆分別是pCMV-S-P129-PK17-d43/44 和pCMV-S-P129-PK17-d43/44/46。參見美國 專利第7, 544, 362號。
[0266] 經(jīng)歷修飾的基因組的第二區(qū)域是在ORFla內(nèi)的nsp2的高變區(qū)中。131個(gè)氨基酸 (393個(gè)核苷酸）的缺失先前已經(jīng)在另一種PRRSV感染性克隆的情況下有所描述。來源于并 有這種缺失的PCMV-S-P129-PK17-FL的感染性克隆是pCMV-S-P129-PK17-nsp2。
[0267] 在pCMV-S-P129-PK17-FL骨架內(nèi)還產(chǎn)生了組合了NLS和nsp2缺失的感染性克隆， 并且這些感染性克隆被命名為pCMV-S-P129-PK17-nsp2-d43/44 和pCMV-S-P129-PK17-nsp 2-d43/44/46。
[0268]實(shí)例 4
[0269]病毒在PK-9細(xì)朐h的產(chǎn)牛和牛長
[0270] 將實(shí)例3中所述的六種感染性克隆轉(zhuǎn)染到PK-9細(xì)胞中以產(chǎn)生如表1中所示的 六種病毒。通過使用脂染胺2000將環(huán)狀質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染到PK-9細(xì)胞中從這些感染性克隆 產(chǎn)生病毒。在轉(zhuǎn)染之后，使回收的病毒在PK-9細(xì)胞上再次連續(xù)傳代以便進(jìn)一步增加滴度 并且減弱毒性。制作儲(chǔ)備液作為候選疫苗進(jìn)行體外測試和體內(nèi)評估。在來源于非修飾的 PCMV-S-P129-PK17-FL感染性克隆的P129-PK17-FL病毒的情況下，培養(yǎng)所述病毒直到達(dá)到 總共52次從豬傳代為止。在第24代（SEQIDN0:3)和第52代（SEQIDN0:6)，對這種病 毒的全基因組進(jìn)行測序。
[0271]實(shí)例 5
[0272]來源于抑制IFN-α誘導(dǎo)的能力有所降低的P129-PK第17代感染件CDNA克降的 病毒
[0273] 病毒和細(xì)胞.使MARC-145和ST細(xì)胞在補(bǔ)充有5 %胎牛血清（FBS)和抗生素 (50μg/ml慶大霉素、100Π青霉素以及100μg/ml鏈霉素）的改良伊格爾培養(yǎng)基（modified Eagle'smedium;MEM)中生長。使豬肺泡巨噬細(xì)胞ZMAC-I細(xì)胞在補(bǔ)充有10%FBS的 RPMI-1640中生長。通過在改良伊格爾培養(yǎng)基中以多個(gè)0.01感染匯合ST細(xì)胞單層來制備 TGE病毒株P(guān)urdue。Ih后去除病毒接種物并且在補(bǔ)充有2. 5%FBS的MEM中在37°C下在 5%CO2氛圍中培育細(xì)胞。在觀察到80%細(xì)胞病變效應(yīng)之后，通過冷凍和解凍細(xì)胞單層釋放 病毒。使TGE病毒儲(chǔ)備液在4°C下在3, 500rpm下離心15分鐘并且儲(chǔ)存在-80°C下直到使 用為止。病毒儲(chǔ)備液（來自PK-9細(xì)胞）如下：P129-PK-FL和P129-PK-dnsp2-d43/44/46 是在第8/25代（8來自感染性克隆，25來自豬）。其它四種病毒（P129-PK-d43/44、 P129-PK-d43/44/46、P129-PK-dnsp2 以及P129-PK-dnsp2-d43/44)是在第 21/38 代。各 種PRRS病毒的操作儲(chǔ)備液通過在ZMAC-I細(xì)胞上進(jìn)行單次傳代來制備，除了市售疫苗 IngelvacPRRSMLV和IngelvacPRRSATP根據(jù)制造商的說明書復(fù)原并且直接用于感染。
