專利名稱：基本上純的熒光素的制作方法
專利說明基本上純的熒光素 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及包含基本上純的熒光素的組合物，制備基本上純的熒光素的方法，由該方法制備的基本上純的熒光素，測定熒光素純度的分析方法以及用于血管造影術(shù)的藥物組合物。

背景技術(shù)：
熒光素是橙紅色化合物，C20H12O5，其在堿性溶液中顯示出強熒光并且例如在醫(yī)學中用于診斷目的，在海洋學中用作示蹤劑以及用作紡織染料。
熒光素首先由德國化學家Adolf Von Baeyer于1871年從石油衍生物間苯二酚(1，3-二羥基苯)和鄰苯二甲酸酐合成的。Paul Erlich(德國細菌學家)應(yīng)用熒光染料(熒光素鈉鹽)(后來被稱為“熒光素鈉”)來示蹤眼中房水的分泌途徑。據(jù)說這是熒光染料在體內(nèi)用于研究生理學的第一個實例。
熒光素血管造影術(shù)是重要的診斷工具，它允許研究眼后部的血管病癥。這些血管是許多涉及視網(wǎng)膜的疾病的因素。血管造影術(shù)是通過將熒光素注射入患者手臂的靜脈來進行的。在很短的時間內(nèi)(即典型地從幾秒至數(shù)秒)，染料通過眼后部的血管，并且當染料在眼血管中循環(huán)時，應(yīng)用配有特別濾光鏡的照相機對染料成像。通過檢查由此產(chǎn)生的影像，可以得出關(guān)于任何循環(huán)問題的評價，例如血管滲漏、腫脹、異?；蛐卵艿取?br> 熒光素吸收藍光，在465-490nm波長處發(fā)生峰吸收和激發(fā)。熒光在520-530nm黃綠波長處發(fā)生。盡管通常稱為熒光素，但是造影術(shù)中所用的染料是熒光素鈉(可溶的熒光素二鈉鹽)。
熒光素靜脈內(nèi)注射的正常成人劑量是500mg。其典型地以5mL 10％溶液或2mL 25％溶液的劑量包裝。進入循環(huán)系統(tǒng)后，約80％的染料分子與血清蛋白結(jié)合。當用適合波長的光激發(fā)時，剩余未結(jié)合的或游離的熒光素分子發(fā)出熒光。染料通過肝代謝形成熒光素單葡糖苷酸，并且在施用后24至36小時內(nèi)最終通過尿排泄。
已經(jīng)報道了熒光素配方中的熒光素純度可能與副作用和注射耐受有關(guān)。(“Effective differences in the formulation of intravenous fluoresceinand related side effects(靜脈內(nèi)熒光素配方和相關(guān)副作用的有效差異)”，Yannuzi等人，Am.J.Ophthalmol.1974，78(2)，第217-221頁)。因此，消除造影術(shù)所用的熒光素組合物中的所有或基本上所有雜質(zhì)是本發(fā)明的主要目的。
將以下出版物可能涉及關(guān)于熒光素組合物以及制備和純化熒光素的方法的另外的信息。
德國專利No.136498(Friedrich等人)，標題為“Process for PreparingHighly Purified Fluorescein for Inj ection Purposes(制備用于注射目的的高度純化的熒光素的方法)”，描述了應(yīng)用吡啶制備熒光素的方法。
美國專利申請公布No.US2006/0106234A1(Tran-Guyon等人)，標題為“High Purity Phthalein Derivatives and Method for Preparing Same(高純度酞衍生物及其制備方法)”，描述了應(yīng)用無水溶劑制備熒光素的方法。
還參考了以下專利或公布用于進一步的背景美國專利No.5,637,733號(Sujeeth)，標題為“Synthesis of Fluorescein Compounds with ExcessResorcinol as a Solvent(用過量間苯二酚作為溶劑合成熒光素化合物)”，以及美國專利No.1,965,842(Kranz)，標題為“Production ofHydroxybenzene-Phthaleins(羥基苯-酞類的制備)”。
高度純化的熒光素對于制備用于注射目的的溶液是必需的。所用的純化的熒光素理論上應(yīng)當是(i)無雜質(zhì)，所述的雜質(zhì)可能是有毒的和/或缺乏熒光的；(ii)低鹽，所述的鹽可能引起可注射的熒光素產(chǎn)品不可接受的高重量克分子滲透濃度或高張力；并且(iii)顏色淺。某些雜質(zhì)帶有很強的顏色。因此，在特別的頻率處沒有顏色可以表明此類雜質(zhì)不存在。因此，熒光素組合物的顏色分布被認為是重要的質(zhì)量屬性和純度的可視標志。
需要鑒定并且定量熒光素組合物中可能存在的非常低水平的雜質(zhì)的方法。該方法應(yīng)當能夠分離、鑒定并且定量可能存在的那些雜質(zhì)。
因此，需要的是高純度、顏色淺、氯化鈉含量低的熒光素組合物和不需要應(yīng)用吡啶或其它非水(和潛在有害的)溶劑來制備該熒光素的方法，以及用于測定該熒光素純度的方法。本發(fā)明涉及滿足該需要。
發(fā)明概述 本發(fā)明涉及包含基本上純的熒光素的組合物，制備純化的熒光素的新的并且改善的方法，以及通過這些方法制備的熒光素組合物。本發(fā)明還涉及用于血管造影術(shù)包含基本上純的熒光素的藥物組合物，以及測定熒光素組合物純度的方法。通過本發(fā)明方法制備的高度純化的熒光素比先前的熒光素組合物具有更低水平的有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)。通過這些新方法制備的熒光素還比其它已知的組合物顏色淺(在590nm處)，提供了純度的清楚可視的標志。本發(fā)明的熒光素還比其它已知的組合物氯化鈉含量低，因此更易于配制用于藥物用途。本發(fā)明的方法對其它已知的方法進行改善在純化過程中不應(yīng)用吡啶，無需應(yīng)用無水溶劑，減少了乙?；譄晒馑厮璧囊宜狒牧浚约案纳屏烁叨燃兓臒晒馑氐漠a(chǎn)量。通過提供用于分離和定量熒光素組合物中有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)的可靠方法，從而用于測定熒光素組合物的純度，本發(fā)明還促進了技術(shù)狀態(tài)。
