uffer2. 5yL、TaqDNA polymerase(5U/μL) 0· 5μL、MgCl2 (25mM) 1· 5μL、dNTPs(lOmM) 0· 5μL、引物L(fēng)YB-CP20s和 LYB-CP20a各lOpmol，用去離子水補(bǔ)至25yL。
[0069] 反應(yīng)程序：95°C5min;95°C30s，55°C30s，共 25 個(gè)循環(huán)；72°C10min。
[0070] 2、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)
[0071] 采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，具體如下：
[0072] 取5以1^?0?擴(kuò)增產(chǎn)物，采用2%瓊脂糖凝膠，在電壓80-90￥下電泳3〇1^11，凝膠 成像系統(tǒng)下觀察并拍照。根據(jù)目的條帶的大小進(jìn)行結(jié)果判定：若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有大小 約為432bp的目的條帶（序列表的序列3)，則所述待測(cè)樣本中含有或候選含有光慈燕；若 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中不含有大小約為432bp的目的條帶（序列表的序列3)，則所述待測(cè)樣本中 不含有或候選不含有光慈菇。
[0073] 實(shí)施例2、實(shí)施例1制備的用于鑒定光慈菇的試劑盒的特異性
[0074] 實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)的步驟如下：
[0075] 1、取約50mg干燥待測(cè)樣本（光慈菇、毛慈菇、冰球子或金果欖），用CTAB法提取基 因組DNA，待測(cè)樣本的基因組DNA的濃度均在30ng/μl-50ng/μ1之間。
[0076] 2、以步驟1提取的待測(cè)樣本的基因組DNA為模板，以人工合成的LYB-TYls: 5' -AACGGATATCTCGGCTCT-3' 和LYB-TYla:5' -GCAACTTGCGTTCAAAA-3' 為通用引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)待測(cè)樣本的基因組DNA質(zhì)量。
[0077] 反應(yīng)總體系為25μL，包括待測(cè)樣本的基因組DNA0· 5μL、10XPCRBuffer 2. 5yL、TaqDNApolymerase(5U/yL)0. 5yL、MgCl2(25mM)l. 5yL、dNTPs(10mM)0. 5yL、引 物L(fēng)YB-TYls和LYB-TYla各lOpmol，去離子水補(bǔ)至 25μL。
[0078] 反應(yīng)程序：95°C5min;95°C30s，55°C30s，72°C30s，共 25 個(gè)循環(huán)；72°C10min。
[0079] 按照上述步驟，提取光慈菇基因組DNA，并將待測(cè)樣本的基因組DNA替換為等體積 的光慈菇基因組DNA，其它步驟均不變，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，作為陽性對(duì)照。
[0080] 按照上述步驟，將待測(cè)樣本的基因組DNA替換為等體積的滅菌超純水，其它步驟 均不變，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，作為空白對(duì)照。
[0081] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2(泳道Μ為DNA分子標(biāo)準(zhǔn)（DNAMarker，從上到下依次為600、500、 400、300、200和100bp)，泳道1為以光慈菇基因組DNA為模板，泳道2為以毛慈菇基因組 DNA為模板，泳道3為以冰球子基因組DNA為模板，泳道4為以金果欖基因組DNA為模板， 泳道5為以滅菌超純水為模板）。結(jié)果表明，陽性對(duì)照和待測(cè)樣本均能實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增，電泳 顯示含有大小約為432bp的目的條帶；空白對(duì)照不能實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增，電泳顯示不含有大小 約為432bp的目的條帶。將大小約為432bp的目的條帶回收測(cè)序，其序列如序列表中序列 3所示?？梢姶郎y(cè)樣本的基因組DNA質(zhì)量均滿足要求。
[0082] 3、以步驟1提取的待測(cè)樣本的基因組DNA為模板，采用實(shí)施例1步驟一合成的引 物L(fēng)YB-CP20S和引物L(fēng)YB-CP20a組成的引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體的反應(yīng)體系和反應(yīng)程 序同實(shí)施例1步驟三1。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置以滅菌超純水為模板的陰性對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后，按照 實(shí)施例1步驟三2的方法對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行結(jié)果判定。
