腫瘤標(biāo)志物dmbx1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及腫瘤標(biāo)志物，具體設(shè)及腫瘤標(biāo)志物DMBX1及其應(yīng)用，更具體的設(shè)及腫 瘤標(biāo)志物DMBX1基因及其表達(dá)產(chǎn)物在診治煩內(nèi)動(dòng)脈瘤中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】 W〇2] 煩內(nèi)動(dòng)脈瘤（intracranialaneirrysm，ΙΑ)是動(dòng)脈管壁病理性局限性擴(kuò)張 產(chǎn)生的腦血管瘤樣突起，其破裂是引起人類自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血的首位原因（約占 79% -89% )，占煩內(nèi)出血的25%，其病死率及致殘率極高，嚴(yán)重影響著人們的健康和生命。 隨著影像技術(shù)的發(fā)展和人們健康認(rèn)識(shí)水平的提高，未破裂動(dòng)脈瘤的發(fā)現(xiàn)率也有所增加，煩 內(nèi)動(dòng)脈瘤己經(jīng)是常見(jiàn)和多發(fā)的腦血管病之一。通過(guò)百余年的研究與實(shí)踐，對(duì)煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的 發(fā)生、生長(zhǎng)、塑形、破裂的確切機(jī)制仍不明了。通常認(rèn)為ΙΑ的形成、發(fā)展和破裂是由遺傳、吸 煙、年齡、環(huán)境、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和高血脂W及血流動(dòng)力學(xué)改變等多重因素造成的。隨 著對(duì)其研究的不斷深入，人們己經(jīng)逐漸認(rèn)識(shí)到ΙΑ通常多發(fā)生在Willis動(dòng)脈環(huán)W及煩內(nèi)動(dòng) 脈血管分叉處或血管彎曲部位，血液流經(jīng)此處時(shí)形成沖擊流等復(fù)雜流型使血管內(nèi)皮細(xì)胞及 其連接受損，炎癥細(xì)胞和炎性物質(zhì)等更易進(jìn)入內(nèi)皮下，引起的血管壁炎癥和血管壁重構(gòu)失 調(diào)，研究顯示持續(xù)的血流動(dòng)力學(xué)變化會(huì)導(dǎo)致血管的病理重構(gòu)，包括內(nèi)彈力層的降解、平滑肌 細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的缺失、細(xì)胞增殖減少等。IA的形成可能是煩內(nèi)相關(guān)動(dòng)脈內(nèi)皮組織損傷與 修復(fù)失衡的結(jié)果，但具體哪些基因參與其中仍有待研究掲示。
[0003] 發(fā)明人基于高通量測(cè)序?qū)?例煩內(nèi)動(dòng)脈瘤壁組織和3例進(jìn)行分析，在差異表達(dá)基 因中挑選出顯著高表達(dá)的候選基因DMBX1，現(xiàn)有研究表明DMBX1調(diào)控粒細(xì)胞和巨隧細(xì)胞的 增殖和分化，但并沒(méi)有研究掲示其與煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的關(guān)系，發(fā)明人進(jìn)行了RT-PCR驗(yàn)證和細(xì)胞 驗(yàn)證，證實(shí)了DMBX1在煩內(nèi)動(dòng)脈瘤組中高表達(dá)，干擾DMBX1基因的表達(dá)會(huì)影響EPCs的活性。 本發(fā)明提供了一種煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的診治祀點(diǎn)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種煩內(nèi)動(dòng)脈瘤診斷制劑，所述煩內(nèi)動(dòng)脈瘤診斷制劑檢測(cè) DMBX1基因和/或DMBX1基因表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)量。 陽(yáng)0化]進(jìn)一步，所述煩內(nèi)動(dòng)脈瘤診斷制劑采用巧光定量PCR試劑盒、基因忍片、免疫方法 檢測(cè)煩內(nèi)動(dòng)脈瘤組織中DMBX1基因的表達(dá)，優(yōu)選的，所述的巧光定量PCR試劑盒中含有一對(duì) 特異性擴(kuò)增DMBX1基因的引物；所述的基因忍片中包括與DMBX1基因的核酸序列雜交的探 針，更優(yōu)選的，巧光定量PCR試劑盒內(nèi)含有特異性檢測(cè)DMBX1基因的上游引物和下游引物， 上游引物序列為SEQIDNO. 10,下游引物序列為SEQIDNO. 11。
[0006] 進(jìn)一步，檢測(cè)外周血和/或組織中DMBXl基因和/或基因的表達(dá)產(chǎn)物。
[0007] 進(jìn)一步，所述的煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的診斷制劑采用免疫方法檢測(cè)煩內(nèi)動(dòng)脈瘤外周血和/ 或組織中DMBX1基因的表達(dá)產(chǎn)物，優(yōu)選的，所述免疫方法為化ISA檢測(cè)和/或膠體金檢測(cè)。
[0008] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)DMBX1表達(dá)產(chǎn)物的化ISA法為使用ELISA檢測(cè)試劑盒。所述試 劑盒中的抗體可采用市售的DMBXl單克隆抗體。進(jìn)一步，所述的試劑盒包括：包被DMBXl單 克隆抗體的固相載體，酶標(biāo)抗體，酶的底物，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對(duì)照品，稀釋液，洗涂液，酶反 應(yīng)終止液等。