本發(fā)明可以在多個申請中體現(xiàn)，包括(但不限于)以下概述的那些 本發(fā)明的一個實施方案涉及包含基本上純的熒光素的組合物；更特別的是，熒光素基本上無吡啶。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及基本上純的熒光素，其不包含濃度大于約0.1％重量、更優(yōu)選0.01％重量的任何有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及具有色數(shù)為約0.015至約0.050AUC的基本上純的熒光素。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及具有殘留氯化物含量小于約0.25％重量的基本上純的熒光素。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及基本上純的熒光素，其中有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)的總量小于約0.6％重量、優(yōu)選小于0.06％重量。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及制備基本上純的熒光素的方法。該方法包括水解二乙?；鶡晒馑匾孕纬蔁晒馑兀瑢晒馑赜锰刻幚?，過濾，在濾液中加入乙醇，應(yīng)用酸性溶液調(diào)節(jié)pH以形成沉淀，過濾并且洗滌。在該實施方案的一個方面中，將pH水平調(diào)節(jié)至約1.0至約2.5。在另一個方面，當調(diào)節(jié)pH水平時，將冷卻溫度維持在約20℃至約25℃，并且pH水平調(diào)節(jié)持續(xù)約2至4小時。本發(fā)明還涉及由該方法制備的基本上純的熒光素組合物。
本發(fā)明的另一個實施方案提供了HPLC方法，該方法用于定量熒光素有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)的水平。該方法包括獲得組合物的高壓液相色譜圖；確定色譜圖中相應(yīng)于有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)的峰并且進行峰面積測量以測定其相對濃度。在該實施方案的一個方面中，峰具有相對HPLC保留時間為約0.75、1.19、1.23、1.68和1.71。另一個實施方案提供了HPLC/MS方法，該方法用于確定熒光素中的有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案涉及用于血管造影術(shù)包含基本上純的熒光素的藥物組合物，更特別的是組合物，其中熒光素是基本上無吡啶的。
本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案涉及用于血管造影術(shù)包含基本上純的熒光素的藥物組合物，其中組合物不包含濃度高于約0.1％重量、更優(yōu)選0.01％重量的任何有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)。
本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案涉及用于血管造影術(shù)包含基本上純的熒光素的藥物組合物，其中組合物中存在的有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)的總量小于約0.6％重量、更優(yōu)選小于約0.06％重量。
本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案涉及用于血管造影術(shù)包含基本上純的熒光素的藥物組合物，其中熒光素具有色數(shù)為約0.015至約0.050AUC。
本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案涉及用于血管造影術(shù)的熒光素的藥物組合物，其中組合物具有殘留氯化物量小于約0.25％重量。
本發(fā)明通過以下附圖和詳述進行更全面的討論。
附圖簡述

圖1是熒光素洗滌試驗的試驗設(shè)計圖。
圖2是熒光素pH/沉淀試驗的試驗設(shè)計圖。
圖3是顯示實施例3中描述的熒光素藥物的顏色強度的UV/VIS光譜圖。
圖4是實施例5中描述的稀釋空白的HPLC色譜圖。
圖5是實施例5中描述的1％USP熒光素參考標準品的HPLC色譜圖。
圖6是實施例5中描述的供應(yīng)商A熒光素原料的HPLC色譜圖。
圖7是實施例5中描述的添加0.8％間苯二酚的熒光素原料的HPLC色譜圖。
圖8是實施例5和6中描述的熒光素的結(jié)構(gòu)圖和有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)的可能的結(jié)構(gòu)圖。
圖9是來自LC/MS系統(tǒng)的熒光素的代表性HPLC色譜圖。
圖10是(a)UV檢測的熒光素色譜圖；和(b)在13.65-14.45分鐘取樣的熒光素的HPLC峰的熱噴霧質(zhì)譜圖。
圖11是(a)應(yīng)用質(zhì)譜儀在m/z 259處的質(zhì)量選擇檢測的熒光素中雜質(zhì)A的色譜圖；和(b)在11.95-12.05分鐘取樣的雜質(zhì)A的HPLC峰的熱噴霧質(zhì)譜圖。
圖12是(a)應(yīng)用質(zhì)譜儀在m/z 285處的質(zhì)量選擇檢測的熒光素中雜質(zhì)B的色譜圖；和(b)在15.45-15.55分鐘取樣的雜質(zhì)B的HPLC峰的熱噴霧質(zhì)譜圖。
圖13是(a)應(yīng)用質(zhì)譜儀在m/z 347處的質(zhì)量選擇檢測的熒光素中雜質(zhì)C的色譜圖；和(b)在16.10-16.50分鐘取樣的雜質(zhì)C的HPLC峰的熱噴霧質(zhì)譜圖。
圖14是(a)應(yīng)用質(zhì)譜儀在m/z 347處的質(zhì)量選擇檢測的熒光素中雜質(zhì)D的色譜圖；和(b)在18.20-18.65分鐘取樣的雜質(zhì)D的HPLC峰的熱噴霧質(zhì)譜圖。
