專利名稱：血清丙型肝炎抗原(HCV Ag)定量ELISA檢測技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
體外生物醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)(定量ELISA技術(shù))二、背景技術(shù)ELISA集中了抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶促反應(yīng)的放大作用，理想的底物顯示信號使其結(jié)果的判讀更為客觀、簡單和快捷。本研究克隆、表達(dá)、純化了HCV C、NS3、NS5抗原，免疫BALB/c小鼠，制備三種相應(yīng)的單克隆抗體(McAb)，作為包被抗體及酶標(biāo)抗體，用供血者血清、健康人群血清、HCV感染患者血清、其它肝炎或自身免疫患者血清、我國SDA HCV標(biāo)準(zhǔn)品、市售的其它公司的HCV標(biāo)準(zhǔn)品等檢測了該試劑盒的特異性、敏感性及重復(fù)性，研制出符合國家標(biāo)準(zhǔn)的HCV Ag定量檢測試劑盒，并以國際上公認(rèn)的HCV RNA NASBA定量檢測試劑盒作為對照，確定HCV Ag檢測的最低濃度、HCV Ag定量與HCVRNA拷貝數(shù)間的關(guān)系，為HCV病情程度判斷、療效評價(jià)提供一個(gè)簡便、價(jià)廉的檢測手段。其關(guān)鍵技術(shù)為獲得高度特異性、高親和力的抗-HCVMcAb，用三種不同的McAb作為包被抗體及酶標(biāo)抗體，確定最佳的ELISA工作條件，制備了高特異度、高敏感度、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確的HCV Ag檢測試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
該技術(shù)選用抗-HCV C、NS3、NS5抗原McAb作為包被及酶標(biāo)抗體，檢測了各種HCV標(biāo)準(zhǔn)血清及臨床血清，結(jié)果該試劑盒的特異性及敏感性為99.5％，重復(fù)性CV值＜10％，HCV Ag檢測的最低含量為0.3pg/ml、1pg HCV Ag對應(yīng)1800拷貝的HCV RNA。
具體實(shí)施例方式
HCV Ag ELISA定量檢測的主要技術(shù)方案1.包被各取等量的純化抗-HCV C、NS3、NS5 McAb混合后，用包被液(0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH 9.6)稀釋后，按1.0μg抗體/100μl/孔包被酶標(biāo)板，4℃包被12h。
2.封閉用3％BSA+0.05％Tween-20封閉14h。
3.加待測血清待測血清100μl(各種HCV血清標(biāo)準(zhǔn)品、HCV感染不同階段的血清、其它肝炎及自身免疫疾病血清、治療前后的系列血清等)用50μl裂解液預(yù)處理后，取100μl加入酶標(biāo)孔，37℃1h。用已知濃度的HCV抗原倍比稀釋(用正常人血清稀釋)后作為陽性對照(最低稀釋至0.1pg/ml)，以確定最低的檢測濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所有血清同時(shí)用抗-HCV EIA3進(jìn)行抗-HCV抗體的檢測。為確定HCV Ag水平與HCV RNA滴度間的關(guān)系，采用了NASBA定量檢測試劑盒作為對照同時(shí)進(jìn)行HCV RNA的定量，同時(shí)繪制HCV Ag吸光度值(A值)與HCV RNA拷貝數(shù)間(IU/ml)的對數(shù)曲線。