[0274] 豬PBMC的分離.用漢克氏（Hank's)稀釋新鮮肝素化靜脈血并且通過菲科爾-泛 影鈉（FiC〇ll-Hypaque) 1077(西格瑪）梯度密度離心來分離PBMC。在漢克氏中洗滌兩次之 后，將細(xì)胞懸浮于含L-谷氨酰胺（美的泰克（Mediatech))的RPMI培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基 補(bǔ)充有5%胎牛血清（吉畢科（6讓〇〇))、10(^/1111青霉素、0.11^/1111鏈霉素、11111丙酮酸鈉、 IX非必需氨基酸（美的泰克）lOOU/ml慶大霉素以及250mM2-巰基乙醇（西格瑪）。
[0275] 豬漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞的純化.豬漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞的純化如先前所述（卡爾 扎達(dá)?諾瓦（Calzada-Nova)，已提交）進(jìn)行，并且是基于這些細(xì)胞對⑶4和⑶172的特征 表達(dá)（薩默菲爾德等人，2003)。簡單來說，將新鮮豬PBMC懸浮于含0. 5%BSA的PBS中并 且用最佳量的識別豬⑶172 (74-22-15,VMRD)的mAb標(biāo)記。在洗滌一次之后，然后使細(xì)胞與 結(jié)合到PE(南方生物技術(shù)（SouthernBiotech))的第二山羊抗小鼠抗體一起培育并且在洗 滌之后，與FITC標(biāo)記的抗⑶4 (74-12-4,VMRD) -起培育。在反射細(xì)胞分類器（iCyt)上對 PDC進(jìn)行分類，在⑶47⑶172ffi群體上設(shè)置分類門（sortgate)。在分類之后，通過再分析證 實(shí)細(xì)胞純度。在所有情況下，純度是>95%。
[0276] 細(xì)胞因子分泌測量結(jié)果的分析.用不同刺激物刺激PBMC或H)C16小時(shí)（37°C， 5%CO2)或模擬刺激。在培育之后，使用用可商購的單克隆抗體（抗豬IFN-amAbK9和F17) 制備的夾心ELISA分析上覆刺激細(xì)胞的培養(yǎng)基中IFN-a的存在。簡單來說，通過在4°C下 培育過夜，接著用補(bǔ)充有5 %胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基封閉，用抗豬IFN-amAbF17(PBL實(shí) 驗(yàn)室）涂布ImmulonII板（戴雷泰克公司（DynatechInc·))。1小時(shí)后，丟棄培養(yǎng)基并且 將五十微升有待測試的上清液一式兩份地添加到分析孔中。在1小時(shí)培育之后，分析孔洗 滌4次并且然后依次用生物素標(biāo)記的抗豬IFN-amAbK9(PBL實(shí)驗(yàn)室）、HRP結(jié)合的鏈霉親 和素（扎美德實(shí)驗(yàn)室（ZymedLaboratories))以及TMB底物（KPL)培育。用ELISA讀板儀 測定光密度。
[0277] 來源于P129-PK第17代感染性⑶NA克隆的病毒缺乏抑制IFN-α誘導(dǎo)的能力。使 用豬肺泡巨噬細(xì)胞細(xì)胞系ZMAC-1，從一組四種不同PRRS野生型病毒分離株（Ρ3412、Ρ129、 IND5、NADC20)制備操作病毒儲(chǔ)備液。其它儲(chǔ)備液也從前兩種野生型病毒的衍生物制備，這 些衍生物通過在PK-9、FK.D4或MARC-145細(xì)胞中反復(fù)傳代已經(jīng)適應(yīng)于在細(xì)胞培養(yǎng)液中生 長。四種野生型分離株中的三種（P129、IND5、NADC20)容易地并且有效地在ZMAC-I細(xì)胞中 生長到約IO7TCID5ciAiI的滴度，而P3412野生型分離株到達(dá)僅僅IO5TCID5cZml的滴度。值得 注意地，在ZMAC-I細(xì)胞系中制備的P129病毒的儲(chǔ)備液的滴度達(dá)到了在PK-9或MARC-145 細(xì)胞（病毒已適應(yīng)這些細(xì)胞）中獲得的滴度的10倍。這些病毒刺激PBMC分泌IFN-α的 能力的檢查揭示了有一個(gè)例外（分離株Ρ3412克隆C)，這些細(xì)胞響應(yīng)于其暴露于所測試的 PRRS病毒儲(chǔ)備液中的任一者分泌出極少量（<50pg)的IFN-α，相比于相同細(xì)胞由于其暴露 于豬冠狀病毒傳染性胃腸炎病毒（TGEv)所產(chǎn)生的IFN-α的大量分泌（17,540pg)，這是可 忽略的。