[0083] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3(泳道Μ為DNA分子標(biāo)準(zhǔn)（DNAMarker，從上到下依次為600、500、 400、300、200和100bp)，泳道1為以光慈菇基因組DNA為模板，泳道2為以毛慈菇基因組 DNA為模板，泳道3為以冰球子基因組DNA為模板，泳道4為以金果欖基因組DNA為模板，泳 道5為以滅菌超純水為模板）。結(jié)果表明，僅光慈菇能夠擴(kuò)增出大小約為432bp的目的條 帶。將大小約為432bp的目的條帶回收測(cè)序，其序列如序列表中序列3所示。這表明實(shí)施 例1制備的用于鑒定光慈菇的試劑盒能夠準(zhǔn)確鑒定光慈菇。
[0084] 實(shí)施例3、實(shí)施例1制備的用于鑒定光慈菇的試劑盒的靈敏度
[0085] 實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)的步驟如下：
[0086] 1、用CTAB法提取光慈菇的基因組DNA，命名為DNAUDNA1中DNA的濃度為43. 2ng/ μL〇
[0087] 2、吸取lmLDNA1加入盛有l(wèi)mL滅菌超純水中的試管中充分混勻，得到DNA2;以此 類推制成DNA3、DNA4、DNA5、DNA6和DNA7,稀釋后各個(gè)梯度的DNA濃度分別為21. 6ng/μL、 10. 8ng/μL、5. 4ng/μL、2. 7ng/μL、1. 35ng/μL和 0· 675ng/μL。
[0088] 3、以步驟1提取的DNA1為模板，以實(shí)施例1步驟一合成的引物L(fēng)YB-CP20s和引物 LYB-CP20a為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。具體的反應(yīng)程序同實(shí)施例1步驟三 1〇
[0089] 反應(yīng)總體系為 25μL，包括DNA10. 5μL、10XPCRBuffer2. 5μL、TaqDNA polymerase(5U/μL) 0· 5μL、MgCl2 (25mM) 1· 5μL、dNTPs(lOmM) 0· 5μL、引物L(fēng)YB-TYls和 LYB-TYla各lOpmol，去離子水補(bǔ)至25yL。
[0090] 按照上述方法，將DNA1分別替換為步驟2制備的DNA2、DNA3、DNA4、DNA5、DNA6和 DNA7,其它步驟均不變，得到相應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0091] 反應(yīng)結(jié)束后，按照實(shí)施例1步驟三2的方法進(jìn)行結(jié)果判定。
[0092] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4中左上圖（泳道Μ為DNA分子標(biāo)準(zhǔn)（DNAMarker，從上到下依次為 600、500、400、300、200和100bp)，泳道1為以DNA1為模板，泳道2為以DNA2為模板，泳道3 為以DNA3為模板，泳道4為以DNA4為模板，泳道5為以DNA5為模板，泳道6為以DNA6為 模板，泳道7為以DNA7為模板）。結(jié)果表明，以DNA1、DNA2或DNA3為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增均 獲得大小約為432bp的目的條帶，而以DNA4、DNA5、DNA6和DNA7為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增均不 能獲得大小約為432bp的目的條帶。表明，本發(fā)明提供的試劑盒對(duì)光慈菇基因組DNA的最 小檢測(cè)限為5. 4ng。
[0093]按照上述步驟1至3的方法，將光慈菇分別替換為毛慈菇、冰球子和金果欖，其它 步驟均不變，得到相應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果依次見圖4中的右上圖（泳道Μ為DNA 分子標(biāo)準(zhǔn)（DNAMarker，從上到下依次為600、500、400、300、200和100bp)，泳道8至泳道 14 中毛慈菇的基因組DNA的濃度依次為 43. 2ng/μL，21. 6ng/μL、10. 8ng/μL、5. 4ng/μL、 2. 7ng/μL、L35ng/μL和(λ675ng/yL)、圖4中的左下圖（泳道M為DNA分子標(biāo)準(zhǔn)（DNA Marker，從上到下依次為600、500、400、300、200和100bp)，泳道15至泳道21中冰球子的 基因組DNA的濃度依次為 43. 2ng/yL，21. 6ng/yL、10. 8ng/yL、5. 4ng/yL、2. 7ng/yL、 1. 35ng/μL和(λ675ng/μL)和圖4中的右下圖（泳道M為DNA分子標(biāo)準(zhǔn)（DNAMarker，從 上到下依次為600、500、400、300、200和100bp)，泳道22至泳道28中金果欖的基因組DNA 的濃度依次為 43. 2ng/yL，21. 6ng/yL、10. 8ng/yL、5. 4ng/yL、2. 7ng/yL、l. 35ng/yL 和0. 675ng/μL)。結(jié)果表明，均不能獲得大小約為432bp的目的條帶。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于鑒定光慈菇或老鴉瓣的引物對(duì)，由引物L(fēng)YB-CP20S和引物L(fēng)YB-CP20a組成，各條 引物均為單鏈DNA分子，核苷酸序列依次為序列表中的序列1和序列2。2. 