圖15是(a)應(yīng)用質(zhì)譜儀在m/z 333處的質(zhì)量選擇檢測的熒光素中雜質(zhì)E的色譜圖；(b)在13.23-13.52分鐘取樣的雜質(zhì)E的HPLC峰的APCI質(zhì)譜圖；(c)通過220-500nm的總吸收掃描檢測的熒光素中雜質(zhì)E的色譜圖；和(d)雜質(zhì)E峰的UV-Vis光譜圖。
圖16是(a)應(yīng)用質(zhì)譜儀在m/z 425處的質(zhì)量選擇檢測的熒光素中雜質(zhì)F的色譜圖；(b)在19.10-19.32分鐘取樣的雜質(zhì)F的HPLC峰的APCI質(zhì)譜圖；(c)通過220-500nm的總吸收掃描檢測的熒光素中雜質(zhì)F的色譜圖；和(d)雜質(zhì)F峰的UV-Vis光譜圖。
圖17是(a)應(yīng)用質(zhì)譜儀在m/z 375處的質(zhì)量選擇檢測的熒光素中雜質(zhì)G的色譜圖；(b)在21.27-21.54分鐘取樣的雜質(zhì)G的HPLC峰的APCI質(zhì)譜圖；(c)通過220-500nm的總吸收掃描檢測的熒光素中雜質(zhì)G的色譜圖；和(d)雜質(zhì)G峰的UV-Vis光譜圖。
圖18是(a)在51.75-51.85分鐘取樣的雜質(zhì)H-1的HPLC峰的APCI質(zhì)譜圖；(b)通過220-500nm的總吸收掃描檢測的熒光素中雜質(zhì)H-1的色譜圖。
圖19是(a)在52.67-52.79分鐘取樣的雜質(zhì)H-2的HPLC峰的APCI質(zhì)譜圖；(b)通過220-500nm的總吸收掃描檢測的熒光素中雜質(zhì)H-2的色譜圖。
圖20是雜質(zhì)H-2的UV-Vis吸收掃描。
發(fā)明詳述 除非另外說明，本文所用的以下縮略語和術(shù)語應(yīng)當理解為具有以下含義 縮略語“APCI”表示大氣壓化學電離。
縮略語“M/S”或“MS”表示質(zhì)譜。
縮略語“HPLC”表示高效液相色譜。
縮略語“UV-Vis”表示紫外-可見。
縮略語“LC/MS”表示液相色譜/質(zhì)譜。
術(shù)語“炭”包括有效降低色數(shù)的活性炭試劑。示例性試劑包括但不限于

SA Plus和

SX Ultra，從供應(yīng)商Univar USA，Dallas，Texas可商購獲得。能夠降低色數(shù)的炭形式可以通過常規(guī)試驗來確定。(已經(jīng)確定例如另一種可商購獲得的炭形式?jīng)]有有效降低色數(shù)，即

KB。) 術(shù)語“色數(shù)”是指在590nm處測量時，在pH9.4的氫氧化鈉和碳酸氫鈉水溶液中制備的1.0％的熒光素原料溶液的吸收。
術(shù)語“熒光素藥物”和“熒光素原料”在本文可互換應(yīng)用。
術(shù)語“有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)”包括熒光素的合成的雜質(zhì)、異構(gòu)體、氧化產(chǎn)物、二聚化產(chǎn)物和分解產(chǎn)物和/或熒光素反應(yīng)物。該有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)的示例性結(jié)構(gòu)如圖8中所示。
術(shù)語“基本上無吡啶”表示熒光素組合物至少99％無吡啶。更優(yōu)選的是分析純至少99.9％；甚至進一步優(yōu)選的是熒光素組合物完全無吡啶。
術(shù)語“基本上純的熒光素”指的是總體不存在或接近總體不存在雜質(zhì)、例如有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)。例如，當熒光素組合物被稱為是基本上純的時，其中或者沒有可檢測到的有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)，或者如果檢測到單個有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)，那么它是以不大于0.1％重量的量存在，或者如果檢測到多個有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)，那么它們是以合計不大于0。6％重量的量存在。
本發(fā)明的方法制備低有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)分布的熒光素產(chǎn)物。通常已知即使純化的熒光素物質(zhì)也可能包含低水平的某些雜質(zhì)，例如間苯二酚和2-(2’，4’-二羥基苯甲酰基)苯甲酸。但是，先前沒有認識到熒光素商購樣品可能包含除間苯二酚和2-(2’，4’-二羥基苯甲?；?苯甲酸之外的許多雜質(zhì)。通過本發(fā)明的方法基本上降低了這些潛在的雜質(zhì)的量。此類雜質(zhì)在本文統(tǒng)稱為“有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)”。
進行試驗，通過LC/MS測定這些有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)的分子量，并且盡管無需結(jié)合理論，但是本文的這些雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)是可能的(參見圖8)。以下發(fā)現(xiàn)并且詳述了用于分辨和定量甚至在純化的熒光素組合物中可能存在的低水平有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)的方法。本文發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的方法提供了高度純化的熒光素，其具有基本上降低的水平的有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)。這一點可以在本發(fā)明的純化的熒光素藥物的雜質(zhì)分布中觀察到，如下表1所示，相比于來自多個廠商的技術(shù)級熒光素的雜質(zhì)分布，如下表2所示，以及來自多個廠商的熒光素藥物的雜質(zhì)分布，如下表3至5所示。