4.加酶標(biāo)抗體抗-C、NS3、NS5 McAb用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記，作為酶標(biāo)二抗，100μl/孔，37℃1h。具體標(biāo)記方法參照Wilson和Nakane的過碘酸鈉氧化法42mg HRP溶于10.5ml ddH2O(濃度為4mg/ml)，取2.1ml 0.1mol/L NaIO4加入HRP溶液，室溫輕攪避光放置20min，4℃對1mmol/L醋酸緩沖液(pH4.4)透析過夜，加入0.21ml0.2mol/L碳酸緩沖液(pH 9.5)調(diào)HRP-醛基溶液pH至9.2，立即加入10.5ml 8mg/ml的McAb(10mol/L碳酸緩沖液稀釋，pH 9.5)，室溫?cái)嚢?h，加入1.05ml 4mg/ml NaBH4水溶液，4℃放置2h，電磁攪拌下逐滴加入等體積100％飽和硫酸銨溶液，4℃攪拌1h，靜置30min，3000r/min離心20min，50％飽和硫酸銨溶液洗滌沉淀物2次，加入10.5ml PBS溶解沉淀物，4℃對PBS透析至萘氏試劑檢測陰性，加入BSA至10mg/ml，分裝，-70℃保存。
5.加底物顯色以TMB作為底物，100μl/孔，37℃ 5min。
6.終止用2mol/L H2SO4終止顯色反應(yīng)，50μl/孔。
7.測定A450nm值在酶標(biāo)儀上測定A450nm值。
8.判定結(jié)果根據(jù)被檢血清(P)及陰性對照(N)的A450nm值，如P/N≥2.1，則確定為陽性。
9.HCV cAg標(biāo)準(zhǔn)品最低檢測濃度及最大線性范圍的確定根據(jù)陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，首先確定HCV Ag最低檢出濃度，根據(jù)HCV cAg不同濃度與吸光度值的線性關(guān)系確定檢測最大線性范圍，繪制吸光度值與HCV RNA拷貝數(shù)間的關(guān)系，確定1pg/ml HCV Ag對應(yīng)多少拷貝或IU/ml的HCV RNA。
權(quán)利要求
血清丙型肝炎抗原(HCV Ag)定量ELISA檢測技術(shù)是體外診斷生物試劑的一部分。該技術(shù)方案為選用抗-HCV C、NS3、NS5抗原McAb作為包被及酶標(biāo)抗體，檢測各種HCV標(biāo)準(zhǔn)血清及臨床血清，確定該試劑盒的特異性及敏感性為99.5％，重復(fù)性CV值＜10％，HCV Ag檢測的最低含量為0.3pg/ml、1pgHCV Ag對應(yīng)1800拷貝的HCV RNA。要求權(quán)利保護(hù)1用抗-HCV C、NS3、NS5McAb作為包被抗體及酶標(biāo)抗體制備血清HCV Ag ELISA檢測試劑盒的技術(shù)要求保護(hù)；
2其它類似用抗-HCV C、NS3、NS5McAb組合制備的血清HCVAg ELISA檢測試劑盒的方法也要求保護(hù)。
全文摘要
丙型肝炎血清抗原(HCV Ag)定量ELISA檢測技術(shù)是體外生物診斷生的一部分。該技術(shù)選用抗－HCV C、NS3、NS5抗原McAb作為包被及酶標(biāo)抗體，通過檢測各種HCV標(biāo)準(zhǔn)血清及臨床血清，確定該試劑盒的各種檢測指標(biāo)特異性99.5％、敏感性99.5％、重復(fù)性CV值＜10％、HCV Ag檢測的最低含量為0.3pg/ml、1pg HCV Ag對應(yīng)1800拷貝的HCVRNA。HCV Ag定量ELISA技術(shù)原理是雙抗體夾心法酶免疫顯色技術(shù)，先用三種HCV特異性抗體進(jìn)行包被，與HCV血清中的HCV Ag抗原特異性反應(yīng)，形成HCV Ag/Ab復(fù)合物，再與抗HCV特異性抗體反應(yīng)，通過底物顯色后來確定抗原的含量。同時(shí)用NASBA法測定血清HCV RNA的拷貝數(shù)，確定HCV Ag含量與HCV RNA的線性關(guān)系，為HCV感染的大規(guī)模篩查、早期診斷、療效判定等提供良好的技術(shù)支持。
文檔編號G01N33/535GK1502991SQ0215460
公開日2004年6月9日 申請日期2002年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月27日
發(fā)明者王虹, 王 虹 申請人:王虹, 王 虹