權(quán)利要求1所述引物對(duì)的應(yīng)用，為如下al)_al2)中任一種： al)制備用于檢測(cè)或輔助檢測(cè)光慈菇的試劑盒； a2)檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有或候選含有光慈菇； a3)制備用于鑒定或輔助鑒定光慈菇的試劑盒； a4)鑒定或輔助鑒定待測(cè)樣品是否為或候選為光慈菇； a5)制備用于鑒定或輔助鑒定市售光慈菇的真?zhèn)涡缘脑噭┖校? a6)鑒定或輔助鑒定市售光慈菇的真?zhèn)涡裕? a7)制備用于檢測(cè)或輔助檢測(cè)老鴉瓣的試劑盒； a8)檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有或候選含有老鴉瓣； a9)制備用于鑒定或輔助鑒定老鴉瓣的試劑盒； alO)鑒定或輔助鑒定待測(cè)樣品是否為或候選為老鴉瓣； all)制備用于鑒定或輔助鑒定市售老鴉瓣的真?zhèn)涡缘脑噭┖校? al2)鑒定或輔助鑒定市售老鴉瓣的真?zhèn)涡浴?. 含有權(quán)利要求1所述引物對(duì)的試劑盒；所述試劑盒用于鑒定光慈菇或老鴉瓣。4. 權(quán)利要求3所述的試劑盒的制備方法，包括將權(quán)利要求1中所述引物L(fēng)YB-CP20S和 所述引物L(fēng)YB-CP20a分別單獨(dú)包裝的步驟。5. 權(quán)利要求3所述試劑盒的應(yīng)用，為如下bl)或b2)或b3): bl)檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有或候選含有光慈菇或老鴉瓣；b2)鑒定或輔助鑒定待測(cè)樣品是否為或候選為光慈菇或老鴉瓣； b3)鑒定或輔助鑒定市售光慈菇或老鴉瓣的真?zhèn)涡浴?. -種檢測(cè)待測(cè)樣品是否含有或候選含有光慈菇的方法，包括如下步驟： 提取待測(cè)樣品的總DNA，采用權(quán)利要求1所述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果能夠?qū)崿F(xiàn)有效 擴(kuò)增，則所述待測(cè)樣品中含有或候選含有光慈菇；如果不能實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增，則所述待測(cè)樣品 中不含有或候選不含有光慈菇。7. -種鑒定待測(cè)樣品是否為或候選為光慈菇的方法，包括如下步驟： 提取待測(cè)樣品的基因組DNA，采用權(quán)利要求1所述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果能夠?qū)崿F(xiàn) 有效擴(kuò)增，則所述待測(cè)樣品為或候選為光慈菇；如果不能實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增，則所述待測(cè)樣品不 為或候選不為光慈燕。8. 如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述待測(cè)樣品為中藥材，或，所述中藥 材的基源植物，或，取自所述中藥材的基源植物的組織或器官。9. 一種鑒定市售光慈菇的真?zhèn)涡缘姆椒?，包括如下步驟： 提取市售光慈菇的基因組DNA，采用權(quán)利要求1所述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果能夠?qū)?現(xiàn)有效擴(kuò)增，則所述市售光慈菇為或候選為真品；如果不能實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增，則所述市售光慈 菇為或候選為偽品。10. -種鑒定市售老鴉瓣的真?zhèn)涡缘姆椒?，包括如下步驟： 提取市售老鴉瓣的基因組DNA，采用權(quán)利要求1所述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果能夠?qū)?現(xiàn)有效擴(kuò)增，則所述市售老鴉瓣為或候選為真品；如果不能實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增，則所述市售老鴉 瓣為或候選為偽品。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒定光慈菇的方法及其專用引物對(duì)。本發(fā)明所提供的引物對(duì)，由引物L(fēng)YB-CP20s和引物L(fēng)YB-CP20a組成，引物L(fēng)YB-CP20s和引物L(fēng)YB-CP20a均為單鏈DNA分子，核苷酸序列依次為序列表中的序列1和序列2。利用引物L(fēng)YB-CP20s和引物L(fēng)YB-CP20a對(duì)待測(cè)樣品的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果能夠?qū)崿F(xiàn)有效擴(kuò)增，則所述待測(cè)樣品中含有或候選含有光慈菇；如果不能實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增，則所述待測(cè)樣品中不含有或候選不含有光慈菇。實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明提供的鑒定光慈菇的方法能夠快捷而簡(jiǎn)便的鑒定光慈菇，以保障光慈菇臨床用藥的安全，具有重大的推廣前景和應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號(hào)】CN105274243
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510815696
【發(fā)明人】黃璐琦, 袁媛, 趙群, 趙玉洋
【申請(qǐng)人】中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所
【公開日】2016年1月27日
【申請(qǐng)日】2015年11月23日