[0009] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)DMBXl蛋白的膠體金法為使用檢測(cè)試劑盒，所述的抗體可采用 市售的DMBXl單克隆抗體。進(jìn)一步，所述的膠體金檢測(cè)試劑盒采用膠體金免疫層析技術(shù)或 膠體金滲濾法。進(jìn)一步，所述的膠體金檢測(cè)試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測(cè)區(qū)燈）噴點(diǎn)有抗 DMBXl單克隆抗體、質(zhì)控區(qū)（C)噴點(diǎn)有免疫球蛋白IgG。
[0010] 本發(fā)明的目的在于提供上述煩內(nèi)動(dòng)脈瘤診斷制劑在制備煩內(nèi)動(dòng)脈瘤診斷工具中 的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的目的在于提供一種治療煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的制劑，所述制劑中含有抑制DMBXl 基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的試劑或化合物。優(yōu)選的，制劑中含有藥劑學(xué)可接受的載體。
[0012] 進(jìn)一步，所述治療煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的制劑中含有激活DMBXl的抑制基因、激活抑制 DMBXl表達(dá)的蛋白、導(dǎo)入抑制DMBXl轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的siRNA、激活促進(jìn)DMBXlmRNA降解的 microRNA、導(dǎo)入促進(jìn)DMBXl蛋白降解的分子、抑制促進(jìn)DMBXl表達(dá)的因子及蛋白的表達(dá)。
[0013] 優(yōu)選的，所述治療煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的制劑含有抑制DMBXl基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的siRNA。 優(yōu)選的，針對(duì)DMBXl基因的SEQIDNO. 1和/或SEQIDNO. 4和/或SEQIDNO. 7位點(diǎn)設(shè)計(jì) siRNA。更優(yōu)選的，抑制DMBXl基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的siRNA選自下列中的一組或幾組siRNA: 沈QIDNO. 2 和沈QIDNO. 3、SEQIDNO. 5 和沈QIDNO. 6、SEQIDNO. 8 和沈QIDNO. 9。 更優(yōu)選的，所述治療煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的制劑含有SiRNA序列為SEQIDNO. 2和SEQIDNO. 3。
[0014] 本發(fā)明的目的在于提供上述治療煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的制劑在制備煩內(nèi)動(dòng)脈瘤治療藥物 或試劑中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明的目的在于提供上述治療煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的制劑在制備增強(qiáng)EPCs活性制劑中 的應(yīng)用。
[0016] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先通過(guò)高通量測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)方法篩選到候選 基因DMBXl基因，進(jìn)而通過(guò)分子細(xì)胞生物學(xué)方法驗(yàn)證了DMBXl基因與煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的關(guān)系： DMBXl基因在煩內(nèi)動(dòng)脈瘤組織中高表達(dá)，與煩內(nèi)動(dòng)脈瘤具有很好的相關(guān)性，可用于制備煩內(nèi) 動(dòng)脈瘤輔助診斷制劑，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0017] 本領(lǐng)域人員熟知抑制基因及其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)通?？蒞采用下述方法中的一種 和/或幾種：通過(guò)激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表達(dá)的蛋白、采用 RNA干擾技術(shù)抑制目的基因表達(dá)、激活促進(jìn)目的基因mRNA降解的microRNA、導(dǎo)入促進(jìn)目的 基因編碼蛋白降解的分子、抑制促進(jìn)目的基因表達(dá)的因子及蛋白的表達(dá)。 陽(yáng)01引 RNA干擾（RNAi)是指外源性和內(nèi)源性雙鏈RNA在生物體內(nèi)誘導(dǎo)同源祀基因的 mRNA特異性降解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象，是一種使用小的雙鏈RNA高效、特異地阻斷 體內(nèi)某種特定基因的表達(dá)，促使mRNA降解，使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失表型的技術(shù)。SiRNA 設(shè)計(jì)完成后可W采用直接合成法或者構(gòu)建SiRNA表達(dá)載體，制備好的SiRNA可W通過(guò)憐酸 巧共沉淀法、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、顯微注射或基因槍等機(jī)械法、陽(yáng)離子 脂質(zhì)體試劑法等途徑轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