[0278]PRRSV不僅不能夠刺激豬PBMC產(chǎn)生IFN-α，而且主動(dòng)地抑制其產(chǎn)生。通過測量在 存在或不存在PRRSV的情況下，PBMC響應(yīng)于暴露于TGEv所分泌的IFN-α的量來測定PRRSV 儲(chǔ)備液的抑制作用。如表2中所示，經(jīng)測試的所有4種野生型PRRS病毒分離株以及所有細(xì) 胞培養(yǎng)液適應(yīng)的衍生物都展現(xiàn)出對PBMC對TGEv的IFN-α反應(yīng)的強(qiáng)烈抑制作用（>80% )。 進(jìn)行了對來源于感染性cDNA克?。╬CMV-S-P129-PK17-FL)，包括全長P129-PK-FL病毒和 若干基因工程改造的缺失突變體的一組病毒儲(chǔ)備液的分析。如表3中所示，當(dāng)與親本野生 型分離株Ρ129(第1代）的強(qiáng)烈抑制作用（95% )相比時(shí)，P129-PK-FL病毒和所有缺失突 變體展現(xiàn)出在PBMC中抑制TGEv誘導(dǎo)IFN-α的能力明顯有所降低。為了進(jìn)一步評估這些 病毒的IFN-α表現(xiàn)型，隨后的實(shí)驗(yàn)集中于進(jìn)行P129-PK-FL和P129-PK-d43/44病毒、親本 P129野生型病毒株和/或由勃林格殷格翰（BoehringerIngelheim)生產(chǎn)的兩種市售經(jīng) 修飾活PRRSV疫苗（IngelvacPRRSMLV和IngelvacPRRSATP)之間的直接比較。還測 試了附加低傳代參考分離株NVSL-14。如表4中所示，在四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，P129-PK-FL和 P129-PK-d43/44展現(xiàn)出明顯低于親本P129病毒、兩種Ingelvac減毒病毒株或參考病毒株 的IFN-α抑制作用。在一個(gè)例子中，與P129-PK-FL或P129-PK-d43/44病毒的協(xié)同感染促 使TGEv的IFN-α反應(yīng)明顯增強(qiáng)。
[0279] 表2中所示的結(jié)果顯示適于在細(xì)胞培養(yǎng)液中生長的野生型PRRS病毒和衍生物的 干擾素-α抑制作用。所指定的PRRS病毒儲(chǔ)備液在ZMAC-I細(xì)胞中生長并且使用ZMAC-I 細(xì)胞測定這些新產(chǎn)生的儲(chǔ)備液的滴度。通過ELISA測定在存在或不存在TGE病毒的情況 下，暴露于指定PRRS病毒儲(chǔ)備液18小時(shí)的豬外周血單個(gè)核細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液中所存在 的IFN-α的量。*僅對TGEv起反應(yīng)。
[0280] 表3中所示的結(jié)果證明了適于在表達(dá)⑶163的PK-9細(xì)胞中生長的野生型PRRS病 毒P129和其基因工程改造衍生物的干擾素-α抑制作用。通過ELISA測定在存在或不存 在TGE病毒的情況下，暴露于指定PRRS病毒儲(chǔ)備液18小時(shí)的豬外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC) 的培養(yǎng)物上清液中所存在的IFN-α的量。na=不適用；*僅對TGEv起反應(yīng)。