本發(fā)明涉及的通用方法的示意圖說明如下。將商品級熒光素通過與乙酸酐在回流溫度下反應(yīng)來二乙?；?。將所產(chǎn)生的二乙?；臒晒馑胤蛛x，然后與堿反應(yīng)，產(chǎn)生脫乙?；臒晒馑?，然后將其用炭處理，產(chǎn)生顏色淺、高純度和氯化物含量低的熒光素。反應(yīng)流程圖說明如下
制備本發(fā)明純的熒光素所用的特別溶劑、反應(yīng)時間和溫度以及pH值已經(jīng)基于一系列試驗確定。這些試驗的目的是獲得高純度、顏色淺和鹽含量低的藥物級熒光素，以及避免應(yīng)用在現(xiàn)有已知方法中所用的有害溶劑，即吡啶。另外的目的是通過例如應(yīng)用最少量的溶劑或降低必需步驟的反應(yīng)循環(huán)時間使得本方法中涉及的花費和時間最小化。
純化熒光素的方法開始于將熒光素轉(zhuǎn)化為O，O’-二乙?；鶡晒馑亍τ谠撃康?，將乙酸酐用作溶劑和試劑，完全避免應(yīng)用吡啶，一種在現(xiàn)有技術(shù)方法中所用的有害溶劑。因此，將熒光素和乙酸酐的混合物在回流下攪拌數(shù)小時，并且將產(chǎn)生的懸浮液冷卻。進一步冷卻至冰點或剛低于產(chǎn)生完全結(jié)晶。收集結(jié)晶物質(zhì)并且先用冷的乙酸酐洗滌，然后用冷的丙酮洗滌。然后將物質(zhì)再懸浮于丙酮中，同時攪拌并且溫和加熱。冷卻后，收集白色結(jié)晶物質(zhì)，用冷的丙酮洗滌并且空氣干燥，得到高純度的O，O’-二乙?；鶡晒馑?。
然后，將O，O’-二乙?；鶡晒馑啬孓D(zhuǎn)化為熒光素，同時形成鈉鹽并且除去最終的雜質(zhì)。為了完成該轉(zhuǎn)化，應(yīng)用苛性溶液將O，O’-二乙?；鶡晒馑氐囊阴；狻Ｒ虼?，將O，O’-二乙?；鶡晒馑睾图状佳b入適合的容器中，加入制備的氫氧化鈉的去離子水溶液，并且將混合物加熱至回流，同時攪拌。然后將混合物冷卻，應(yīng)用助濾劑過濾，然后用甲醇洗滌。然后通過真空蒸餾減少濾液的體積，加入水，并且將反應(yīng)混合物冷卻。然后將反應(yīng)混合物的pH調(diào)節(jié)至8.5至8.7之間。加入適合的炭、例如

SXUltra，同時攪拌1小時。如果需要，重復加入炭的步驟。接下去是關(guān)鍵的沉淀步驟。首先，在濾液中加入乙醇，從而獲得2∶1比例的乙醇-水。該比例是基于意外的發(fā)現(xiàn)，在沉淀過程中有機溶劑與水的比例越高，產(chǎn)生的熒光素產(chǎn)物中氯化物含量越低。為了明確該作用所進行的試驗在下面進一步描述。然后，為了酸化熒光素，加入稀釋的鹽酸溶液，以便確定校準的pH范圍。該范圍是基于意外的發(fā)現(xiàn)，pH越低，提供更需要的顏色的產(chǎn)物。更特別的是，通過試驗確定，濾液最適的pH范圍應(yīng)當在1.0至2.5之間，并且酸化應(yīng)當緩慢進行，例如歷經(jīng)2至4小時進行，從而避免產(chǎn)物的聚集，并且冷卻。進一步攪拌并且冷卻后，將熒光素通過過濾分離。將產(chǎn)物用水和乙醇的溶液洗滌，并且干燥產(chǎn)物，獲得80-90％產(chǎn)率的非常高質(zhì)量熒光素。該高純度的熒光素可以用于制備注射用的熒光素。對于該目的，應(yīng)用氫氧化鈉將熒光素轉(zhuǎn)化為可溶的二鈉鹽形式，并且裝入安瓿中用于隨后的滅菌。
為了完成本發(fā)明方法所進行的試驗的一個實例是校準pH范圍，在該pH范圍內(nèi)熒光素產(chǎn)物沉淀。部分基于對形成的產(chǎn)物的顏色譜的經(jīng)驗觀察將該pH范圍從更高調(diào)節(jié)至更低范圍。因此，確定了最佳的pH范圍是約pH1.0至約pH 2.5，在該pH范圍內(nèi)熒光素產(chǎn)物應(yīng)當沉淀，以便實現(xiàn)顏色淺產(chǎn)物的目的。
還意外發(fā)現(xiàn)，在沉淀過程中，有機溶劑與水性溶劑的比例越高，產(chǎn)生的熒光素產(chǎn)物中的氯化物含量越低。該結(jié)果不是預期的，因為預期的是低的有機物/水性物比例對于降低氯化鈉水平是必需的。更高比例的有機溶劑的應(yīng)用對改善過濾速率具有額外的益處，從而減少了處理物質(zhì)所需的時間。
進行進一步的沉淀試驗以開發(fā)本發(fā)明的方法并且描述如下，并且在圖1和2中顯示。特別的是，進行試驗以通過改變沉淀方法來降低氯化物水平，如下表6所示。
表6沉淀試驗 ＊水∶乙醇，3∶1，2×1體積洗滌 表6顯示了沉淀介質(zhì)的溶劑比的改變影響存在的氯化物的量。特別的是，增加沉淀介質(zhì)中乙醇與水的比例產(chǎn)生更低的氯化物含量。試驗A顯示當水∶乙醇(1∶1)沉淀介質(zhì)的體積由10體積(參考)增加至15體積(參見表6)時，氯化物含量微小降低。試驗B將來自水∶乙醇(1∶1，10體積，參考)的沉淀與來自水∶乙醇(2∶1，15體積)的沉淀進行了比較。試驗結(jié)果與直覺相反，因為具有更低水含量和更小體積的參考反應(yīng)產(chǎn)生更低的氯化物含量。
試驗C將來自水∶乙醇(1∶1，10體積，參考)的沉淀與來自水∶乙醇(1∶2，15體積)的沉淀進行了比較。試驗C的結(jié)果顯示更高有機物含量的沉淀介質(zhì)產(chǎn)生更低的氯化物含量。
沉淀介質(zhì)中更高有機物含量產(chǎn)生更低的氯化物含量的趨勢在試驗D、E、F和G以及試驗H、I、J和K(對于未洗滌和洗滌的產(chǎn)物)中得到了重現(xiàn)。盡管結(jié)果顯示與直覺相反，但是相信(沒有結(jié)合理論)更高的有機物含量允許更快和更有效的洗滌產(chǎn)物塊。
所考慮的另一方面是熒光素顏色是否取決于沉淀介質(zhì)的pH；參見下表7，其中應(yīng)用2∶1比例的乙醇∶水的沉淀介質(zhì)。
表7 作為pH函數(shù)的熒光素顏色 [乙醇∶水(2∶1)的沉淀介質(zhì)] 結(jié)果表明熒光素顏色對pH變化是敏感的。例如，在pH約3.0時，產(chǎn)物的外觀開始呈現(xiàn)栗色，其被認為是不希望的。
提供以下實施例1-8以進一步說明本發(fā)明的某些實施方案。由實施例5、6、7和/或8獲得的代表性數(shù)據(jù)如圖9至19所示。
