一種耐高溫產聚羥基丁酸酯細菌的分離篩選方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術，具體是一種耐高溫產聚羥基丁酸酯細菌(PHB)的分離篩選方法。
【背景技術】
[0002]聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxybutyrate，PHB)是一種細胞內聚酯，具有生物降解性，為生物可降解塑料的新型高分子材料。
[0003]目前PHB的生產方法有微生物合成和轉基因植物合成；轉基因植物合成PHB降低生產成本尚未成功；利用微生物合成PHB的生產成本相對較高，主要是由于高的發(fā)酵底物價格及提取純化費用。
[0004]工業(yè)上主要采用兩步法培養(yǎng)微生物(有氧/富氮和貧氧/貧氮)來獲得PHB，控制氧含量的方法為單純的氧濃度控制(主要是灌注純氮)在成本、設備、工藝上要求很高。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是要提供一種耐高溫、產聚羥基丁酸酯(PHB)多的細菌分離篩選方法。
[0006]本發(fā)明耐高溫產聚羥基丁酸酯細菌的分離篩選方法，是采用梯度增溫分離方法篩選得到的，其方法包括如下步驟:
(1)采集土壤樣品:采集地表以下5cm處的土壤為樣品；
(2)樣品預處理:取上述土壤樣品裝入已滅菌并盛裝有無菌水的容器中，密封后劇烈震搖lOmin，靜置懸浮液，取上清液離心2min后，取上層菌液為菌懸液，備用；
(3)擴大培養(yǎng):分別取菌懸液10μ L接種于250mL LB培養(yǎng)液中，置于37°C恒溫箱中培養(yǎng)震蕩72h，得擴大菌種培養(yǎng)液；
(4)逐級梯升溫階篩選:取10μ L擴大菌種培養(yǎng)液接種于250mL LB培養(yǎng)液中，按溫度逐級遞升進行培養(yǎng)，即后一溫階所用接種菌液取自前一溫階培養(yǎng)的菌液；
(5)選定耐高溫菌群:在培養(yǎng)溫度下，觀察接種菌液后的LB培養(yǎng)液，如出現(xiàn)渾濁，則判定該菌可在此溫度下生長，反之則排除；
(6)選定耐高溫菌株:取耐50°C以上的菌液，以生理鹽水稀釋(106)，并均勻涂布于富氮培養(yǎng)基內，37°C培養(yǎng)48h ;挑取有不同形態(tài)特征的單菌落，于37°C富氮培養(yǎng)基上分別擴繁后，以完全營養(yǎng)液體培養(yǎng)基加20%甘油混勻，于-80°C條件下保存；
(7)采用尼羅藍染色法，分別取耐50°C以上具不同形態(tài)特征的單菌落，接種于LB培養(yǎng)基培養(yǎng)12h ;步驟(6)的耐高溫菌株經適當擴繁后稀釋(10 6)涂布篩選培養(yǎng)基，于30°C條件下培養(yǎng)36h后，在365nm紫外燈照射下呈橘粉色菌落，即產PHB高的菌株，目標菌株再以富氮培養(yǎng)基37°C擴繁后，以完全營養(yǎng)液體培養(yǎng)基加20%甘油混勻，于-80°C條件下保存，得耐高溫、產PHB高的菌群。
[0007]步驟(3)所述的培養(yǎng)震蕩的震蕩頻率為100r/min。
[0008]所述富氮培養(yǎng)基由酵母浸粉10g/L，蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，硫酸銨5g/L加蒸懼水定容至1L制成。
[0009]本發(fā)明分離篩選得到的耐高溫產聚羥基丁酸酯細菌，屬蠟樣芽胞桿菌，革蘭氏陽性，于2014年5月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址:中國?武漢?武漢大學)，保藏號為CCTCC NO:M 2014179。該菌株形態(tài)特征為:短桿狀，長1~1.5 μ m。
[0010]經檢測，該耐高溫產PHB細菌可以耐受60°C的高溫，且產PHB的產率高，，且最適生長溫度為55°C，其合成PHB的最高產率為2.276g/L，最適生長pH值為7-7.5。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)點是:由于該耐高溫產PHB細菌可以耐受60°C的高溫，因而可以很方便地通過控制溫度進而控制氧濃度，降低生產工藝和設備要求；可以在很簡單的發(fā)酵設備(如無防雜菌污染裝置)中，利用高有機質含量的蔗糖、木薯工業(yè)廢水作為碳源生長和合成PHB,降低設備投入及發(fā)酵底物成本；還可以通過提高溫度殺死其他非耐高溫細菌，從而保證目標菌體單一性，并提高其生物量和所提取的PHB純度。
【附圖說明】
[0012]圖1為GXNUHT-PHB-1菌落自然光下形態(tài)圖；
圖2為GXNUHT-PHB-1菌落尼羅藍染色自然光下形態(tài)圖；
圖3為GXNUHT-PHB-1菌落尼羅藍染色紫外光下形態(tài)圖；
圖4為GXNUHT-PHB-1革蘭氏染色顯微鏡觀察圖；
圖5為基于16S rRNA基因序列以Neighbor-Joining法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹；
圖6為GXNUHT-PHB-1胞內PHB的紅外光譜圖；
圖 7 為 GXNUHT-PHB-1 產物的 1H-NMR 圖；
圖 8 為 GXNUHT-PHB-1 產物的 1C-NMR 圖。
【具體實施方式】
[0013]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的闡述，但不是對本
【發(fā)明內容】
的限定。