[0281] 表4示出了P129-PK-FL和P129-PK-d43/44病毒相比于野生型P129病毒和PRRS Ingelvac疫苗有所降低的干擾素-α抑制作用。通過ELISA測定在存在或不存在TGE病毒 的情況下，暴露于指定PRRS病毒儲(chǔ)備液18小時(shí)的豬外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)的培養(yǎng)物上 清液中所存在的IFN-α的量。na=不適用；*僅對TGEv起反應(yīng)。
[0282] 由PBMC響應(yīng)于其暴露于TGEV分泌的大量IFN-α主要來源于包含小于〇. 3% PBMC群體的細(xì)胞子組。這種罕見的但是重要的細(xì)胞子組由漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（PDC) 構(gòu)成，它們由于特征性漿細(xì)胞樣形態(tài)而接受這種名稱。為了進(jìn)一步檢查P129-PK-FL和 P129-PK-d43/44病毒的IFN-α表現(xiàn)型，進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，這些實(shí)驗(yàn)類似于上文所述的那 些實(shí)驗(yàn)，除了采用從PBMC中新鮮分離到>95%純度的H)C。如圖1所示，這一系列的實(shí)驗(yàn)證 實(shí)了P129-PK-FL和P129-PK-d43/44病毒引起的對TGEV誘導(dǎo)IFN-α的抑制可忽略不計(jì)。 此外，在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，觀察到了對PDC響應(yīng)于P129-PK-FL和P129-PK-d43/44PRRS病毒的 TGEV介導(dǎo)的IFN-α誘導(dǎo)的明顯強(qiáng)化作用。相比之下，IngelvacPRRSMLV病毒展現(xiàn)出對 IFN-α反應(yīng)的強(qiáng)烈抑制作用，如圖1所示。
[0283] 實(shí)驗(yàn)部分中所述的結(jié)果揭示了P129-PK-FL和P129-PK-d43/44PRRS病毒以及 PCMV-S-P129-PK17-FL感染性cDNA克隆的其它衍生物在被感染的PBMC或PDC細(xì)胞中抑制 TGEV誘導(dǎo)IFN-α的能力大大降低。這與野生型（低傳代）PRRS病毒和兩種市售經(jīng)修飾活 病毒疫苗（IngelvacPRRSMLV和IngelvacPRRSATP)所觀察到的IFN抑制作用形成了鮮 明的對比。假設(shè)這些細(xì)胞在介導(dǎo)抗病毒感染的先天性免疫中所起的主要作用，P129-PK-FL 和P129-PK-d43/44最低限度地抑制PDC的這種重要功能這一觀察結(jié)果是潛在地顯著的。
[0284] 還應(yīng)該指出，本發(fā)明提供適于在重組地表達(dá)⑶163受體的受納細(xì)胞上生長的臨床 上有效的市售疫苗病毒，并且所述病毒和疫苗不取決于歷史"猿猴細(xì)胞"培養(yǎng)技術(shù)，也不在 任何時(shí)候用歷史"猿猴細(xì)胞"培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展。具體參見美國專利7, 754, 464。
[0285]實(shí)例6
[0286] 候詵疫苗的安全件和功效
[0287]為了評估其作為對抗PRRS的疫苗的安全性和功效，在幼豬呼吸道疾病模型 中評估來源于PCMV-S-P129-PK17-FL感染性cDNA克隆、P129-PK-FL(第 7/24 代）、 P129-PK-d43/44(第 17/34 代）以及P129-PK-d43/44/46(第 17/34 代）的病毒中的三種。 這些病毒的來源示出在圖8中，并且實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（處理組）列在表5中。使用低傳代毒性PRRSV 分離株NADC20在7周齡（疫苗接種之后四周）進(jìn)行異源攻擊。對照處理組包括模擬疫苗 和市售PRRS疫苗IngelvacMLV。
