一種鑒定胡桃木細(xì)小蠹的引物、試劑盒及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及胡桃木細(xì)小蠢鑒定領(lǐng)域，具體而言，設(shè)及一種鑒定胡桃木細(xì)小蠢的引 物、試劑盒及其方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，對(duì)胡桃木細(xì)小蠢的鑒定主要是依據(jù)W下形態(tài)特征：
[000引 （1)體形微小，身體全長(zhǎng)1. 5-1. 9mm，約為體寬的2. 8-3. 1倍，雌蟲(chóng)體色黃褐，雄蟲(chóng) 近黑色。觸角鍵狀部第1、第2節(jié)間有嵌隔。額面輕微向口上片邊緣抬起，側(cè)緣突成半圓狀， 與眼緣的距離為小眼直徑的2-3倍；雌蟲(chóng)額面平或稍凹，表面光滑，刻點(diǎn)細(xì)密勻稱，茸毛密 集，近邊緣的茸毛較長(zhǎng)；雄蟲(chóng)額面寬而下凹，刻點(diǎn)粗糖，茸毛短且疏，較不顯眼。剛毛最長(zhǎng)約 達(dá)一半眼距。
[0004] (2)前胸背板：長(zhǎng)約為寬的1. 10-1. 16倍，自基部起一半側(cè)緣橫直，前緣弓成寬半 圓形。前緣有約18個(gè)銀齒。背板頂部位于中部或中部偏前，前半部為鱗狀瘤區(qū)，瘤多有缺 亥IJ，呈4-6排清晰的近同屯、圓狀排列，背板前緣著生的鱗狀瘤數(shù)目超過(guò)12,同排相鄰的鱗狀 瘤常在基部相連，常于背中線附近出現(xiàn)重疊。背板后半部分為刻點(diǎn)區(qū)，表面平緩而光滑，刻 點(diǎn)稍大且密。背板前部表被剛毛較長(zhǎng)，隨鱗狀瘤整齊排列，后部剛毛較疏細(xì)。
[0005] (3)銷翅：長(zhǎng)約為寬的1. 8-1. 9倍，約為前胸背板1. 7倍長(zhǎng)，自基部起3/4側(cè)緣橫 直，銷翅末端純圓。銷翅斜面較睹，刻點(diǎn)較大，排列成行形成刻點(diǎn)溝，其中第1、第2溝刻點(diǎn) 較淺，除第1刻點(diǎn)溝于斜面處下陷外，其余刻點(diǎn)溝不下陷。溝間部平滑，寬度約為刻點(diǎn)溝的 1倍或1. 5倍；第1溝間部十分寬，并明顯向上隆起；第2溝間部與1等寬，平滑略呈革質(zhì)； 第1、第3溝間部上各有1列極疏的刻點(diǎn)。位于刻點(diǎn)溝內(nèi)短且細(xì)的剛毛延伸至翅銷基部，溝 間部剛毛大部分較疏地排列于銷翅斜面的基數(shù)刻點(diǎn)溝上。雄蟲(chóng)第1、第2溝間部各有1列小 顆粒。
[0006] 有明顯的形態(tài)鑒別特征的昆蟲(chóng)，有經(jīng)驗(yàn)的昆蟲(chóng)鑒定工作者會(huì)在最短的時(shí)間內(nèi)鑒定 出結(jié)果。形態(tài)鑒定最難解決的問(wèn)題是具有細(xì)微差異的近緣種或區(qū)別近似種，尤其是對(duì)于鑒 定經(jīng)驗(yàn)不夠豐富的鑒定者而言，更加困難。由于形態(tài)極相似，因而往往找不到好的形態(tài)鑒別 特征。所W需要分子學(xué)鑒定方法去進(jìn)一步區(qū)分。
[0007] 目前分子學(xué)鑒定方法能夠準(zhǔn)確的區(qū)分不同目、科的物種，但對(duì)于同屬的多個(gè)近緣 物種的區(qū)分仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)。對(duì)序列高度相似的近緣物種設(shè)計(jì)只擴(kuò)增一個(gè)物種的引物 是困難的；傳統(tǒng)物種特異性PCR對(duì)假陰性、假陽(yáng)性結(jié)果很敏感。
[000引有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的第一目的在于提供一種鑒定胡桃木細(xì)小蠢的引物，該引物特異性強(qiáng)，敏 感度高，重復(fù)性好，能很穩(wěn)定的鑒定是否為胡桃木細(xì)小蠢。
[0010] 本發(fā)明的第二目的在于提供一種鑒定胡桃木細(xì)小蠢的試劑盒，為胡桃木細(xì)小蠢的 鑒定提供便捷。
[0011] 本發(fā)明的第=目的在于提供一種鑒定胡桃木細(xì)小蠢的方法，該方法結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒 定和分子生物學(xué)鑒定技術(shù)，鑒定準(zhǔn)確率高，方便快捷，為胡桃木細(xì)小蠢提供科學(xué)的分類鑒定 依據(jù)。