圖9-14的數(shù)據(jù)是由LC/MS獲得的，應(yīng)用熱噴霧質(zhì)譜與HPLC連接。峰是通過應(yīng)用UV檢測器(280nm)和熱噴霧質(zhì)譜來觀察的。試驗條件儀器＝Vestec Model 201B熱噴霧質(zhì)譜，連接Waters Model 600 MS HPLC系統(tǒng)和Waters Model 486MS UV檢測器(280nm)；柱＝Waters SymmetryC-8，5μm，3.9×150mm；流動相＝歷經(jīng)25分鐘由0％B至100％B程序化的線性梯度；流動相A＝在10∶90 V∶V甲醇∶水中的0.1M乙酸銨；流動相B＝在甲醇中的0.1M乙酸銨；流速＝1.0mL/分鐘；樣品濃度＝純的；以及進樣體積＝20μL。
圖15-20的數(shù)據(jù)是由LC/MS獲得的，應(yīng)用質(zhì)譜與HPLC連接。該質(zhì)譜是應(yīng)用大氣壓化學電離(APCI)接口，并且質(zhì)譜是在正離子檢測模式下運行的。峰是通過應(yīng)用監(jiān)測220-500nm總吸收的UV-Vis檢測器和質(zhì)譜來觀察的。應(yīng)用Waters Symmetry C-8柱(3.9×150mm)，流速0.6mL/分鐘，并且設(shè)定程序為歷經(jīng)30分鐘由0％流動相B至100％流動相B。流動相B是在甲醇中的0.01M乙酸銨，并且流動相A是在10∶90/甲醇∶水中的0.01M乙酸銨。
實施例1 熒光素二乙酸酯的形成
在5升3頸圓底燒瓶中加入熒光素(1000g，3.01mol)和乙酸酐(1622g，15.9mol)。將產(chǎn)生的混合物在回流下攪拌3-5小時并且將產(chǎn)生的懸浮液冷卻至室溫。繼續(xù)攪拌，將反應(yīng)混合物進一步冷卻至-5至3℃，以實現(xiàn)完全結(jié)晶。將結(jié)晶的物質(zhì)收集在Buchner過濾器上，用冷的乙酸酐(2×500mL)洗滌，然后用冷的丙酮(1×600mL)洗滌。將物質(zhì)部分干燥并且重新懸浮于丙酮(1000mL)中，同時攪拌并且溫和加熱。一旦冷卻，將白色結(jié)晶物質(zhì)收集在過濾器上，用冷的丙酮(2×700mL)洗滌并且空氣干燥。產(chǎn)率～75％-85％；TLC顯示單點；MP＝203-205.5℃；并且純度99.7％。
實施例2 由二乙?；鶡晒馑匦纬蔁晒馑?，鈉鹽的形成以及除去最終的雜質(zhì)
將O，O’-二乙?；鶡晒馑?1000g)和甲醇(4000mL)裝入適合的反應(yīng)器中。單獨地，在去離子水(620mL)中制備氫氧化鈉溶液(480g，50％苛性)。將氫氧化鈉溶液裝入包含O，O’-二乙?；鶡晒馑睾图状嫉姆磻?yīng)器中。將混合物加熱至回流并且在回流下攪拌90分鐘。將反應(yīng)混合物冷卻至20℃至25℃之間。應(yīng)用助濾劑(100g)將混合物過濾，然后用甲醇(500mL)洗滌。將濾液(5000mL)在真空下蒸餾至殘留體積在1400mL至1700mL之間，然后將反應(yīng)混合物冷卻至20℃至25℃之間。將去離子水(5000mL)加入至蒸餾濃縮物中。單獨地，在去離子水(72g)中制備氫氧化鈉溶液(56g，50％苛性)。將新鮮制備的氫氧化鈉溶液(100mL)用于調(diào)節(jié)反應(yīng)的pH至8.5至8.7之間。在室溫下，將Norit SX Ultra(100g)、助濾劑(100g)和去離子水(500mL)加入至反應(yīng)中，然后將混合物攪拌1小時。將此批過濾并且在室溫下將另外的Norit SX Ultra(100g)和去離子水(500mL)加入至濾液中，然后將混合物攪拌1小時。將此批過濾并且用去離子水(2000mL)洗滌。將乙醇(10000mL)加入至濾液中。單獨地，通過將鹽酸(32％，820g)溶于去離子水(320mL)中制備鹽酸溶液。將稀釋的酸溶液用于調(diào)節(jié)濾液的pH至1.0至2.5之間，同時將此批的溫度維持在20℃至25℃之間。將此批在20℃至25℃之間攪拌1小時，然后通過過濾分離。將濾餅用(注射用水∶乙醇)(3∶1)溶液(2×1000mL)洗滌。將產(chǎn)物干燥，得到典型地為80-90％產(chǎn)率的非常高質(zhì)量的熒光素。
實施例3 熒光素藥物顏色強度 儀器 能夠接受1cm比色杯和從660nm掃描至570nm的分光光度計。
適合波長從660nm至570nm的物質(zhì)、例如石英的分光光度計比色杯(1cm光程長)。
熒光素藥物的顏色強度如以下描述的測定。該方法用于確定在pH9.4的氫氧化鈉和碳酸氫鈉水溶液中制備的1.0％的熒光素原料溶液的顏色，通過測量其在590nm處的吸收而實現(xiàn)。該數(shù)值還可以稱為“色數(shù)”。在590nm處測量吸收的增加相應(yīng)于完成的藥物產(chǎn)品可見的顏色強度的增加。
將熒光素(250mg±5mg，精確稱量)和碳酸氫鈉(50mg)稱重放入25mL燒杯中。加入氫氧化鈉(5mL，1％)。將溶液在攪拌下溫和溫熱。加入氫氧化鈉(1％，至多另外1mL，合計6.0mL)直至所有的物質(zhì)溶解并且溶液澄清。將反應(yīng)冷卻至室溫。將pH調(diào)節(jié)至pH9.4，如果需要，滴加1％氫氧化鈉。如果pH高于9.4，將溶液棄去并且應(yīng)用更少的氫氧化鈉重新制備。將溶液定量地轉(zhuǎn)移至容量瓶(25mL)中并且用純水QS至25.0mL。終濃度為10mg/mL或1％。
方法 將分光光度計調(diào)零，通過用樣品和參考比色杯中的純水建立空白用戶基線，以100nm/分鐘的速率從660nm掃描至570nm而實現(xiàn)。將熒光素溶液(1％)加入至樣品比色杯中。將樣品溶液以100nm/分鐘的速率從660nm掃描至570nm。吸收讀數(shù)在590nm處記錄。一式兩份的測量在分開的等份樣品上進行。表1列出了應(yīng)用該方法試驗的數(shù)個熒光素原料樣品的典型的色數(shù)結(jié)果。該結(jié)果應(yīng)用以下部分所示的等式校正。圖3顯示了由熒光素原料樣品獲得的典型的光譜。
計算 對于樣品濃度將吸收讀數(shù)進行如下校正
樣品熒光素批次的顏色強度測量是如實施例2中描述的那樣獲得的，并且在下表8中列出。
表8