[0288] 非處理（NT)組如下：NT1豬是用于監(jiān)測來源豬的健康狀態(tài)的哨兵。將它們分開圈 養(yǎng)并且在PRRSV攻擊之前進(jìn)行尸體剖檢。NT2豬是分開圈養(yǎng)在兩圈接種疫苗的豬之間的豬 圈中的接觸對照組，對于T02到T05中的每一個(gè)，每個(gè)處理組總共兩個(gè)接觸對照組。NT3豬 是每個(gè)豬圈與接種疫苗的豬一起圈養(yǎng)的接觸對照組，每個(gè)處理組（T01到T05)總共兩個(gè)接 觸對照組。只有NT3豬被分配到TOl組。
[0289] 在接種疫苗之后測量接種疫苗的動(dòng)物的直腸溫度并且將其與TOl(模擬疫苗）處 理組進(jìn)行對比。結(jié)果示出在圖1中。沒有一種疫苗誘導(dǎo)發(fā)燒。在接種疫苗后的整個(gè)觀察階 段中，所有組平均小于104°c。
[0290] 測量攻擊后豬的直腸溫度。結(jié)果示出在圖2中。未接種疫苗的TOl豬顯示維持大 于l〇4°C的熱度。相比之下，這些疫苗中的三種在攻擊后熱度顯著降低。P129-PK-FL在降 低熱度方面最有效。
[0291] 記錄接種疫苗之前和之后的動(dòng)物體重。結(jié)果示出在圖3中。在研究的前1天（在 接種疫苗之前）、第10天、第24天、第27天（在攻擊之前）以及第37天記錄體重。在未 接種疫苗的豬中，用毒性NADC20病毒攻擊幾乎完全消除了 10天觀察階段期間的體重增加。 所述疫苗不同程度地否定這種作用。
[0292] 在攻擊之后，在尸體剖檢時(shí)檢查被攻擊動(dòng)物的肺。每個(gè)肺的涉及病灶的百分比示 出在圖4中。TOl模擬疫苗組平均25. 1%肺部病灶涉及率。所述疫苗不同程度地降低了肺 部病灶。P129-PK-FL是最有效的，使肺部病灶涉及率降低到I. 1%。
[0293] 使用肺評估評分（LAS)來評估肺部病灶的嚴(yán)重程度，如圖5所示。所述疫苗中的 三種降低LAS。P129-PK-FL使平均LAS從模擬接種疫苗組中的1. 63降低到0. 14。
[0294] 通過接種疫苗和攻擊兩者誘導(dǎo)針對PRRSV的血清抗體。在研究的第27天和第37 天測量IDEXXELISAS/P比率。結(jié)果示出在圖6中。接種P129-PK-FL誘導(dǎo)出最高水平的 抗PRRS抗體。
[0295] 在PAM細(xì)胞上滴定被攻擊的豬的血清中的病毒血癥。結(jié)果（TCID5ciAiL)給出在圖 7中。P129-PK-FL在減少攻擊后病毒血癥方面是最有效的。
[0296] 雖然已經(jīng)參見以上實(shí)例和附件（所述附件中的每一個(gè)的完整內(nèi)容以其全文引用 的方式并入本文中）描述了本發(fā)明，但是應(yīng)了解，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)涵蓋修改和變 化形式。因此，本發(fā)明僅受以下權(quán)利要求書的限制。
[0297]實(shí)例 7
[0298]來自感染件CDNA克降PCMV-S-P129 的感染件CDNA克降PCMV-S-P129-PK17-FL的 衍牛物
[0299] 本發(fā)明的PRRSV感染性cDNA克隆pCMV-S-P129-PK17-FL可以使用定點(diǎn)誘變技 術(shù)，由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地從先前所述的PRRSV感染性cDNA克隆pCMV-S-P129得到。 PRRSV感染性cDNA克隆pCMV-S-P129描述于美國專利第6, 500, 662號中，并且以寄存編號 203489保藏于ATCC。這種克隆中的PRRSV基因組的DNA序列也可在基因庫（NCBI)數(shù)據(jù)庫 中以寄存編號AF494042獲得。定點(diǎn)誘變試劑盒可購自多個(gè)供應(yīng)商，并且能夠在大質(zhì)粒中在 多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)制造許多核苷酸改變。所述試劑盒包括（但不限于）Change-IT?多點(diǎn)突變定 點(diǎn)誘變試劑盒（昂飛（Affymetrix)/USB)、QuikChange快速多定點(diǎn)誘變試劑盒（安捷倫技 術(shù)-斯塔津產(chǎn)品（AgilentTechnologies-StratageneProducts))以及AMAP多定點(diǎn)誘變 試劑盒（MBL國際性組織（MBLInternational))。
[0300]PRRSV感染性cDNA克隆pCMV-S-P129 (可自ATCC獲得）與本發(fā)明的PRRSV感染 性cDNA克隆pCMV-S-P129-PK17-FL之間的核苷酸改變的清單呈現(xiàn)在表8中。所有改變都 是在基因組的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域中。存在總共74種核苷酸改變，它們可以使用74種突變誘 發(fā)引物和與市售定點(diǎn)誘變試劑盒的多個(gè)序列反應(yīng)被引入到PCMV-S-P129感染性克隆中，產(chǎn) 生在序列上與本文中所述的PCMV-S-P129-PK17-FL-致的質(zhì)粒分子。實(shí)際上，可以在少于 74種突變誘發(fā)引物的情況下得到相同結(jié)果，因?yàn)榭梢允褂脝我煌蛔冋T發(fā)引物改變在彼此的 約50-60個(gè)核苷酸內(nèi)的突變簇。舉例來說，可以使用單一突變誘發(fā)引物改變核苷酸735、750 和756,如同可以改變核苷酸965、992和1009 -樣。因此引物數(shù)量被降到約60。
[0301] 在74種核苷酸改變中，大多數(shù)（42種）是同義或"沉默"的，意指它們編碼相同氨 基酸。這些核苷酸改變不太可能對病毒的干擾素誘導(dǎo)或抑制表現(xiàn)型造成任何可測量的影 響。其余的32種核苷酸改變是非同義或"非沉默"的，并且引起病毒蛋白中的氨基酸改變。 預(yù)測這32種核苷酸改變直接導(dǎo)致病毒的干擾素誘導(dǎo)/抑制表現(xiàn)型，并且應(yīng)該被改變以便將 由感染性克隆PCMV-S-P129編碼的病毒轉(zhuǎn)化成如由感染性克隆pCMV-S-P129-PK17-FL編碼 的病毒所示的相同干擾素表現(xiàn)型。此類改變將需要最多32種突變誘發(fā)引物，如果考慮到一 些相關(guān)核苷酸的成簇，那么更少。
[0302]實(shí)例 8
[0303]感染件CDNA克降PCMV-S-P129-PK17-FL的從頭合成
[0304] 作為定點(diǎn)誘變的一個(gè)替代方案，本發(fā)明的PRRS病毒基因組可以用適當(dāng)?shù)?'和3' 銜接子序列以化學(xué)方式從頭合成，并且克隆到用于PRRS感染性cDNA克隆pCMV-S-P129 (可 自ATCC以寄存編號203489獲得）的質(zhì)粒骨架或類似質(zhì)粒骨架中。長度大于50kb(PRRSV基 因組是約15. 5kb)的基因的委托合成可以商業(yè)服務(wù)形式從許多供應(yīng)商獲得，所述供應(yīng)商包 括（但不限于）：金斯瑞（GenScript)、DNA2.O以及生物基礎(chǔ)公司（BioBasicInc.)。通過 使用側(cè)接基因組的5'PacI和3'SpeI限制酶位點(diǎn)替換感染性克隆pCMV-S-P129中的病毒基 因組，將合成病毒基因組定向克隆到PCMV-S載體中。