[0019] 巧光定量PCR法是通過(guò)巧光染料或巧光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo) 記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可W對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板 的初始濃度。巧光定量PCR的出現(xiàn)，極大地簡(jiǎn)化了定量檢測(cè)的過(guò)程，而且真正實(shí)現(xiàn)了絕對(duì)定 量。多種檢測(cè)系統(tǒng)的出現(xiàn)，使實(shí)驗(yàn)的選擇性更強(qiáng)。自動(dòng)化操作提高了工作效率，反應(yīng)快速、 重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果清晰。
[0020] 基因忍片又稱為DNA微陣列值NAmicroarray)，可分為Ξ種主要類型：1)固定在 聚合物基片（尼龍膜，硝酸纖維膜等）表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標(biāo)記 的祀基因與其雜交，通過(guò)放射顯影技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。2)用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的DNA探針 陣列，通過(guò)與巧光標(biāo)記的祀基因雜交進(jìn)行檢測(cè)。3)在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核巧 酸探針陣列，與巧光標(biāo)記的祀基因雜交進(jìn)行檢測(cè)?；蛉唐鳛橐环N先進(jìn)的、大規(guī)模、高通 量檢測(cè)技術(shù)，應(yīng)用于疾病的診斷，其優(yōu)點(diǎn)有W下幾個(gè)方面：一是高度的靈敏性和準(zhǔn)確性；二 是快速簡(jiǎn)便；Ξ是可同時(shí)檢測(cè)多種疾病。
[0021] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的基因檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒檢測(cè) 基因DMBX1，采用特異的上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQIDNO. 10,下游引物序 列為沈QIDNO. 11。
[0022] 進(jìn)一步，該P(yáng)CR試劑盒適合于目前存在市場(chǎng)上的所有類型巧光定量基因擴(kuò)增儀， 靈敏度高，定量快速準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好，具有良好的應(yīng)用前景。
[0023] 進(jìn)一步，上述巧光定量PCR試劑盒組分包括：特異性引物、內(nèi)參引物、巧光定量PCR 反應(yīng)液。所述內(nèi)參為GAPDH。
[0024] 所述的試劑盒還包含RNA抽提試劑。
[00巧]本發(fā)明目的是提供了一種煩內(nèi)動(dòng)脈瘤蛋白檢測(cè)試劑盒，所述的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)DMBX1蛋白。進(jìn)一步的，所述的試劑盒還包括其他檢測(cè)試劑。
[00%] 本發(fā)明目的是提供了一種檢測(cè)煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的基因忍片，所述的基因忍片包括與 DMBX1基因的核酸序列雜交的探針。
[0027] 本發(fā)明的藥劑學(xué)上可接受的載體為在制劑時(shí)通常利用的載體，該載體包含乳糖 (lactose)、右旋糖（dextrose)、薦糖（sucrose)、山梨醇（sorbitol)、甘露醇（mannitol)、 淀粉、阿拉伯橡膠、憐酸巧、藻酸鹽（alginate)、凝膠（gelatin)、娃酸巧、微晶纖維素、聚乙 締化咯燒酬（P〇lyvin}dpy;r;rolidone)、纖維素（cellulose)、水、糖漿、甲基纖維素（methyl cellulose)、徑基苯甲酸甲醋（methylhy化oxybenzoate)、丙基徑基苯甲酸丙醋（propyl hy化oxybenzoate)、滑石、硬脂酸儀（stearicacidma即esium)及礦物油（mineraloil) 等，但并非局限于此。
[0028] 本發(fā)明的藥劑學(xué)可接受的載體除了上述成分W外還可W包含潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、甜 味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑等。藥劑學(xué)上許可的適合的載體和制劑詳細(xì)記載于雷 明登氏藥學(xué)全書(shū)。
[0029] 本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物能通過(guò)口服或非口服進(jìn)行給藥，作為非口服給藥時(shí)，能通 過(guò)靜脈內(nèi)注射，鼻腔內(nèi)注射，局部注射，腦室內(nèi)注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，經(jīng)皮 給藥等方式進(jìn)行給藥。
[0030] 本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的適合的給藥劑量根據(jù)制劑化方法、給藥方式、患者的年 齡、體重、性別、病態(tài)、食物、給藥時(shí)間、給藥途徑、排泄速度及反應(yīng)靈敏性之類的因素而可W 進(jìn)行多種處方，通常，熟練的醫(yī)生能夠容易地決定及處方對(duì)所希望的治療或預(yù)防有效的給 藥劑量。