實施例4 應(yīng)用電位滴定法測量熒光素殘留氯化物 儀器 Brinkman 716 DMS Titrino自動滴定儀或同等物 Brinkman 730樣品轉(zhuǎn)換器和759擺動頭(Swing Head)自動進樣器或同等物 Ag滴定電極 5-位分析天平或同等物 超聲儀 加熱板 能夠3,000rpm的離心機 培養(yǎng)管，16×125mm，VWR Cat#47729-578或同等物 16mm培養(yǎng)管的白色蓋子，VWR Cat#60828-760或同等物 血清過濾器，6×16mm，VWR Cat#28295-556或同等物 以下方法用于定量熒光素中殘留的氯化物的量，應(yīng)用電位硝酸銀滴定液、自動滴定儀和銀電極。
(1)試劑溶液的制備，氫氧化銨(5N) 在純水(～600mL)中加入濃氫氧化銨(～338mL)并且用純水稀釋至1000mL。將該溶液用于自動滴定儀沖洗和儲存銀電極。
(2)標準化的溶液制備，硝酸銀，0.10N，水溶液 優(yōu)選應(yīng)用具有分析證書的商購的制備的0.10N硝酸銀溶液。但是，如果無法獲得商業(yè)證明的硝酸銀溶液，那么可以將硝酸銀(17.0g)稱重并且溶于純水(1000mL)中并且標準化。將氯化鉀參考標準品(干燥的，50mg)稱重并且溶于滴定杯中的純水(～30mL)中。將硝酸(1mL)加入至該溶液中。將溶液應(yīng)用銀棒電極進行電位滴定。每mL的0.10N硝酸銀相當于7.455mg的氯化鉀。應(yīng)用以下等式計算硝酸銀的當量濃度N AgNO3＝(mg KCl×純度KCl)/(mL AgNO3×74.55)。
(3)樣品制備和滴定 將熒光素原料(2g)稱重至培養(yǎng)管(16×125mm)中。加入純水(熱的，10mL)。加入硝酸(1mL)并且將所有試管蓋好，振搖2分鐘并且超聲15分鐘。將所有試管離心30分鐘(～3,000rpm)。應(yīng)用血清過濾器將沉淀物從上清液中分離。將溶液倒入滴定杯中。用純水(5mL一份)將血清沖洗并且過濾。將沖洗液倒入滴定杯中。將血清過濾器移走并且丟棄。將上述方法重復第二次，除了將所有試管蓋好并且振搖1分鐘，并且將所有試管離心20分鐘(～3,000rpm)。將第一次和第二次提取物的溶液合并并且將血清過濾器用純水沖洗。將合并的溶液用0.10N AgNO3滴定至其電位終點。滴定參數(shù)包括每個樣品之后應(yīng)用洗滌循環(huán)(5N氫氧化銨)和沖洗循環(huán)(5N氫氧化銨)。參數(shù)清單如下所示。
(4)計算
V＝0.10N AgNO3滴定的體積 N＝AgNO3滴定液的當量濃度 35.453＝氯化物的分子量 W＝所取的熒光素樣品的重量 表9
實施例5 在該方法中，在甲醇中制備熒光素原料溶液并且應(yīng)用高效液相色譜(HPLC)系統(tǒng)、梯度流動相程序和C-18柱與其有關(guān)物質(zhì)分離。有關(guān)物質(zhì)是對熒光素參考標準品的1％溶液定量的。將紫外HPLC檢測器用于測量280nm處波長處的峰響應(yīng)。流動相A是0.01M乙酸銨、10％甲醇/90％水和0.5％乙酸。流動相B是0.01M乙酸銨、100％甲醇、0.5％乙酸。參考標準品是0.5mg/mL熒光素的甲醇溶液，在甲醇中稀釋至終濃度為0.005mg/mL，或者類似制備的1％的樣品，最終理論濃度為0.5mg/mL的熒光素。應(yīng)用能夠程序化梯度操作的高效液相色譜系統(tǒng)，具有HPLC UV/VIS檢測器并且監(jiān)測280nm的能力。柱3.9×150mm Waters Symmetry C-18柱，5μm(或同等物)，對于熒光素能夠至少20,000塔板/柱。流速0.6mL/分鐘。梯度程度如下 時間(分鐘)％流動相A％流動相B 0 80％ 20％ 6020％ 80％ 柱洗滌 61 0％100％ 66 0％100％ 平衡 67 80％ 20％ 應(yīng)用峰面積，計算等于或大于0.025％的已知和未知雜質(zhì)的百分數(shù)濃度，如以下計算部分所示。盡管該方法的定量限是0.025％，但是雜質(zhì)通常是以濃度≥0.05％報道的。在熒光素的分析中發(fā)現(xiàn)9種雜質(zhì)并且它們的分子量是通過LC/MS確定的。它們可能的結(jié)構(gòu)在圖8中呈現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)H為兩個非對映異構(gòu)體，H-1和H-2。應(yīng)用該色譜方法，在該方法中所引用的熒光素批次中鑒定的雜質(zhì)的典型的相對保留時間(RRT)、容量因子(k’)和洗脫時間的梯度組成(％B)如下 RRT k’ B(％) 雜質(zhì)A 0.7511.143.0 雜質(zhì)D 1.1918.256.5 雜質(zhì)F 1.2318.857.7 雜質(zhì)H-1 1.6826.071.0 雜質(zhì)H-2 1.7126.572.0 如果峰的相對保留時間、容量因子和近似的流動相組成相應(yīng)于上述有關(guān)物質(zhì)，那么熒光素色譜圖中的峰可以鑒定為有關(guān)物質(zhì)A、D、F、H-1或H-2。但是，色譜系統(tǒng)間每個相對保留時間值可以變化約0.02。色譜系統(tǒng)的修改也可以影響上述值。盡管雜質(zhì)B、C、E和G沒有在本分析的四個熒光素批次中鑒定出來，但是供應(yīng)商A熒光素的在先LC/MS分析表明雜質(zhì)B、C、E和G具有約1.09、1.11、1.20和1.44的RRT’s。RRT’s分別為1.10和1.74的兩個未知雜質(zhì)存在于本申請報道的四批熒光素原料中。它們的濃度在0.025％至0.05％之間。在RRT＝1.10處的未知峰可能是雜質(zhì)B或C。熒光素原料樣品的色譜圖如圖6所示。在熒光素藥物中觀察到了二乙?；鶡晒馑夭⑶页霈F(xiàn)在相對于熒光素的1.35的保留時間處。
間苯二酚是熒光素的已知常見雜質(zhì)。間苯二酚在熒光素的合成中用作原料并且是潛在的降解產(chǎn)物。如以上呈現(xiàn)的，發(fā)現(xiàn)間苯二酚在RRT為0.14、k’為2.9并且％B為24.6處洗脫。偶爾可以發(fā)現(xiàn)間苯二酚作為未分離的雙峰洗脫。包含間苯二酚的熒光素藥物的色譜圖如圖7所示。
鑒定任何非相關(guān)的峰(即溶劑前沿、系統(tǒng)峰)加上間苯二酚并且從以下計算中省略。間苯二酚在RRT為約0.14處洗脫(參見圖7)。計算每個有關(guān)物質(zhì)的百分數(shù)濃度，如下所示。

％總的有關(guān)物質(zhì)＝∑(單個雜質(zhì)≥0.025％) 通過將濃度為0.025％或更高的雜質(zhì)相加來計算總的雜質(zhì)。
依照下式計算相對保留 ti＝雜質(zhì)峰的保留時間 tf＝熒光素峰的保留時間 確定該方法的定量限為0.127μg/mL的熒光素(0.025％的樣品制劑濃度)。確定檢測限為0.05μg/mL的熒光素(0.01％的樣品制劑濃度)。
應(yīng)用該方法分析四批供應(yīng)商A熒光素原料。檢測出七種雜質(zhì)并且鑒定出五種雜質(zhì)(A、D、F、H-1和H-2)?？蓤蟾娴碾s質(zhì)(≥0.025％)的總百分數(shù)范圍為0.2％至0.7％之間。結(jié)果列于下表10。
在該方法的可選擇的方法中，將樣品和標準品制劑的稀釋液變成允許同時分析間苯二酚和其它有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)。為了制備稀釋液，首先將0.77g乙酸銨溶于1000mL水中，用乙酸將pH調(diào)節(jié)至3.9，然后加入等體積的乙酸銨緩沖液和甲醇。首先以50mg比15mL的比例將熒光素溶于甲醇中，然后如實施例5中描述的方法，將該稀釋液替代甲醇用于稀釋標準品和樣品，同樣將空白由甲醇變成稀釋液。在用稀釋液稀釋后，將熒光素標準品和樣品制劑避光。間苯二酚和鄰苯二甲酸的典型的相對保留時間(RRT)如下 RRT k’ B(％) 間苯二酚0.131.2124.2％ 鄰苯二甲酸 0.161.5324.9％ 還可以將RRF(相對響應(yīng)因子)添加到雜質(zhì)的計算中，其中RRF表示相對于熒光素的響應(yīng)。
雜質(zhì)RRF1 間苯二酚1.7 鄰苯二甲酸 2.6 雜質(zhì)A 0.43 雜質(zhì)D 1.0 雜質(zhì)F 1.0 雜質(zhì)H-1 1.0 雜質(zhì)H-2 1.0 每個有關(guān)物質(zhì)的百分數(shù)濃度可以計算如下
1雜質(zhì)D、F、H-1和H-2的相對響應(yīng)因子沒有確定。它們的相對響應(yīng)因子設(shè)定為1.0。

實施例6 進行研究以確定熒光素有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)的鑒定。分析熒光素樣品中雜質(zhì)的存在和濃度。鑒定分析是通過高效液相色譜/質(zhì)譜(LC/MS)進行的。
將由LC/MS系統(tǒng)獲得的代表性的HPLC色譜圖進行重復，如圖9所示。熒光素在色譜圖中顯示出主要峰。圖10(b)中所示的熒光素的熱噴霧質(zhì)譜圖在m/z 333處顯示出M+H分子離子，其與332的分子量一致。
圖11(b)中所示的雜質(zhì)A的熱噴霧質(zhì)譜圖在m/z 259處顯示出M+H分子離子，表示258的分子量。圖8中雜質(zhì)A([2-(2’，4’-二羥基苯甲酰基)苯甲酸])的可能的結(jié)構(gòu)先前作為熒光素制劑中的雜質(zhì)已經(jīng)報道。
圖12(b)中所示的雜質(zhì)B的熱噴霧質(zhì)譜圖在m/z 285處顯示出M+H分子離子，表明284的分子量。284的分子量可能對應(yīng)于C15H8O6、C16H12O5和C17H18O4的元素式。圖8中所示的雜質(zhì)B的可能的結(jié)構(gòu)可能來源于間苯二酚與琥珀酸的反應(yīng)(在鄰苯二甲酸用于熒光素前體中作為雜質(zhì))。
圖13(b)中所示的雜質(zhì)C的熱噴霧質(zhì)譜圖在m/z 347處顯示出M+H分子離子。這表示346的分子量，并且對應(yīng)于比熒光素增加14個質(zhì)量單位。
圖14(b)中所示的雜質(zhì)D的熱噴霧質(zhì)譜圖也在m/z 347處顯示出M+H分子離子，其可能是雜質(zhì)C的異構(gòu)體。雜質(zhì)C和D的可能的結(jié)構(gòu)彼此是互變異構(gòu)體，它們都是熒光素的奎寧型氧化產(chǎn)物。
圖15(b)中所示的雜質(zhì)E的APCI在m/z 333處顯示出M+H分子離子，表明332的分子量，以及UVmax在492nm處的UV光譜。因此，這表示雜質(zhì)E可能是熒光素的位置異構(gòu)體。
圖16(b)中所示的雜質(zhì)F的APCI在m/z 425處顯示出M+H分子離子，表明424的分子量，以及UVmax大于400nm。該光譜顯示出與將另外的間苯二酚分子加入至母體化合物中一致。因此，化合物F可能由三個間苯二酚形成，而母體可能由兩個間苯二酚形成。
圖17(b)中所示的雜質(zhì)G的APCI在m/z 375處顯示出M+H分子離子，表明374的分子量，以及UVmax在484nm處。光譜和親脂性顯示出與熒光素的乙酸酯一致。
圖18(a)和19(a)中所示的雜質(zhì)H-1和H-2的APCI在m/z 739處顯示出兩個化合物的M+H分子離子，表明每個分子量為738。兩個化合物的UV-Vis吸收光譜是相同的，UVmax在233nm處，并且更弱的吸收最大值在462和488nm處。雜質(zhì)H-2的吸收光譜如圖20所示。
實施例7 注射用熒光素或25％的熒光素鈉(Fluorescite)的制備 在60％的所需的注射用水的配料罐中，溶解并且稱量所需量的氫氧化鈉。加入并且溶解熒光素。如果溶解所需，加入另外的注射用水，但是體積不超過總體積的90％。攪拌30分鐘后，如果熒光素沒有完全溶解，進行下一步，調(diào)節(jié)pH。將pH調(diào)節(jié)至9.4，其用3N氫氧化鈉和/或1N鹽酸完成。將混合物在180 R.P.M.下攪拌30分鐘。重新檢查pH。如果低于9.3或高于9.5，用3N氫氧化鈉和/或1N鹽酸重新調(diào)節(jié)至9.4。將熒光素鈉溶液用另外的注射用水定容，并且攪拌15分鐘。如上所述重新檢查pH。應(yīng)用氮氣罐，將溶液加壓過濾通過一系列具有5微米、0.8微米和0.45微米孔徑的三個膜過濾器，過濾至無菌填充罐中。應(yīng)用上述方法，重新檢查產(chǎn)物的pH。將樣品無菌取出用于試驗室試驗。將產(chǎn)物裝入先前滅菌的安瓿中。在每個安瓿中加入2.15至2.25mL。裝入后立刻將樣品通過標準方法頂封或拉封。在滅菌過程中檢查每個安瓿的封口。取決于批次大小，將安瓿在121℃下高壓滅菌20分鐘或更長。仔細檢查滲漏。在最佳的光學條件下逐個檢查每個安瓿的不溶性微粒。
實施例8 注射用熒光素或10％熒光素鈉的制備 作為制備注射用熒光素的可選擇的方法，在適合的不銹鋼罐中加入約70％-75％的批量注射用冷水(約30℃)。加入熒光素并且混合直至懸浮液完全。記錄初始pH。加入足量(總體積的約7.5％)的7N氫氧化鈉，然后加入另外量的7 N氫氧化鈉，添加間在等待約15分鐘后重新檢查pH值，直至pH在9.3-9.5之間，目標為pH9.4。如果pH高于9.5，通過加入1N鹽酸調(diào)節(jié)pH，以獲得pH范圍為9.3-9.5。在pH范圍達到后，繼續(xù)混合不少于15分鐘。將該批用注射用水調(diào)至最終重量，并且混合不少于30分鐘。測量pH并且用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)至所需的。將產(chǎn)物無菌地裝入無菌的小瓶中，根據(jù)標準操作方法進一步檢查并且試驗。
本文突出顯示的特別的實施方案不旨在是本發(fā)明所有實施方案的目錄。進一步的是，本領(lǐng)域那些技術(shù)人員將認識到或能夠確定只是應(yīng)用常規(guī)試驗，本發(fā)明實施方案的許多同等物。這些同等物旨在包括在以下權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
1.包含基本上純的熒光素的組合物。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中組合物是基本上無吡啶的。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中組合物不包含濃度大于約0.1％重量的任何有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中組合物不包含濃度大于約0.01％重量的任何有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中組合物中存在的有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)的總量小于約0.6％重量。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中組合物中存在的有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)的總量小于約0.06％重量。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中基本上純的熒光素具有約0.015至約0.050AUC的色數(shù)。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中組合物中存在的殘留氯化物的量小于約0.25％重量。
9.制備基本上純的熒光素的方法，該方法包括(a)水解二乙?；鶡晒馑匾孕纬蔁晒馑兀?b)將炭加入至熒光素的溶液中以形成熒光素/炭混合物；(c)過濾熒光素/炭混合物；(d)將乙醇加入至濾液中；(e)應(yīng)用酸性溶液調(diào)節(jié)pH以形成沉淀；(f)過濾；和(g)洗滌。
10.權(quán)利要求9的方法，其中將步驟(e)中的pH調(diào)節(jié)至約1.0至約2.5的水平。
11.權(quán)利要求9的方法，其中步驟(e)是在冷卻下進行的。
12.權(quán)利要求9的方法，其中將步驟(e)進行約2至約4小時。
13.通過權(quán)利要求9的方法制備的基本上純的熒光素。
14.確定熒光素組合物純度的方法，該方法包括(a)獲得組合物的高壓液相色譜圖；(b)鑒定色譜圖中相應(yīng)于有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)的峰；和(c)進行峰面積測量以確定其相對濃度。
15.權(quán)利要求14的方法，其中峰具有相對HPLC保留時間為約0.75、1.19、1.23、1.68和1.71。
16.用于血管造影術(shù)的藥物組合物，該藥物組合物包含基本上純的熒光素和注射用載體。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中組合物是基本上無吡啶的。
18.權(quán)利要求16的組合物，其中組合物不包含濃度大于約0.1％重量的任何有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)。
19.權(quán)利要求16的組合物，其中組合物中存在的有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)的總量小于約0.6％重量。
20.權(quán)利要求16的組合物，其中基本上純的熒光素具有約0.015至約0.050AUC的色數(shù)。
21.權(quán)利要求16的組合物，其中組合物中存在的殘留氯化物的量小于約0.25％重量。
22.包含通過權(quán)利要求9的方法制備的基本上純的熒光素的組合物。
23.包含通過二乙?；鶡晒馑氐拿撘阴；饔弥苽涞幕旧霞兊臒晒馑氐慕M合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備基本上純的熒光素的改善的方法，以及由該方法制備的基本上純的熒光素。本發(fā)明特別涉及提供用于血管造影術(shù)的藥物組合物。由本發(fā)明方法制備的基本上純的熒光素顏色淺、氯化鈉含量低并且基本上無吡啶。
文檔編號C07D493/10GK101605796SQ200780045627
公開日2009年12月16日 申請日期2007年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月11日
發(fā)明者G·彼得林斯基, G·R·哈里斯, B·S·斯科特 申請人:愛爾康研究有限公司