[0014]本發(fā)明耐高溫產聚羥基丁酸酯細菌是采用梯度增溫分離方法篩選得到的，屬蠟樣芽胞桿菌，革蘭氏陽性，于2014年5月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號為CCTCC Μ 2014179。該菌株形態(tài)特征為:短桿狀，長1~1.5 μ m。
[0015]實施例:
本發(fā)明耐高溫產聚羥基丁酸酯細菌的篩選方法，包括如下步驟:
(1)采集土壤樣品:
采樣區(qū)域:①北方(天津、山東)、②南方(廣西、廣東)。
[0016]土壤類型:果園、花園、菜園、田地、山丘、河邊、居民區(qū)和工業(yè)區(qū)。
[0017]樣地設置和采樣:在各種土壤類型區(qū)域劃定面積為100 m2的正方形為樣地，以對角線交叉點為圓心的一半對角線長度為半徑畫圓圈，圓圈與對角線交叉點為采樣點。采集各點地表以下5 cm處土壤為樣品，每份樣品1千克，每個樣地4份樣品，共32份；
(2)樣品預處理:
分別取10 g樣品裝入已滅菌并盛有90 mL無菌水的玻璃瓶中，將其編號并密封后，劇烈震搖10 min。靜置懸浮液，待分層后取上層液體離心(4500 r/min，2 min)，取出離心后的上層菌液備用；
(3)擴大培養(yǎng):分別取菌懸液10μ L接種于250 mL LB培養(yǎng)液中，置于37°C恒溫箱培養(yǎng)震蕩(100 r/min)培養(yǎng)72 h，獲得擴大菌種培養(yǎng)液；
(4)逐級梯升溫階篩選:取10μ L擴大菌種培養(yǎng)液接種于250 mL LB培養(yǎng)液中，按溫度逐級遞升(37°C— 4(TC— 45°C— 5(TC— 55°C— 6(TC— 65°C— 7(TC— 75°C— 80。0 進行培養(yǎng)；其中，后一溫階所用接種菌液取自前一溫階培養(yǎng)的菌液，接種量為10μ L ;
(5)選定耐高溫菌群:若在某培養(yǎng)溫度下，接種菌液后的LB培養(yǎng)液出現(xiàn)渾濁，則可判定該菌可在此溫度生長，反之則可排除此編號土壤樣品；
(6)選定耐高溫菌株:取耐50°C以上菌液以生理鹽水稀釋(106)并均勻涂布于富氮培養(yǎng)基內，37°C培養(yǎng)48 h ;挑取有不同外形特征的單菌落，于37°C富氮培養(yǎng)基上分別擴繁后，以完全營養(yǎng)液體培養(yǎng)基加20%甘油與_80°C保存；
(7)采用尼羅藍染色法，分別接種耐50°C以上具不同形態(tài)特征的單菌落于LB培養(yǎng)基溫度培養(yǎng)12 h ;耐高溫菌株經適當擴繁后稀釋(10 6)涂布篩選培養(yǎng)基，30°C條件下培養(yǎng)36 h后，在365 nm紫外燈照射下呈橘粉色菌落為產PHB菌株。目標菌株以富氮培養(yǎng)基37°C擴繁后，以完全營養(yǎng)液體培養(yǎng)基加20%甘油-80°C保存。
[0018]本耐熱產PHB菌可以在30?60°C條件下，利用富氮培養(yǎng)基:酵母浸粉10g/L，蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，硫酸銨5g/L，加蒸餾水至1000 mL，進行擴繁。
[0019]經檢測:與傳統(tǒng)產PHB且最高耐受45°C的細菌相比，本耐熱產PHB菌可耐受60°C高溫，具體是:
耐熱產PHB菌(1號)16S rRNA基因部分序列(515 bp)
GTCGATCTACTGCCTAGGTACAGTACAGGTGCCAGCTTCATCTGCAGATCATAGCACTTGTTCTTCCCTAAC
AACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGAT
TCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTA
CGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGACGCGGGTCCATCCATAAGTGACAGCCGAA
GCCGCCTTTCAATTTCGAACCATGCGGTTCAAAATGTTATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTC
TTATGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACTTCATAAGAGCAAGCTCTTAATCCATTCGCTC
GACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCATCCTGAGCCATATCCAAAACTCTA
Bacillus cereus strain 2012BaDB20 16S ribosomal RNA gene (JX041915.1)
堿基數1507
基因序列
TAGAGTTTGGATCATGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTA
AGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTC
CGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTT
ATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGA
GGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGG
ACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACA
AGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCC