專利名稱：一種腫瘤標(biāo)志物cd25自身抗體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，是一種用于制備腫瘤早期診斷試劑和開發(fā)治療腫瘤的靶向藥物。
背景技術(shù)：
大量研究表明，血清或血漿中的腫瘤相關(guān)抗原能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生自身抗體，在腫瘤患者血清中既存在腫瘤抗原，也存在針對該腫瘤抗原的自身抗體。因此，既可以利用抗體檢測腫瘤抗原，也可以利用抗原檢測腫瘤自身抗體，但利用腫瘤自身抗體檢測腫瘤的特異性和敏感性均比利用腫瘤抗原檢測腫瘤要高得多。很多腫瘤相關(guān)抗原不僅在腫瘤患者體內(nèi)存在，在正常人體內(nèi)也存在，因此檢測腫瘤相關(guān)抗原作為診斷依據(jù)可信性差。而自身抗體在正常人體內(nèi)含量很低檢測不到或根本不存在，若體內(nèi)自身抗體水平明顯增高，則表明體內(nèi)存在異常免疫情況，表明體內(nèi)相關(guān)抗原水平發(fā)生波動，預(yù)示疾病的存在或原有疾病加重。近年來的研究表明，在惡性腫瘤體積發(fā)展到可用現(xiàn)代影像學(xué)技術(shù)檢出之前3-5 年，患者血中可出現(xiàn)高濃度的腫瘤相關(guān)抗原自身抗體。因此,檢測血中腫瘤相關(guān)抗原自身抗體具有預(yù)測腫瘤發(fā)病風(fēng)險和早期診斷腫瘤的重要價值。是腫瘤臨床診斷領(lǐng)域的重點發(fā)展方向之一。在國外已有診斷肺癌和乳腺癌的早期診斷試劑盒市售。然而，目前所報道的抗體檢測方法敏感度低，特異性差，假陰性比率可高達50%以上。其主要原因是由于每一種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體在患者中的陽性檢測率平均在10%左右。如何提高診斷試劑敏感度是當(dāng)前需要亟待解決的關(guān)鍵問題。比較行之有效的方法是尋找新的可充當(dāng)腫瘤標(biāo)志物的自身抗體，然后與現(xiàn)有已知的自身抗體組合成具有敏感度高和特異性強的診斷試劑盒。腫瘤可通過各種直接或間接的機制來逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)控。一系列的研究已經(jīng)證明，調(diào)節(jié)性Treg細胞與腫瘤免疫逃避機制密切相關(guān)。在肺癌、乳腺癌、卵巢癌以及出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的黑色素瘤患者的外周血淋巴細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞中，存在Treg細胞比例增高現(xiàn)象。Treg通過細胞與細胞直接接觸或通過細胞因子的釋放，對效應(yīng)性CD4+/CD8+T 細胞活化和增殖發(fā)揮抑制作用。其效應(yīng)機制主要是抑制CD4+T細胞增生、抑制腫瘤特異性抗原激活的⑶4+效應(yīng)細胞分泌IL-2，抑制⑶8+IFN 2C和TNF2A產(chǎn)生，并在腫瘤微環(huán)境中能限制CTLs細胞毒性顆粒釋放，使腫瘤細胞逃逸免疫殺傷。本發(fā)明中的CD25是Treg細胞的主要表面標(biāo)志物。調(diào)節(jié)性Treg細胞是來源于胸腺的⑶4+T細胞，其組成性表達的IL 2受體的α鏈被命名為⑶25，⑶25是Treg細胞活化的重要標(biāo)志。⑶25作為I型跨膜蛋白對多種T細胞和B細胞活化亦發(fā)揮關(guān)鍵作用。CD25與CD122共同組成高親和力的IL 2受體，它們可溶性受體即SIL-2R被證實與多種腫瘤發(fā)生相關(guān)，已成為幾種腫瘤發(fā)生進展的臨床標(biāo)志物。 國內(nèi)外研究顯示，在⑶4+/⑶25+Τ細胞中，只有⑶4+/⑶25hight細胞才是具有免疫抑制功能的Tregs。同時研究發(fā)現(xiàn)肺癌、卵巢癌、胃腸道腫瘤等多種腫瘤患者外周血和腫瘤局部 Tregs增加。Tregs通過抑制活化的T細胞，限制免疫反應(yīng)的發(fā)生，從而在維持腫瘤免疫耐受中發(fā)揮重要作用。動物實驗已證實，給荷瘤小鼠應(yīng)用抗CD25單抗可抑制動物體內(nèi)Tregs，可提高小鼠抗腫瘤免疫功能。體外實驗證實從外周血中去除Tregs，可以產(chǎn)生更多的細胞毒細胞，包括CTL和LAK/NK細胞等。最新研究發(fā)現(xiàn)，在腦膠質(zhì)瘤患者中隨疾病進程，CM+/ F0XP3+Tregs細胞時間依賴性增加的同時伴隨⑶25的高度表達，而應(yīng)用抗⑶25單抗可顯著抑制⑶4+/FOXP3+Tregs細胞的增加。本發(fā)明通過自行設(shè)計的⑶25的抗原表位多肽，檢測腫瘤患者血清及血漿中自身抗體水平并開發(fā)相應(yīng)的試劑，預(yù)測腫瘤發(fā)生的危險性，并為腫瘤新藥研究提供可靠的數(shù)據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是公開一種腫瘤標(biāo)志物CD25自身抗體。本發(fā)明同時公開了⑶25自身抗體的用途。本發(fā)明提供的一種腫瘤標(biāo)志物CD25自身抗體的氨基酸序列為EIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVE 純度> 95 %，pH > 7. O。本發(fā)明所述的CD25抗原多肽在制備預(yù)測腫瘤早期診斷試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明利用自行設(shè)計的CD25蛋白的線性多肽，采用ELISA法檢測肺癌和食管癌患者血清及血漿中抗CD25蛋白的特異性自身IgG抗體。自身IgG抗體水平升高表明腫瘤患者體內(nèi)CD25蛋白的表達量增加，預(yù)示患者可能出現(xiàn)原發(fā)性或繼發(fā)性腫瘤，可以預(yù)測腫瘤發(fā)生與復(fù)發(fā)的危險性，指導(dǎo)臨床醫(yī)生對腫瘤的早期診斷。⑶25蛋白質(zhì)氨基酸序列見Tab. ITab. I 0)25抗原多肽序列表
縮寫 CD25 ETYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVE 純度 >95%, pH>7.0抗原抗體的結(jié)合實際上只發(fā)生在抗原決定簇和抗體的抗原結(jié)合位點之間，兩者在空間結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上完全互補。因此抗原決定簇就可以代表整個蛋白與抗體結(jié)合的狀態(tài)與親和特性。另外，以重組蛋白為抗原，要經(jīng)過載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、表達、篩選、純化等繁瑣的過程，蛋白空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，抗原表位不易暴露，因此抗原抗體結(jié)合的特異性差。另外，ELISA法的高靈敏性對純化技術(shù)的穩(wěn)定性要求極高，成本昂貴。發(fā)明人遵循以下原則設(shè)計線性多肽抗原①選擇細胞膜蛋白表面區(qū)域選擇不形成a-helix的序列；③兩端的肽段比中間的排列合理；④避免蛋白內(nèi)部重復(fù)；⑤避免同源性強的肽段；⑥序列中盡量避免Cys和Glu，不可以有太多的Pro，但有1_2個Pio利于肽鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對產(chǎn)生特異性抗體有益。此外，該多肽抗原必須含有人類白細胞二類抗原(HLA) 系統(tǒng)的限制性表位，包括HLA-DR，HLA-DP and HLA-DQ的限制性表位。這些表位可被90% 以上華人群體的HLA 二類抗原系統(tǒng)所識別。基于以上抗原設(shè)計原則及CD25蛋白的生物學(xué)特性，本發(fā)明利用生物信息學(xué)和多個表位預(yù)測模擬軟件，分析與抗原性相關(guān)的參數(shù)，設(shè)計了的線性氨基酸序列(見Tab. I)。加框部分是多肽片段在蛋白質(zhì)中的位置。CD25 interleukin-2 receptor subunit alpha precursor[Homo sapiens]I mdsyllmwglltfimvpgcqaelcdddppeiphatfkamaykegtmlnceckrgfrriks
權(quán)利要求
1.一種腫瘤標(biāo)志物CD25自身抗體，其特征在于氨基酸序列為 EIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVE 純度> 95 %，pH > 7. O。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的腫瘤標(biāo)志物CD25自身抗體在制備預(yù)測腫瘤早期診斷試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
一種腫瘤標(biāo)志物CD25自身抗體及應(yīng)用，屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供了一種免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)基因CD25的抗原氨基酸序列。應(yīng)用CD25多肽抗原檢測肺癌和食管癌患者血中相應(yīng)的特異性自身抗體，這種自身抗體可作為為腫瘤標(biāo)志物評估肺癌和食管癌發(fā)生的危險度。這種抗原多肽及其抗體可用于制備腫瘤早期診斷試劑和開發(fā)治療腫瘤的靶向藥物。
文檔編號C07K16/28GK102585000SQ20121004117
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月22日
發(fā)明者關(guān)松磊, 劉寶剛, 孫世龍, 尉軍, 李光輝 申請人:尉軍