[0012] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用W下技術(shù)方案：
[0013] 一種鑒定胡桃木細(xì)小蠢的引物，由第一引物對(duì)、第二引物對(duì)、第=引物對(duì)和第四引 物對(duì)組成；
[0014] 所述第一引物對(duì)由上游引物PI-F和下游引物PI-R組成，所述上游引物PI-F的堿 基序列如SEQIDNo. 1所示；所述下游引物Pl-R的堿基序列如SEQIDNo. 2所示；
[001引所述第二引物對(duì)由上游引物P2-F和下游引物P2-R組成，所述上游引物P2-F的堿 基序列如SEQIDNo. 3所示；所述下游引物P2-R的堿基序列如SEQIDNo. 4所示；
[0016] 所述第S引物對(duì)由上游引物P3-F和下游引物P3-R組成，所述上游引物P3-F的堿 基序列如SEQIDNo. 5所示；所述下游引物P3-R的堿基序列如SEQIDNo. 6所示；
[0017] 所述第四引物對(duì)由上游引物P4-F和下游引物P4-R組成，所述上游引物P4-F的堿 基序列如SEQIDNo. 7所示；所述下游引物P4-R的堿基序列如SEQIDNo. 8所示。
[0018] 本發(fā)明提供的鑒定胡桃木細(xì)小蠢的引物，根據(jù)生物系統(tǒng)生物學(xué)，結(jié)合胡桃木細(xì)小 蠢的近緣物種的已知序列，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品的多次驗(yàn)證得到，該引物特異性強(qiáng)，敏感度高，重復(fù) 性好，能很穩(wěn)定、快速的鑒定是否為胡桃木細(xì)小蠢。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種鑒定胡桃木細(xì)小蠢的試劑盒，含有權(quán)利要求1中所述的第一 弓I物對(duì)、第二引物對(duì)、第S引物對(duì)化及第四引物對(duì)中的至少一個(gè)引物對(duì)。
[0020] 如：在一些實(shí)施例中，鑒定胡桃木細(xì)小蠢的試劑盒，可W含有第一引物對(duì)、第二引 物對(duì)、第=引物對(duì)W及第四引物對(duì)中的任一個(gè)；在一些實(shí)施例中，鑒定胡桃木細(xì)小蠢的試劑 盒，可W含有第一引物對(duì)、第二引物對(duì)、第=引物對(duì)W及第四引物對(duì)中的任兩個(gè)；在一些實(shí) 施例中，鑒定胡桃木細(xì)小蠢的試劑盒，可W含有第一引物對(duì)、第二引物對(duì)、第=引物對(duì)W及 第四引物對(duì)中的任=個(gè)；在一些實(shí)施例中，鑒定胡桃木細(xì)小蠢的試劑盒，含有第一引物對(duì)、 第二引物對(duì)、第=引物對(duì)W及第四引物對(duì)。
[0021] 為了便于應(yīng)用，優(yōu)選地，所述試劑盒還含有Taq酶、dNTPs和PCRbuffer。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種鑒定胡桃木細(xì)小蠢的方法，對(duì)待檢測(cè)樣品進(jìn)行分子生物學(xué)鑒 定；所述分子生物學(xué)鑒定是W權(quán)利要求1中的第一引物對(duì)、第二引物對(duì)、第S引物對(duì)和第四 引物對(duì)對(duì)待檢測(cè)樣品的基因組提取物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)即可。
[0023] 目前分子學(xué)鑒定方法能夠準(zhǔn)確的區(qū)分不同目、科的物種，但對(duì)于同屬的多個(gè)近緣 物種的區(qū)分仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)。本發(fā)明改進(jìn)了傳統(tǒng)的物種特異性PCR，設(shè)計(jì)多套中等特異 性引物，通過(guò)綜合分析幾個(gè)PCR的結(jié)果來(lái)確定物種的身份。由中等特異性引物建立的多個(gè) PCR稱為組合PCR。本發(fā)明建立的組合PCR方法較傳統(tǒng)物種特異性PCR的優(yōu)勢(shì)在于：
[0024] (1)對(duì)序列高度相似的近緣物種設(shè)計(jì)只擴(kuò)增一個(gè)物種的引物是困難的，而組合 PCR對(duì)引物特異性要求較低即允許引物擴(kuò)增幾個(gè)物種，因此，引物設(shè)計(jì)相對(duì)容易，運(yùn)種設(shè)計(jì) 引物的理念，不僅增加了引物的選擇空間降低引物設(shè)計(jì)的難度，而且可W充分利用基因不 同區(qū)域的進(jìn)化差異，使分析更加客觀準(zhǔn)確。
[002引 似傳統(tǒng)物種特異性PCR對(duì)假陰性、假陽(yáng)性結(jié)果很敏感，而組合PCR中個(gè)別PCR結(jié) 果出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果并不會(huì)對(duì)鑒定結(jié)果有本質(zhì)的影響，仍然可W根據(jù)組合PCR的結(jié) 果判斷樣本的疑似身份；
[0026] (3)組合PCR同時(shí)利用了多個(gè)目的片段，從多個(gè)角度反映樣品身份，比傳統(tǒng)的物種 特異性PCR準(zhǔn)確性更高；傳統(tǒng)PCR鑒別物種時(shí)，所需的特異性引物數(shù)量一般等于甚至大于待 區(qū)分物種的數(shù)量，而組合PCR中由于各PCR間交叉效果，其能夠用相對(duì)較少的反應(yīng)鑒別多個(gè) 物種。
[0027]本發(fā)明提供的一種鑒定胡桃木細(xì)小蠢的方法，W第一引物對(duì)、第二引物對(duì)、第立引 物對(duì)和第四引物作為引物，對(duì)待檢測(cè)樣品的基因組提取物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物進(jìn)行檢測(cè)，方便快捷，可靠性高。
[0028]進(jìn)一步地，在所述分子生物學(xué)鑒定前先對(duì)待檢測(cè)樣品進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，確定符合 胡桃木細(xì)小蠢的形態(tài)特征后，再進(jìn)行所述分子生物學(xué)鑒定。
[0029]先采用形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行初步鑒定，其優(yōu)點(diǎn)有：
[0030] (1)誤差?。盒螒B(tài)學(xué)研究直觀，中間環(huán)節(jié)少，造成人為誤差的可能性最小，只要保 持昆蟲(chóng)標(biāo)本的完整性，不同的人可進(jìn)行多次重復(fù)的觀察，必要時(shí)可與模式標(biāo)本對(duì)比，W減少 鑒定錯(cuò)誤；
[0031] (2)發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)數(shù)量巨大，積累文獻(xiàn)資料多：在昆蟲(chóng)分類研究的幾百年里，已經(jīng)采集 了大量的標(biāo)本、命名了大量的模式種，迄今為止已描述的昆蟲(chóng)種類有100萬(wàn)種W上，同時(shí)積 累了大量的文獻(xiàn)資料，培育了很多具有豐富昆蟲(chóng)鑒定經(jīng)驗(yàn)的專家；
[0032] (3)研究方便：需要儀器較少，只需放大鏡和顯微鏡，操作簡(jiǎn)單，對(duì)于絕大多數(shù)具 有明顯的形態(tài)鑒別特征的昆蟲(chóng)，形態(tài)鑒定最直觀、最簡(jiǎn)便；
[0033] (4)鑒定周期短：對(duì)常見(jiàn)和具有明顯的形態(tài)鑒別特征的昆蟲(chóng)，有經(jīng)驗(yàn)的昆蟲(chóng)鑒定 工作者會(huì)在最短的時(shí)間內(nèi)鑒定出結(jié)果。
[0034]同時(shí)，本發(fā)明為了進(jìn)一步確保對(duì)物種鑒定的準(zhǔn)確性，區(qū)分形態(tài)相似的近緣物種，采 用分子生物學(xué)鑒別的方法加W輔助。
[0035]形態(tài)學(xué)鑒定采用現(xiàn)有的胡桃木細(xì)小蠢的形態(tài)特征進(jìn)行。具體形態(tài)學(xué)鑒定特征如