為了切割合成基因組，將24個(gè)核苷酸 的延伸部分（5' -GCAGAGCTCGTTAATTAAACCGTC-基因組_3'，它包括帶下劃線的PacI位點(diǎn)） 構(gòu)建到合成基因組的5'端中，并且將83個(gè)核苷酸的延伸部分（5'_基因組-AAAAAAAAAAAAA AAAAAAAATGCATATTTAAATCCCAAGCCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGAGCGGCCGC-3' ，它 包括帶下劃線的SpeI位點(diǎn)）構(gòu)建到合成基因組的3'端中。在用PacI和SpeI切割質(zhì)粒和 合成基因組之后，純化適當(dāng)片段，使用DNA連接酶連接，并且使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員眾 所周知的標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)轉(zhuǎn)型到大腸桿菌中進(jìn)行篩選和繁殖。
[0305]表L
[0306]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于保護(hù)豬科動(dòng)物不被PRRS病毒感染的疫苗，所述疫苗包含（a)北美PRRS病 毒，它由多核苷酸分子SEQ ID N0:6或在非常嚴(yán)格的條件下與其雜交的任一多核苷酸編碼， 在65°C下在0. 5M NaHP04、7% SDS、lmM EDTA中與過濾器結(jié)合的DNA雜交，并且在68°C下在 0. IX SSC/0. 1% SDS中洗滌；(b)所述編碼多核苷酸分子；（c)呈質(zhì)粒形式的所述多核苷酸 分子；或（d)病毒載體，它包含所述多核苷酸分子，其中所述PRRS病毒能夠以可有效產(chǎn)生對 抗感染的免疫保護(hù)的量引發(fā)不被PRRS病毒感染的有效免疫保護(hù)反應(yīng)；和適用于獸用的載 齊U，并且其中所述疫苗早在豬崽1日齡時(shí)就提供了早期并且安全的疫苗接種，并且其中所 述疫苗提供長達(dá)6個(gè)月的免疫持續(xù)時(shí)間。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其中免疫的發(fā)生是在接種疫苗之后兩周開始提供。
3. -種用于給豬科動(dòng)物接種疫苗以不被PRRS病毒感染的方法，包含在出生之后約12 小時(shí)與2周齡之間投與所述疫苗，其中所述疫苗包含 (a) 包含編碼感染性RNA分子的DNA序列的經(jīng)分離多核苷酸分子，所述感染性RNA分子 編碼北美PRRS病毒， (b) 編碼北美PRRS病毒的感染性RNA分子； (c) 呈質(zhì)粒形式的所述多核苷酸分子（a)，或 (d) 包含感染性序列的病毒載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中保護(hù)性免疫在接種疫苗之后不遲于約14天出現(xiàn)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中保護(hù)性免疫在生命第1天接種疫苗之后在第15 天、在生命第7天接種疫苗之后在第21天或在生命第14天接種疫苗之后在不遲于約第28 天出現(xiàn)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所提供的保護(hù)性免疫的持續(xù)時(shí)間長達(dá)6個(gè)月。
【文檔編號】A61K39/12GK104302316SQ201380025700
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年5月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月17日
【發(fā)明者】J.G.卡爾弗特, R.G.安肯鮑爾, J.G.馬克思, D.S.皮爾斯, M.L.基思 申請人:佐蒂斯有限責(zé)任公司